Evaluación morfológica de embriones bovinos 125

EVALUACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS EMBRIONES BOVINOS

Gustavo A Palma

Desarrollo embrionario

Nomenclatura

Después de su liberación, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundibulum y

dirigido al interior del oviducto a través de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fecundado o
no, es una célula de 150-190 µm de diámetro (Lindner y col. 1983), incluyendo a la zona o
membrana pelúcida, una capa acelular glicoproteica (Noden y Nahunta, 1985) de 12 a 15 µm
de espesor producida por el ovocito (Dietl, 1986) y las células foliculares. En la ampolla del
oviducto la fecundación desencadena el comienzo del desarrollo previo a la implantación del
embrión. Pocas horas después de la fusión nuclear, el cigoto comienza a dividirse. La
división nuclear es mitótica y las nuevas células se denominan blastómeros. El desarrollo del
embrión hasta los 8 días ocurre dentro de la zona pelúcida. En los primeros 6 días de
desarrollo no se manifiesta aumento de tamaño, sólo el incremento del número de
blastómeros.
La edad del embrión es establecida a partir del día del estro (d0). Al d1 le
corresponde la ovulación. De esta forma entre 24 y 36h después de la fecundación, el cigoto
de una célula se divide en 2 células ovales (d2, Fig 1), 24h más tarde (d3) el embrión cuenta
ya con 4 células. La división de los blastómeros puede cumplirse en forma asincrónica, razón
por la cual es posible observar en estadíos tempranos un número impar de células. El
intervalo entre la división más temprana y la más tardía es de alrededor de 4h (Pedersen,
1988). Hasta el estadío de 8 células (d4) el cigoto es transportado a través del oviducto. El
día 5 aproximadamente se produce el ingreso al cuerno uterino en estadío de 16 células,
momento a partir del cual es posible obtener el embrión en forma no quirúrgica y evaluarlo de
acuerdo a su estadío y calidad. Dentro del 5o día el embrión continúa su desarrollo a 32
blastómeros y su forma es similar a la de una mora, razón por la cual se lo denomina mórula
temprana (Foto 1), en la cual es posible distinguir individualmente a los blastómeros. Su
masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino.
Mórula compacta Mc, d5-6, 32-64 blastómeros aproximadamente. Sus blastómeros
están unidos y constituyen una masa compacta que ocupa sólo el 60%-70% del espacio
perivitelino (Foto 2). La compactación es considerada como uno de los signos de
diferenciación embrionaria (Pedersen, 1988), aunque los blastómeros conserven su
capacidad totipotente.
Blastocisto temprano Bt, d7 100-200 células. Se caracteriza por el comienzo del
transporte de fluido en las células trofoectodérmicas y por la formación de una cavidad
(blastocele) en el interior del embrión, dando la apariencia de un anillo de sello (Leibo, 1985).
El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino. Es posible diferenciar el trofoblasto de la masa
celular interna (Foto 3).
Blastocisto B, d7-8, 100-200 células. Existe una marcada diferenciación entre las
células del trofoblasto, que constituyen una pared -que se adosa a la zona pelúcida- y la
masa celular interna (o disco embrionario) más oscura (Foto 4).
126 Palma
Blastocisto expandido Be, d7-8, más de 200 células. El diámetro aumenta
considerablemente (1,2 a 1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la zona pelúcida a
1/3 de su espesor original (Foto 5). La presión creciente del blastocisto en crecimiento
provoca la ruptura de la zona pelúcida, a través de la cual comienza su protrusión (foto 5, 6,
y 7). Los embriones recuperados en este estadío se pueden colapsar temporalmente, esto
se caracteriza por una pérdida completa o parcial del blastocele.
Blastocisto protruido Bp, d8-9, 200-800 células. Los embriones han abandonado la
zona pelúcida. Su forma puede ser esférica, con un blastocele bien definido o colapsado. La
identificación en este estadío puede ser dificultosa para el operador inexperto (Foto 8). Los
Bp pueden ser igualmente transferidos, sin embargo, los embriones desprovistos de la zona
pelúcida son extremadamente frágiles y pegajosos, razón por la cual se acostumbra a
transferir estadíos de Mt a Be.
En condiciones naturales, el ovocito liberado y fertilizado sigue el desarrollo
mencionado anteriormente. Sin embargo, los ovocitos producidos por hembras
superovuladas, en muchos casos, no son liberados simultáneamente sino en un período de
varias horas (Lindner, 1983, ver tabla 3), Callensen y col. (1986) observaron que vacas
superovuladas comenzaban a ovular 24h después del pico de LH prolongándose la
ovulación aún 33h después del mismo. En consecuencia los ovocitos liberados no son
fertilizados en el mismo momento. También puede ocurrir que el desarrollo de los ovocitos,
fertilizados al mismo tiempo, no sea sincrónico. La consecuencia práctica de estos
fenómenos es que los embriones obtenidos de una vaca donante se encuentren en
diferentes estadíos de su desarrollo (mórulas y blastocistos). Estas diferencias pueden ser
encontradas en una donante como también entre donantes, son dependientes del tipo de
tratamiento hormonal y no son consideradas como anómalas siempre que la asincronía no
exceda los valores preestablecidos (ver Tablas 1, 2 y 3).
Las donantes difieren en su respuesta superovulatoria por factores que dependen de
sus cualidades genéticas, edad, estado fisiológico y salud reproductiva. Todos estos factores
se traducen en diferencias cuanti- y cualitativas. Las últimas son importantes de reconocer
para determinar qué embriones están en condiciones de desarrollar y concluir en un ternero
vivo, qué embriones están degenerados y cuáles presentan anormalidades que permiten
tener solo reducidas expectativas de sobrevida (Shea y col., 1976).

Tabla 1. Cronograma normal del desarrollo de los embriones d6-9 después de un

tratamiento superovulatorio con PMSG (eCG), Kauffold y col. (1985)

Estadíos de desarrollo
Tipo de Desarrollo d6 d7 d8 d9
Normal Mt Mc B Bp
Bt Be
B B
Be
Ligeramente retardado (24h) 16 Mt Mc B
blastómeros
Bt Be
Retardado (48h) 8 blastómeros 16 Mt Bt
blastómeros
Evaluación morfológica de embriones bovinos 127

Fig 1.
Desarrollo y tránsito embrionario en el tracto genital

Evaluación morfológica

Criterios

La evaluación morfológica de un embrión considera los siguientes criterios sobre las

estructuras y cualidades de un embrión de excelente calidad:

Forma esferoide
Simetría de los blastómeros
Apariencia clara y neta de los blastómeros
Tonalidad oscura y uniforme
Uniformidad de la membrana celular
Proporcionalidad entre el embrión y el espacio perivitelino
Integridad de la zona pelúcida
Ausencia de vacuolas en el embrión y bridas celulares en el espacio perivitelino
Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelúcida
Compactación de los blastómeros entre sí
128 Palma

Foto 1. Mórula temprana Foto 2. Mórulas compactasd6

d5 (Mt GII) (Mc GI- II)

Foto 3. Blastocistos tempranos Foto 4. Blastocistos d7

d7 (Bt G I-II) (B GI)

Foto 5. Blastocistos expandidos Foto 6. Blastocisto expandido

d8-9 (Be GI) protruyendo d8 (Be GI)

Foto 7. Blastocisto
protruido y zona
pelúcida d8-9
(Bp GI)
Evaluación morfológica de embriones bovinos 129

Foto 8. Blastocisto protruido

(Bp GI) d9-10 Foto 9. Blastocisto
protruido d9-10 (Bp GII)

Grados de calidad

La determinación del grado de calidad del embrión permite caracterizar en términos

(más o menos) cuantitativos las posibilidades de desarrollo y posterior nacimiento de un
ternero a partir del embrión obtenido (tabla 4). Los diferentes grados de calidad son
determinados por medio de la observación microscópica de la morfología con ayuda de una
lupa estereoscópica (0,7-6,4x). Existen distintas escalas de calidad embrionaria,
desarrolladas por distintos equipos de trabajo. Tanto la observación per se, como la
diferenciación entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran parte, de la experiencia
del operador.
G I: Excelente, el desarrollo corresponde al día de la recolección. No existen defectos
visibles. Los blastómeros son claramente visibles, de color y estructura uniformes,
simétricos, de forma esferoide y la zona pelúcida está intacta (Fotos 2, 5-8)
G II: Bueno, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o
posee una pequeña cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente
irregular (Fotos 1, 2, 9).
G III: Regular, el embrión posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color
muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida (Foto 10).
G IV: Malo, el embrión posee muchos defectos: los correspondientes al G III más desarrollo
retardado, seria ruptura de la zona pelúcida -el embrión puede encontrarse
parcialmente fuera de ella-, forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración como
granulación o vacuolización de los blastómeros. Incluye también a los estadíos hasta 8
células y la clara degeneración. Esta categoría es considerada como no transferible
(Foto 11).

Foto 10. M GIII Foto 11. M GIV Foto 12. Ovocito sin
fecundar
130 Palma
Kuzan (1988) clasificó a los embriones en 6 categorías. Las primeras 3 coinciden
con las del cuadro superior. La categoría 4 caracteriza a los embriones de baja calidad
que aún son considerados transferibles, la 5, a los degenerados y la 6, a los ovocitos sin
fecundar (Foto 13) o a las zonas pelúcidas vacías. Un bajo número de blastómeros libres
no afecta la capacidad de desarrollo del embrión, sin embargo más de 5 blastómeros
separados de la masa celular o degenerados disminuyen su capacidad de sobrevivencia
(Kuzan, 1988).
El éxito de la TE depende, entre otros factores, de una buena experiencia en la
evaluación y manipulación del embrión. Embriones clasificados como excelentes o buenos
tienen una alta probabilidad de alcanzar la preñez (60-70%). Embriones calificados como
dudosos pueden ser cultivados durante unas horas (2-4) -para evaluar su desarrollo- o
transferidos, según el criterio del operador y los medios disponibles (No de embriones
obtenidos, No de receptoras, etc.). No obstante la correcta evaluación de los embriones
obtenidos, es importante tener en cuenta que existen casos en los cuales embriones
calificados excelentes luego de una perfecta transferencia no concluyen en una preñez
mientras que embriones de muy baja calidad y transferidos con dificultad, concluyeron en
preñeces y nacimientos normales (Elsden y Seidel, 1990).

Tabla 2. Cronograma de desarrollo embrionario (%) en varios momentos

después del celo con PMSG (n = 3301 embriones, Kauffold y col., 1985)

Estadío Día después del celo

6 7 8 desarrollo
2-8 células 29,9 9,8 8,0
16 11 2,0 0,7 retardado
Mt 42,6 8,5 6,2
Mc 15,3 32,9 9,5 ligeramente subnormal
Bt 03 26,4 16,6
B 19,1 45,4 normal
Be 0,4 0,9 0,8
Bp 0,4 12,4

Tabla 3. Estadíos de desarrollo de embriones recolectados en distintos momentos después

del estro (Lindner y col., 1983).

Estadío de desarrollo embrionario

Día después (% del total de embriones obtenidos)
del estro n= 1043 embriones
16 Total de
M Mc Bt B Be Bp
células embriones
5 10 55 35 --- --- --- --- 20
6 5 20 67 8 --- --- --- 79
7 --- 3 37 30 23 6 1 274
8 --- --- 14 21 24 36 5 499
9 --- --- --- 7 22 4 28 171
Evaluación morfológica de embriones bovinos 131
Tabla 4. Tasas de preñez (n) obtenidas en 5 estudios diferentes con embriones clasificados
morfológicamente en distintas categorías, Betteridge y col. (1989)

Eldsen y col. Shea Linder y Wrigth Hasler y col. Hasler y col.

Calidad*
(1978) (1981) (1983) (1987) (1987)
A 63 (173/275) 71 (5/7) 45 (130/292) 73 (4073/5524) 83 (451/542)
B 58 (88/152) 56 (576/672) 44 (128/292) 60 (181/304) 75 (307/408)
C 31 (13/42) 44 (57/130) 27 (40/149) 41 (31/76) 63 (135/241)
D 12 (5/42) 20 (10/50) 46 (6/13)
Las clasificaciones varían entre autores. A es excelente y D malo

La evaluación morfológica de los embriones es uno de los pasos más importantes

para el éxito de un programa de transferencia de embriones. Determinar la transferencia
de un embrión exclusivamente a través de sus cualidades morfológicas es, sin embargo,
una equivocación. Otros factores como el valor del embrión en particular y también la
disponibilidad de receptoras son importantes en la decisión.
Es conveniente además acentuar que una estricta selección de los embriones por
medio de su evaluación morfológica aumenta la tasa de gestaciones por transferencia
pero, al mismo tiempo, disminuye la tasa de preñez por cada donante (Betteridge y col.,
1989).
132 Palma
Bibliografía

Betterige KJ, King WA, D Rieger, (1989) Bovine embryo development from conception to collection
In: Proceedings of the 8th annual Convention American Embryo Transfer Association 83-97
Callensen H, Greve T and P Hyttel (1986) Preovulatory endocrinology and oocite maduration in
superovulated cattle Theriogenology 25, 71-76
Dietl J (1986) Struktur und Funktion der Zona Pellucida In: Ferdinand Enke Verlag (ed), Stuttgart, 1-
184
Elsden RP and GE Seidel Jr (1990) In: Evaluation of embryos. Procedures for recovery, bisection,
freezing and transfer of bovine embryos Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory
Colorado State University 13-16
Greve T and H Lehn-Jensen (1979) Current Status of embryotransplantation in Denmark
Theriogenology 11, 99
Kauffold P, Thamm I, Alm H, Ehring F, Falge R und P Rommel (1985) Die Zustandsbeurteilung von
Rinderembryonen Forschungszentrum für Tierproduktion Dummerstorf-Rostock der Akademie
der Landwirtschafts-wissenschaften der DDR 3-47
Kusters G (1983) Tiefgefrierversuche mit Rinderembryonen unter besonderer Berücksichtigung der
Anwendungsmethoden Hannover Tierärztliche Hochschule Diss 1-66
Kuzan FB (1988) Classification of embryos prior to freezing In: Elsden RP and GE Seidel, Jr
Procedures for recovery, bisection, freezing and Transfer of bovine embryos Animal
Reproduction and Biotechnology Laboratory Bulletin No 2,34-45
Leibo S (1985) The embryology of embryotransfer In: Embryo transfer in cattle Lloyd Donaldson
(Ed) 32-53
Lindner GM and RW Wright (1983) Bovine embryo morphology and evaluation Theriogenology 20,
407-416
Mappletoft JR (1986) Bovine embryo transfer In: Morrow DA Current therapy in Theriogenology 2
WB Saunders Company (Ed)
Most C (1981) Embryotransferversuche beim Rind unter Umgehung der Zervix (Parazervikale
Embryotransfer) Hannover Tierärztliche Hochschule Diss 1-7
Noden DM y A Lahunta (1985) Early stages of development in bird and mammals In: Stamathis (ed)
The embryology of domestic animals, Williams & Wilkins, 23-46
Pedersen RA (1988) Early mammalian embryogenesis In: Knobil E y Neil y col (Eds) The
physiology of reproduction Raven Press Ltd, New York 187-230
Pokorny R (1981) Versuche zur Tiefgefrierkonservierung von Rinderembryonen mit Hilfe der
Tiefgefrieranlage Modell Neustadt/Aisch Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss 1-89
Shea BF, Hines DJ, Lightfoot DE, Ollis GW and SM Olson (1976) The transfer of bovine embryos
In: Rowson LEA (Ed) EEC Publication EUR 5491, Luxemburg, 145-152
Evaluación morfológica de embriones bovinos 125