Está en la página 1de 11

Seguridad, bioética y validación

6.1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Además de los riesgos de seguridad cotidianos comunes a cualquier lugar de trabajo, el laboratorio de cultivo celular
tiene una serie de riesgos particulares asociados con el trabajo de cultivo. A pesar de los antecedentes científicos y la
capacitación de la mayoría de las personas que trabajan en este entorno, los accidentes aún ocurren, ya que la
familiaridad a menudo conduce a un enfoque informal en el tratamiento de riesgos regulares, biológicos y radiológicos.
Además, las personas que prestan servicios en el área a menudo no tienen antecedentes científicos, y la responsabilidad
recae en aquellos que sí tienen que mantener un ambiente seguro para todos los que trabajan allí. Es importante
identificar los peligros potenciales pero, al mismo tiempo, ser racional y proporcionado en la identificación de los
riesgos. Si un riesgo no se considera realista, entonces las precauciones tenderán a ser ignoradas, y todo el código de
seguridad será desprestigiado. Es esencial que el personal nuevo que se une a la instalación de cultivo de tejidos, de
otros departamentos o de otros lugares, reciba instrucción formal sobre los problemas de seguridad relacionados con el
laboratorio de cultivo de tejidos. Esta instrucción debe ir acompañada de un documento impreso que defina los
procedimientos de seguridad y el papel del individuo, así como el de la administración. Este manual también debe cubrir
cuestiones éticas (ver Sección 6.9) y los aspectos importantes del aseguramiento de la calidad (ver Sección 6.10) y la
validación (ver Sección 6.11) esenciales para el uso confiable de líneas celulares y la seguridad del laboratorio de cultivo
de tejidos. Un nuevo miembro de la unidad debe ser considerado como un aprendiz, independientemente de su
antigüedad, hasta que demuestre que Cultivo de células animales: un manual de técnica básica y aplicaciones
especializadas, sexta edición, por R. Ian Freshney Copyright © 2010 John Wiley & Sons, Inc. puede trabajar de forma
independiente dentro de los procedimientos técnicos y reglamentarios establecidos para el laboratorio.

6.2 EVALUACIÓN DE RIESGOS

La evaluación de riesgos es un principio importante que se ha incorporado a la legislación de seguridad más moderna.
Determinar la naturaleza y el alcance de un peligro particular es solo una parte del proceso; Las condiciones ambientales
generales son igualmente importantes para determinar el riesgo (Tabla 6.1). Consideraciones tales como la cantidad de
un material en particular, el grado y la frecuencia de exposición a un peligro, la escala de la operación, los
procedimientos para manipular materiales y equipos, quién los usa y su capacitación y experiencia relevantes, el tipo de
ropa protectora usada Sin embargo, los riesgos auxiliares, como la exposición al calor, las heladas y la corriente eléctrica,
contribuyen al riesgo de un procedimiento dado, aunque la naturaleza del peligro en sí puede permanecer constante. Un
problema importante que surge constantemente al establecer prácticas seguras en un laboratorio biomédico es la
preocupación desproporcionada dada a los peligros más esotéricos y poco conocidos, como los que surgen de la
manipulación genética, en relación con los peligros conocidos y probados de productos químicos tóxicos y corrosivos,
solventes , fuego, radiación ionizante, descarga eléctrica y vidrios rotos. Es importante que los riesgos biológicos se
clasifiquen correctamente [Caputo, 1996; CDC / OHS, 1999; HSE, 2008a], ni enfatizó en exceso ni subestimó, pero las
precauciones tomadas no deberían desplazar el reconocimiento de los problemas de seguridad cotidianos.

6.3 PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR

Las sustancias, el equipo y las condiciones peligrosas no deben considerarse de forma aislada, sino que deben tomarse
como parte de un procedimiento, cuyos componentes deben evaluarse. Si se considera que el procedimiento conlleva
un riesgo significativo más allá del lugar común, entonces se debe definir un procedimiento operativo estándar (SOP), y
todos los que trabajan con el material y el equipo deben cumplir con ese procedimiento. Deben identificarse las
diferentes etapas del procedimiento (adquisición, almacenamiento, operaciones y eliminación), y debe tenerse en
cuenta la posibilidad de que la presencia de más de un peligro dentro de un procedimiento agravará el riesgo o, en el
mejor de los casos, complicará precauciones necesarias (p. ej., ¿cómo se elimina el vidrio roto que ha estado en contacto
con una línea celular humana etiquetada con un radioisótopo?).
6.4 REGLAMENTOS DE SEGURIDAD

Las siguientes recomendaciones no deben interpretarse como un código de práctica sino como un consejo que podría
ayudar a compilar las normas de seguridad. La información está diseñada para proporcionar al lector algunas pautas y
sugerencias para ayudar a construir un código de práctica local, junto con la legislación regional y nacional y en plena
consulta con el comité de seguridad local (Tabla 6.2). Estas recomendaciones no tienen validez legal y no deben citarse
como si lo tuvieran. Las regulaciones generales de seguridad deben estar disponibles en la oficina de seguridad de la
organización en la que trabaja. Además, están disponibles en la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional en los
Estados Unidos [OSHA, 2009] y en el Reino Unido en el Reglamento de Gestión de Salud y Seguridad en el Trabajo
[Reglamento de Gestión de Salud y Seguridad en el Trabajo, 1999] (Tabla 6.3) Estas regulaciones cubren todos los
asuntos de seguridad general. Las regulaciones y recomendaciones relevantes para la seguridad biológica de los Estados
Unidos están contenidas en Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos [CDC / OHS, 1999], un
documento conjunto preparado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en Atlanta, Georgia, y
los Institutos Nacionales de Salud en Bethesda, Maryland. Para el Reino Unido, el Ejecutivo de Salud y Seguridad [HSE,
2009] ofrece información y orientación sobre riesgos biológicos en el trabajo. Las pautas de seguridad en Europa se
manejan a nivel nacional, y es responsabilidad de cada país garantizar el cumplimiento de las Directivas CE apropiadas. El
consejo que se brinda en este capítulo es general y no debe interpretarse como que satisface ningún requisito legal
nacional o internacional.

6.5 SEGURIDAD GENERAL

Algunos aspectos de la seguridad general requieren un énfasis particular en un laboratorio de cultivo de tejidos (Tabla
6.4). 6.5.1 Operador Es responsabilidad de la institución proporcionar la capacitación correcta en los procedimientos de
laboratorio apropiados y garantizar que los miembros nuevos y existentes del personal estén y estén familiarizados con
las normas de seguridad. Es responsabilidad del supervisor asegurarse de que los procedimientos se llevan a cabo
correctamente y que se usa la ropa protectora correcta en el momento adecuado.

6.5.2 Equipamiento

Se debe designar un supervisor general para que se encargue de todo el mantenimiento del equipo, la seguridad
eléctrica y la confiabilidad mecánica. Se debe poner un curador a cargo de cada equipo individual para supervisar el
mantenimiento y la operación del equipo y capacitar a otros en su uso. Los riesgos particulares incluyen la generación de
humos tóxicos o aerosoles a partir de centrifugadoras y homogeneizadores, que deben estar contenidos por el diseño
del equipo o por colocarlos en un armario de humos.

La seguridad eléctrica de los equipos se trata en los Estados Unidos bajo la Salud y Seguridad Ocupacional [OHSA] y en el
Reino Unido por el Ejecutivo de Salud y Seguridad [HSE, 1998].

6.5.3 Cristalería y objetos afilados

La forma más común de lesión en la realización de cultivos de tejidos resulta del manejo accidental de vidrios rotos y
agujas de jeringas. Particularmente peligrosas son las pipetas rotas en un cilindro de lavado, que resultan de forzar
demasiadas pipetas a un recipiente demasiado pequeño (Fig. 6.1). Las pipetas Pasteur de vidrio no deben insertarse en
un cilindro de lavado con otras pipetas (ver más abajo, esta sección). Las agujas que se han eliminado de manera
inadecuada junto con los desechos ordinarios o se han forzado a través de la pared de un contenedor rígido cuando el
contenedor se llena demasiado también son muy peligrosas. La inoculación accidental a través de una aguja desechada
o vidrio roto, o debido a un accidente durante el manejo de rutina, sigue siendo uno de los riesgos más agudos
asociados con el manejo de material potencialmente biopeligroso. Incluso puede conllevar un riesgo de trasplante
cuando uno maneja tumores humanos [Southam, 1958; Scanlon y col., 1965; Gugel y Sanders, 1986], particularmente en
un huésped inmunocomprometido. Las pipetas Pasteur deben desecharse en un recipiente para objetos punzantes
(consulte el Apéndice II y www.cdc.gov/niosh/sharps1.html) y no en el lavado regular, ya que se rompen muy fácilmente
y los fragmentos son extremadamente peligrosos. Si se reutilizan, deben manejarse por separado y con mucho cuidado.
Las pipetas Pasteur de plástico desechables (por ejemplo, Pastettes) están disponibles, pero tienden a tener una punta
más gruesa. Evite usar jeringas y agujas, a menos que sean necesarias para cargar ampollas (use una cánula roma) o
extraer líquido de un vial tapado. Cuando se desechan las agujas desechables, use un recipiente rígido de plástico o
metal. No intente doblar, manipular o volver a envainar la aguja. Proporcione recipientes separados de paredes duras
para la eliminación de objetos afilados y vidrios rotos, y no use estos recipientes para desechos generales. Tenga
cuidado cuando coloque una bombilla o dispositivo de pipeteo en una pipeta de vidrio. Elija el tamaño correcto de
bombilla para protegerse contra el riesgo de que la pipeta se rompa en el cuello y lastime su mano. Verifique que el
cuello esté firme, sostenga la pipeta lo más cerca posible del extremo y aplique una presión suave con la pipeta
apuntando lejos de los nudillos (Fig. 6.2). Aunque esto es principalmente un riesgo derivado del uso de pipetas de vidrio,
incluso las pipetas de plástico pueden dañarse y romperse al insertarlas, así que siempre verifique la parte superior de
cada pipeta antes de usarlas.

6.5.4 Toxicidad química

Se utilizan relativamente pocas sustancias tóxicas importantes en el cultivo de tejidos, pero cuando lo están, se deben
tomar las precauciones convencionales, prestando especial atención a la distribución de polvos y aerosoles por
campanas de flujo laminar (ver Sección 6.8.2). Los detergentes, particularmente los que se usan en las lavadoras
automáticas, generalmente son cáusticos, e incluso cuando no lo son, pueden causar irritación en la piel, los ojos y los
pulmones. Use detergentes a base de líquido en un dispositivo dispensador siempre que sea posible, use guantes y evite
los procedimientos que hacen que el detergente en polvo se extienda como polvo. Los concentrados de detergente
líquido se manejan más fácilmente, pero a menudo son más caros de lograr el mismo nivel de efectividad. Los
desinfectantes químicos como el hipoclorito deben usarse con precaución, ya sea en forma de tabletas o como un
líquido dispensado desde un dispensador. Los desinfectantes de hipoclorito blanquean la ropa, causan irritaciones en la
piel e incluso corroen el acero inoxidable soldado. Los productos químicos específicos utilizados en el cultivo de tejidos
que requieren atención especial son (1) dimetil sulfóxido (DMSO), que es un poderoso solvente y penetrante de la piel y
puede transportar muchas sustancias a través de la piel [Horita y Weber, 1964] e incluso a través de algunos guantes
protectores ( p. ej., látex de goma o silicona, aunque poco a través del nitrilo), y (2) mutágenos, carcinógenos y fármacos
citotóxicos, que deben manipularse en un gabinete de seguridad. Una campana de flujo laminar de Clase II puede ser
adecuada para el manejo poco frecuente de pequeñas cantidades de estas sustancias, pero puede ser necesario usar
una campana diseñada específicamente para productos químicos citotóxicos (ver Fig. 6.5b). Los mutágenos,
carcinógenos y otros productos químicos tóxicos a veces se disuelven en DMSO, lo que aumenta el riesgo de absorción a
través de la piel. Los guantes de nitrilo proporcionan una mejor barrera, pero deben ser probados para los agentes
particulares en uso. El manejo de productos químicos está regulado por la Salud y Seguridad Ocupacional [OSHA, 2009] y
por el Ejecutivo de Salud y Seguridad en el Reino Unido [HSE-COSHH]. La información y las pautas también están
disponibles en el Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional [CDCNIOSH, 2009].

6.5.5 Gases La mayoría de los gases utilizados en el cultivo de tejidos (CO2, O2, N2) no son dañinos en pequeñas
cantidades, pero son peligrosos si se manejan incorrectamente. Deben estar contenidos en cilindros presurizados que
estén debidamente asegurados (Fig. 6.3). Si se produce una fuga importante, existe el riesgo de asfixia por CO2 y N2 y de
incendio por O2. La evacuación y la ventilación máxima son necesarias en cada caso; Si hay una fuga extensa de O2,
llame al departamento de bomberos. Se debe instalar un monitor de oxígeno cerca del nivel del piso en habitaciones
donde el N2 y CO2 gaseoso o líquido se almacenan a granel, o donde hay un suministro de tubería a la habitación.
Cuando se usan ampollas de vidrio, se sellan con una llama de oxígeno gaseoso. Se debe tener mucho cuidado tanto
para proteger la llama como para evitar la mezcla accidental del gas y el oxígeno. Se debe incorporar una válvula
unidireccional en la línea de gas para que el oxígeno no pueda regresar.

6.5.6 Nitrógeno líquido

Tres grandes riesgos están asociados con el nitrógeno líquido: congelación, asfixia y explosión (ver Protocolo 19.1.2).
Debido a que la temperatura del nitrógeno líquido es −196 ° C, el contacto directo con el líquido (a través de
salpicaduras, etc.), o con cualquier cosa, particularmente algo metálico, que se haya sumergido en él, presenta un grave
peligro. Deben usarse guantes que sean lo suficientemente gruesos para actuar como aislamiento, pero lo
suficientemente flexibles como para permitir la manipulación de las ampollas (ver Guantes crioprotectores, Apéndice II).
Cuando el nitrógeno líquido se evapora durante el uso rutinario del congelador, la ventilación regular es suficiente para
eliminar el exceso de nitrógeno, pero cuando se dispensa nitrógeno líquido o cuando se insertan muchas muestras en el
congelador, será necesaria una ventilación adicional. Recuerde, 1 L de nitrógeno líquido genera casi 700 L de gas. Se
debe instalar un monitor de oxígeno y una alarma (ver Fig. 3.8) y conectarlos al sistema de ventilación, de modo que un
derrame de nitrógeno que reduzca la concentración de oxígeno y active la alarma también aumenta la tasa de
ventilación.

Cuando una ampolla o vial se sumerge en nitrógeno líquido, se produce una diferencia de alta presión entre el exterior y
el interior de la ampolla. Si la ampolla no está perfectamente sellada, se puede extraer nitrógeno líquido, lo que hace
que la ampolla explote violentamente cuando se calienta para descongelarse. Las ampollas sumergidas en nitrógeno
líquido deben estar perfectamente selladas; La descongelación de ampollas o viales que se han almacenado sumergidos
en nitrógeno líquido siempre se debe realizar en un recipiente con tapa, como un balde de plástico (ver Protocolo 19.2;
Fig. 19.9), y se debe usar una careta o gafas protectoras. Este problema se puede evitar almacenando las ampollas en la
fase gaseosa o en un congelador de camisa perfundido (ver Sección 19.3.6), lo que también reduce los riesgos de asfixia.

6.5.7 Quemaduras Existen tres fuentes principales de riesgo de quemaduras: (1) autoclaves, hornos y placas calientes;
(2) manejo de artículos que se acaban de quitar de ellos; y (3) llamas desnudas, como un mechero Bunsen (ver Tabla
6.4). Se deben colocar avisos de advertencia cerca de todos los equipos calientes, incluidos los quemadores, y los
artículos que se acaban de esterilizar se deben dejar enfriar antes de retirarlos del esterilizador. Se deben proporcionar
guantes aislantes donde se manipulan artículos calientes.

6.6 FUEGO Los riesgos particulares de incendio asociados con el cultivo de tejidos se derivan del uso de quemadores
Bunsen para flamear, junto con alcohol para frotar o esterilizar. Mantenga los dos separados; asegúrese siempre de que
el alcohol para esterilizar los instrumentos se mantenga en volúmenes mínimos en una botella o matraz de cuello
estrecho que no se altere fácilmente (Fig. 6.4). El alcohol para frotar debe mantenerse en una botella plástica de lavado
o en aerosol y no debe usarse en presencia de una llama abierta. Cuando los instrumentos se esterilizan en alcohol y el
alcohol se quema posteriormente, se debe tener cuidado de no devolver los instrumentos al alcohol mientras aún están
encendidos. Si está utilizando esta técnica, mantenga cerca un paño húmedo para sofocar las llamas si se enciende el
alcohol.

6.7 RADIACIÓN IONIZANTE

Tres tipos principales de peligro de radiación están asociados con el cultivo de tejidos: ingestión, irradiación de reactivos
etiquetados e irradiación de una fuente de alta energía. Las directrices sobre protección radiológica para los Estados
Unidos se pueden obtener de la Comisión de Regulación Nuclear [NRC, 2008] y para el Reino Unido de las Publicaciones
de Protección Radiológica de HSE [HSE, 2008b].

6.7.1 Ingestión Los compuestos solubles radiomarcados pueden ingerirse salpicando las manos o mediante aerosoles
generados por pipeteo o el uso de una jeringa. Los nucleótidos tritiados, si se ingieren accidentalmente, se incorporarán
al ADN y causarán radiólisis dentro del ADN debido a la corta longitud del camino de la emisión β de baja energía de 3H.
Los isótopos radiactivos de yodo se concentrarán en la tiroides y también pueden causar daño local. Trabaje en una
capucha de clase II para contener aerosoles y use guantes. Los artículos con los que está trabajando deben mantenerse
en una bandeja poco profunda forrada con papel de seda o Benchcote para contener cualquier derrame accidental. Use
los equipos más pequeños (una pipeta con puntas de plástico desechables, pequeños tubos de muestra, etc.)
compatibles con el procedimiento para generar un volumen mínimo cuando se desechan en un contenedor de desechos
radiactivos. Limpie cuidadosamente cuando haya terminado y controle el área regularmente para detectar cualquier
derrame.

6.7.2 Eliminación de desechos radiactivos

Los procedimientos y las rutas para la eliminación de sustancias radiactivas se definirán en las normas locales que rigen
el laboratorio; Se puede obtener asesoramiento para establecer estas reglas de las autoridades mencionadas
anteriormente. Brevemente, la cantidad de radiactividad eliminada durante un cierto período tendrá un límite superior,
la eliminación se limitará a ciertos sumideros designados y las cantidades desechadas deberán registrarse en un libro de
registro en el sitio de eliminación. Los recipientes utilizados para la eliminación deberán descontaminarse en un
detergente apropiado y los lavados se eliminarán como desechos radiactivos. Es posible que la eliminación deba tener
en cuenta cualquier riesgo biológico, por lo que los artículos que se van a reutilizar primero deberán descontaminarse
biológicamente en hipoclorito y luego descontaminarse radiactivamente en Decon o un detergente similar. Ambas
soluciones deben considerarse residuos radiactivos.

6.7.3 Irradiación de reactivos marcados

El segundo tipo de riesgo es la irradiación de emisores β y γ de mayor energía, como 32P, 125I, 131I y 51Cr. La
protección se puede obtener trabajando detrás de un escudo de plomo de 2 mm de espesor y almacenando el isótopo
concentrado en una olla de plomo. Las pantallas Perspex (5 mm) se pueden usar con 32P a bajas concentraciones
durante períodos cortos. Trabaje en una bandeja en una campana de Clase II (consulte la Sección 6.7.1).

6.7.4 Irradiación de fuentes de alta energía

El tercer tipo de riesgo de irradiación proviene de máquinas de rayos X, fuentes de alta energía como 60Co o fuentes
ultravioletas (UV) utilizadas para esterilizar aparatos o detener la proliferación celular en las capas de alimentación (ver
Sección 13.2.3; Protocolos 22.1, 22.4) . Debido a que la energía, particularmente de los rayos X o 60Co, es alta, estas
fuentes generalmente se encuentran en un alojamiento especialmente diseñado y están sujetas a un control estricto.
Las fuentes UV pueden causar quemaduras en la piel y daños en los ojos; deben ser cuidadosamente seleccionados para
evitar la irradiación directa del operador, que debe usar gafas protectoras con filtro de barrera. Consulte a su oficial
radiológico local y al código de práctica antes de embarcarse en experimentos radioisotópicos. Las reglas locales varían,
pero la mayoría de los lugares tienen controles estrictos sobre la cantidad de radioisótopos que pueden usarse,
almacenarse y descartarse. A quienes deseen usar radioisótopos se les puede solicitar que se realicen un examen
médico general, incluido el almacenamiento de una muestra de sangre, antes de comenzar a trabajar.

6.8 BIOPELIGROS

En cuanto al uso de radioisótopos, aquellos que deseen utilizar material potencialmente biopeligroso pueden requerir
un examen médico general, incluido el almacenamiento de una muestra de sangre, antes de comenzar a trabajar. La
necesidad de protección contra riesgos biológicos [Caputo, 1996] se define tanto por la fuente del material como por la
naturaleza de la operación que se realiza. También se rige por las condiciones bajo las cuales se realiza el cultivo. El uso
de la técnica microbiológica estándar en el banco abierto tiene la ventaja de que las técnicas en uso actual se han
establecido como resultado de muchos años de experiencia acumulada. Los problemas surgen cuando se introducen
nuevas técnicas o cuando aumenta el número de personas que comparten la misma área. Con la introducción de
campanas horizontales de flujo laminar, la esterilidad del cultivo se protegió de manera más efectiva, pero la exposición
del operador a los aerosoles fue más probable. Esto condujo al desarrollo de campanas verticales de flujo laminar con
una cortina de aire en la parte delantera (consulte las Secciones 5.2.1, 6.8.2) para minimizar el exceso de agua desde el
interior del gabinete. Ahora se definen como gabinetes de seguridad microbiológica de Clase II (ver Sección 6.8.2).

6.8.1 Niveles de contención biológica

Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades han definido
cuatro niveles de seguridad biológica [CDC / OSH, 1999] (Tabla 6.5). Estas prácticas se refieren a las instalaciones y
procedimientos de seguridad que requieren. Las directrices del Reino Unido también definen cuatro niveles de
contención biológica, aunque existen pequeñas diferencias con respecto a la clasificación de los EE. UU. (Tabla 6.6).
Estas tablas proporcionan solo resúmenes, y cualquier persona que realice un trabajo potencialmente biopeligroso debe
comunicarse con el comité de seguridad local y consultar a la autoridad nacional correspondiente [por ejemplo, CDC /
OSH, 1999; HSE, 2008a].

6.8.2 Gabinetes de seguridad microbiológica (MSC)


Dentro del nivel apropiado de contención podemos definir tres niveles de manejo determinados por el tipo de seguridad

gabinete utilizado:

(1) Protección mínima. Banco abierto, según buena técnica microbiológica. Nuevamente, esto normalmente se llevará a
cabo en un área especialmente definida, que simplemente se puede definir como el "laboratorio de cultivo de tejidos",
pero al que se le aplicarán condiciones de Nivel 1.

(2) Nivel intermedio de protección contra riesgos potenciales. Capucha de flujo laminar vertical con protección frontal
en forma de cortina de aire y escape filtrado (campana de riesgo biológico o MSC, Clase II; Fig. 6.5a) [NSF, 1993; Norma
británica BS5726-2005]. Si se están manejando patógenos reconocidos, las campanas como estas deben estar alojadas
en habitaciones separadas, en los niveles de contención 2, 3 o 4, dependiendo de la naturaleza del patógeno. Si no hay
ninguna razón para suponer que el material está infectado, excepto por agentes adventicios, entonces las campanas se
pueden alojar en la instalación principal de cultivo de tejidos, que se puede clasificar como Nivel de contención

2, que requiere acceso restringido, control de eliminación de desechos, ropa protectora y no comida o bebida en el área
(ver Tablas 6.5, 6.6.). Todas las campanas de riesgo biológico deben estar sujetas a un estricto programa de
mantenimiento [Osborne et al., 1999], con los filtros probados a intervalos regulares, arreglos adecuados para la
fumigación de los gabinetes antes de cambiar los filtros, y la eliminación de los filtros viejos asegurados al extraerlos. en
bolsas dobles para incineración.

(3) Máxima protección contra los patógenos conocidos. Un gabinete sellado de patógenos con aire filtrado que entra y
sale a través de un filtro de trampa de patógenos (campana de riesgo biológico o MSC, Clase III; Fig. 6.5c). El gabinete
generalmente estará alojado en una habitación separada con acceso restringido y con duchas y protección para
desechos sólidos y líquidos (consulte BSL 4 en la Tabla 6.5 y Nivel 4 en la Tabla 6.6), dependiendo de la naturaleza del
peligro. La Tabla 6.7 enumera los procedimientos comunes con los niveles sugeridos de contención. Sin embargo, todos
los que usan las instalaciones deben buscar el consejo de los comités de seguridad locales y las pautas de seguridad
biológica apropiadas (ver Sección 6.4) para conocer los requisitos legales.

6.8.3 Material de biopsia humana

Las cuestiones de seguridad biológica son más claras cuando se utilizan patógenos clasificados conocidos, porque los
reglamentos que cubren dichos patógenos están bien establecidos tanto por los CDC / NIH en los Estados Unidos [CDC /
OSH, 1999] como en el Reino Unido por el Comité Asesor sobre Peligros Patógenos [ACDP, 2003]. Sin embargo, en dos
áreas principales existe un riesgo que no es inmediatamente evidente en la naturaleza del material. Uno está en el
desarrollo, mediante técnicas recombinantes como la transfección, la infección retroviral y la hibridación interespecífica
de células, de nuevos transgenes potencialmente patógenos. El manejo de tales cultivos en instalaciones tales como
campanas de flujo laminar presentan riesgos supuestos para los cuales no hay datos epidemiológicos disponibles para la
evaluación. Los virus transformadores, los virus anfitrópicos, las líneas celulares humanas transformadas, los híbridos
humano-ratón y las líneas celulares derivadas de xenoinjertos en ratones inmunodeficientes, por ejemplo, deben
tratarse con precaución hasta que haya suficientes datos que demuestren que no conllevan ningún riesgo.

La otra área de riesgo es la inclusión de agentes adventicios en biopsias de humanos u otros primates o muestras de
autopsias o líneas celulares [Grizzle & Polt, 1988; Centros para el Control de Enfermedades, 1988; Wells y col., 1989;
Tedder et al., 1995] o en productos animales como el suero, particularmente si esos materiales se obtienen de partes del
mundo con un alto nivel de enfermedades infecciosas endémicas. Cuando se ha confirmado la infección, el tipo de
organismo determinará el grado de contención, pero incluso cuando la infección no se haya confirmado, existe la
posibilidad de que la muestra aún pueda contener hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), tuberculosis u
otros patógenos. aún no diagnosticado. La confidencialidad a menudo impide la prueba del VIH sin el consentimiento del
paciente, y para la mayoría de las infecciones accidentales, la información adecuada no estará disponible. Si es posible,
el material de la biopsia debe analizarse para detectar posibles infecciones adventicias antes de manipularlo. La
autoridad para hacerlo debe acordarse en el formulario de consentimiento de que se le pedirá a la persona que dona el
tejido que firme (ver ejemplo, Tabla 6.8), pero la necesidad de obtener muestras en cultivo rápidamente a menudo
significará que debe proceder sin esto. información. Dichas muestras deben manejarse con precaución:

(1) Transporte las muestras en un recipiente con doble envoltura (por ejemplo, un recipiente universal o un vial con
tapón de rosca dentro de un segundo recipiente con tapa de rosca, como un recipiente de muestra de
polipropileno). Esto, a su vez, debe encerrarse en un sobre de plástico opaco o papel impermeable, lleno de
empaques de papel absorbente para contener cualquier fuga, y transportado al laboratorio por un transportista
designado.

(2) Ingrese todas las muestras en un libro de registro en el recibo y colóquelas en un refrigerador seguro marcado
con una etiqueta de riesgo biológico.

(3) Lleve a cabo la disección y el trabajo de cultivo posterior en una campana de riesgo biológico de Clase II
designada, preferiblemente ubicada en una habitación separada de aquella en la que se realiza el cultivo celular de
rutina. Esto minimizará el riesgo de propagar contaminaciones, como el micoplasma, a otros cultivos y también
reducirá la cantidad de personas asociadas con la muestra, en caso de que finalmente se descubra que está
infectada.

(4) Evite el uso de instrumentos afilados (por ejemplo, jeringas, escalpelos, pipetas Pasteur de vidrio) en el manejo
de muestras. Claramente, esta regla puede necesitar ser comprometida cuando se requiere una disección, pero eso
debe proceder con mayor precaución.

(5) Coloque todos los cultivos en una caja de plástico con cinta adhesiva o etiquetas que identifiquen los cultivos
como biopeligrosos y con el nombre de la persona responsable y la fecha en ellos (ver Fig. 5.11).

(6) Deseche toda la cristalería, pipetas e instrumentos en desinfectante o en bolsas de riesgo biológico para
esterilizar en autoclave. Si las pruebas de diagnóstico clínico apropiadas muestran que el material no está infectado,
y cuando se ha demostrado que está libre de micoplasma, el material se puede cultivar con otras reservas. Sin
embargo, si se van a generar más de 1 × 109 células o si se va a preparar ADN puro, se debe buscar el consejo del
comité de seguridad local. Si se descubre que una muestra está infectada, debe desecharse en bolsas de doble
riesgo biológico junto con todos los reactivos que se usan con ella, y luego las bolsas deben autoclavarse o
incinerarse. Los instrumentos y otros accesorios deben colocarse en un recipiente con desinfectante, remojarse
durante al menos 2 h y luego esterilizarse en autoclave. Si es necesario continuar trabajando con el material, el nivel
de contención debe aumentar, de acuerdo con la categoría del patógeno [CDC / OSH, 1999; ACDP, 2003].

6.8.4 Manipulación genética. Cualquier procedimiento que implique alterar la constitución genética de las células o
una línea celular mediante la transferencia de ácido nucleico deberá ser autorizado por el comité local de seguridad
biológica. Las reglamentaciones actuales pueden obtenerse de los CDC o NIH de los Estados Unidos [CDC / OSH,
1999] y de la HSE del Reino Unido [HSE, 2008a].

6.8.5 Eliminación de residuos biopeligrosos.

La eliminación de desechos generalmente está bajo control institucional local, donde cada compañía o institución
habrá negociado un código de práctica con el gobierno regional estatal o local siguiendo las pautas de
asesoramiento nacionales o federales, el Consejo Nacional de Investigación en los Estados Unidos [NRC, 2009] y el
Departamento de Salud en el Reino Unido [DoH, 2006]. Los materiales potencialmente biopeligrosos deben
esterilizarse antes de desecharse colocándolos en bolsas autoclavables sin sellar y esterilizando en autoclave, o por
inmersión en un agente esterilizante como el hipoclorito. Se encuentran disponibles varias preparaciones
patentadas, como los concentrados líquidos Clorox o Chloros y las tabletas Precept o Haz-Tab (consulte el Apéndice
II: Desinfectantes). Las concentraciones recomendadas varían según las reglas locales, pero se puede obtener una
guía aproximada de las instrucciones del fabricante. El hipoclorito a menudo se usa a 300 ppm de cloro disponible,
pero algunas autoridades exigen 2500 ppm (una dilución 1:20 de cloro).
El hipoclorito es efectivo y se lava fácilmente con los elementos que se van a reutilizar, pero es altamente corrosivo,
particularmente en soluciones alcalinas. Blanqueará la ropa e incluso corroerá el acero inoxidable (particularmente
en las costuras soldadas), por lo que deben usarse guantes y una bata de laboratorio o delantal al manipular el
hipoclorito, y los baños y cilindros de remojo deben estar hechos de polipropileno.

6.8.6 Fumigación

Algunos procedimientos pueden requerir que el MSC se esterilice después de su uso, por ejemplo, si se usan
patógenos de alto grado, o si el gabinete requiere servicio. La fumigación generalmente se lleva a cabo con
formaldehído, lo que requiere que el gabinete se apague y selle antes de iniciar la fumigación con un generador
calentado eléctricamente. La campana se enciende brevemente para hacer circular el gas y luego se deja durante 1
h. Después de este tiempo, se permite que la campana funcione durante la noche para agotar el vapor, abriendo el
frente después de aproximadamente 10 minutos. La fumigación de los gabinetes también se puede llevar a cabo con
peróxido de hidrógeno (Bioquell), que se dispersa más fácilmente una vez completada la fumigación.

6.9 BIOÉTICA

Además de los riesgos biológicos potenciales, trabajar con tejidos humanos y de otros animales presenta una serie
de problemas éticos relacionados con la adquisición, el manejo posterior y el uso final del material [Hansson, 2009].

6.9.1 Tejido animal

La mayoría de los países involucrados en la investigación biomédica ahora tendrán regulaciones vigentes que rigen
el uso de animales de experimentación u otros donantes para el suministro de tejido. Esto se aplicará a los animales
superiores que se supone tienen suficiente capacidad cerebral y organización para sentir dolor y angustia, y
generalmente no se aplicarán a los vertebrados inferiores, como los peces, ni a los invertebrados. Por lo general, se
supone que un animal superior es sensible en cualquier momento después de la mitad del desarrollo embrionario y
se aplicarán restricciones al método por el cual se mata al animal o se lo opera si quiere seguir vivo, de modo que el
animal sufra un dolor o molestia mínimos. Las restricciones también se aplicarán a la forma en que se aloja y
mantiene al animal, ya sea en una casa de animales durante la cría o en condiciones experimentales, o en un
hospital veterinario en condiciones clínicas. En cada caso, el control suele ser ejercido localmente por un comité de
ética animal y a nivel nacional por un organismo designado por el gobierno o por profesionales. La legislación varía
considerablemente de un país a otro, pero la designación de un comité local de ética animal (AEC) suele ser el
primer paso para ponerse en contacto con la autoridad de licencias correspondiente, en los Estados Unidos, la
Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio [OLAW, 2002] y el Ministerio del Interior en el Reino Unido [Ministerio
del Interior, 2009], o mediante organizaciones de financiación como la Oficina de Actividades Biotecnológicas del
NIH [NIH OBA, 2009] o el Consejo de Investigación Médica [MRC, 2008]. La información también está disponible a
través de la Asociación Europea de Investigación Biomédica [EBRA, 2009].

6.9.2 Tejido humano

El tejido normalmente será recogido en condiciones clínicas por un médico experimentado, y los problemas tienen
más que ver con la justificación para tomar el tejido y los usos que se le darán. El control local se ejercerá a través
del comité de ética del hospital local (HEC), que decidirá si el trabajo es razonable y está justificado por el posible
resultado. Se debe contactar al HEC antes de iniciar cualquier trabajo experimental con tejido humano, y esto se
hace mejor en la etapa de planificación, ya que la mayoría de las autoridades otorgantes requerirán evidencia de
consentimiento ético antes de otorgar financiamiento. El Presidente de los Estados Unidos ha establecido una
Comisión para el Estudio de Cuestiones Bioéticas [PCSBI, 2009] y también hay orientación disponible en la
Declaración de Helsinki [WMA, 2008] y en la llamada Regla Común [OHRP, 2010]. El tema también se trata con cierta
extensión en el fascinante libro de Rebecca Skloot [Skloot, 2010]. En lo que respecta al tejido embriológico, se debe
consultar a la Oficina de Protección de la Investigación Humana en los Estados Unidos [OHRP, 2002] y a la Autoridad
de Fertilización y Embriología Humana [HFEA, 2009] en el Reino Unido. La legislación varía en toda la Unión Europea,
pero la información está disponible en Internet a través de un boletín [EuroStemCell, 2009]. También está la
cuestión de la propiedad del tejido, su contenido, como el ADN, las líneas celulares que se derivan de él y los
productos o procedimientos comercializables que finalmente podrían desarrollarse y venderse con fines de lucro.
Deben abordarse los siguientes problemas:

(1) Se requiere el consentimiento informado del paciente y / o pariente antes de tomar tejido para fines de
investigación, más allá de cualquier requisito clínico.

(2) Se debe redactar una forma adecuada (ver Tabla 6.8) en un estilo fácilmente comprensible por el paciente o el
donante, solicitando permiso y llamando la atención sobre el uso que podría hacerse del tejido.

(3) Se puede requerir permiso de un pariente si el donante está demasiado enfermo para ser considerado capaz de
un juicio razonado.

(4) Se debe preparar un breve resumen de su proyecto, en términos simples, explicando lo que está haciendo, por
qué y cuál será el posible resultado, particularmente si se considera que es de beneficio médico.

(5) Se debe garantizar la confidencialidad del origen del tejido.

(6) Se debe establecer la propiedad de las líneas celulares y sus derivados.

(7) La autoridad puede ser necesaria para la posterior modificación genética de las líneas celulares.

(8) Será necesario establecer los derechos de patente de cualquier colaboración comercial.

(9) El donante deberá determinar si cualquier información genética derivada del tejido debe ser retroalimentada al
paciente directamente o por medio de un médico tratante.

(10) También se requerirá que el donante dé su consentimiento para la detección del tejido en busca de patógenos
adventicios y que diga si desea que se le informe sobre el resultado de las pruebas. Con mucho, el enfoque más fácil
es pedirle al donante y / o familiares que firmen una declaración de descargo de responsabilidad antes de retirar el
tejido; de lo contrario, los aspectos legales de la propiedad de las líneas celulares que podrían derivarse y cualquier
explotación biofarmacéutica futura de las líneas celulares, sus genes y sus productos se vuelve extremadamente
compleja. La retroalimentación de la información genética y la evidencia de una posible infección patológica como el
VIH son problemas más difíciles; en el caso de un paciente en un hospital, la retroalimentación está a la par con una
prueba de diagnóstico y es más probable que se dirija al médico, pero en el caso de un donante que no está
hospitalizado, debe preguntarle al donante si o ella desea conocer sus hallazgos y cualquier implicación que puedan
tener. Esto se puede hacer mejor a través del médico general del donante. Es mejor tratar estos factores haciendo
que el donante firme un formulario de consentimiento. Tal forma ya puede haber sido prescrita por el HEC; de lo
contrario, será necesario preparar uno (por ejemplo, consulte la Tabla 6.8) en colaboración con el HEC y otras partes
involucradas, como colaboradores clínicos, grupos de apoyo para pacientes y autoridades financieras. Hay más
información disponible de los NIH en los Estados Unidos [NIH, 2007] y en el Reino Unido de Nuffield [Nuffield Council
on Bioethics, 2009] y del Medical Research Council [MRC, 2009]. Quizás el aspecto más controvertido del proceso de
consentimiento es la necesidad de que el donante sepa algo sobre para qué se utilizará el tejido. Esto requiere una
breve descripción en términos simples que no agobiará ni confundirá al donante. El trasplante de tejido tiene
objetivos tan claros que se requiere poca explicación de la ciencia, pero algunos procedimientos, como el examen de
anomalías de transducción de señales en células transformadas, requerirán una generalización del concepto. A
menudo, una breve descripción general en términos simples administrados oralmente puede ir acompañada de una
descripción más detallada, aunque todavía en términos simples, enfatizando las ventajas potenciales pero también
identificando los problemas éticos, como la posterior modificación genética de las células o el trasplante de las
células. en otro individuo después de la ingeniería de tejidos.

6.10 GARANTÍA DE CALIDAD

Los laboratorios industriales y comerciales se rigen por estrictas regulaciones que involucran procedimientos y
control de calidad. La mayoría de los laboratorios académicos y de investigación tienden a tener un enfoque más
informal, pero se beneficiarían de la adherencia a las buenas prácticas de laboratorio [Good Laboratory Practice
Regulations, 1999; FDA, 2003; OCDE, 2009; EPA de EE. UU., 2009], incluidos ciertos elementos de garantía de
calidad.

6.10.1 Procedimientos

Es difícil introducir procedimientos operativos estándar (POE) en un laboratorio de investigación donde los grupos
individuales pueden requerir variaciones del procedimiento y la capacidad de modificarlo a medida que avanza la
investigación. Sin embargo, se recomienda que una instalación compartida, como un laboratorio de cultivo de
tejidos, haya definido SOP para prácticas compartidas específicas en el laboratorio. Debe haber un manual
disponible, impreso o en la Intranet local, que muestre los procedimientos estándar para cultivo primario,
subcultivo, clonación, criopreservación, etc., de los cuales los usuarios individuales pueden derivar sus propios
protocolos. Se debe desalentar la desviación del SOP a menos que exista una razón científica válida y sólida que no
comprometa a otros que usan las instalaciones. Se debe evitar la transferencia casual de protocolos de boca en boca
y las desviaciones accidentales que resultan.

6.10.2 Control de calidad (QC)

Independientemente del control sobre los procedimientos, es esencial que la preparación de reactivos y medios, la
operación de las instalaciones y el mantenimiento del equipo estén sujetos a pruebas de rutina. La regla general es
que la persona que prepara un reactivo debe ser diferente de la persona que lleva a cabo el control de calidad, y la
persona que usa un equipo debe ser diferente de la persona que lo revisa. Los aspectos específicos del control de
calidad se tratan en capítulos posteriores (véanse las secciones 10.6, 12.1.1, 15.2, 18.3).

6.11 VALIDACIÓN

El uso adecuado de las líneas celulares ya sea en investigación o explotación comercial, requiere su validación. En un
entorno industrial, esto será una obligación legal si el producto final debe ser aceptado por la Administración
Federal de Drogas (FDA) en los Estados Unidos o el Instituto Nacional de Excelencia Clínica (NICE) en el Reino Unido.
Muchos de estos criterios están definidos por la Conferencia Internacional sobre Armonización de los requisitos
técnicos para el registro de productos farmacéuticos para uso humano (ICH), p. Directrices Q5A sobre seguridad viral
y Q5D sobre derivación y caracterización [ICH, 2005]. Sin embargo, en un laboratorio de investigación académica, el
requisito puede estar menos definido y la obligación se deja a la conciencia individual. Sin embargo, el uso de líneas
celulares que no están validadas adecuadamente reduce la confiabilidad de la investigación y la probabilidad de que
cualquiera pueda repetirla (ver también la Sección 12.1.1).

Hay tres elementos principales para la validación:

(1) Autenticación. ¿Es la línea celular lo que se dice que es?

(2) Procedencia. ¿Cómo se derivó la línea celular y qué le sucedió a la línea celular desde su aislamiento original?

(3) Contaminación. ¿Está la línea celular libre de todas las formas conocidas de contaminación microbiana?

6.11.1 Autenticación

Hay varias técnicas disponibles para dar un perfil específico de la línea celular (ver Secciones 15.2, 15.4). La creación
de perfiles de ADN es probablemente la mejor, pero requiere que el ADN esté disponible del donante, o al menos de
una generación anterior de la línea celular conocida por ser auténtica en el momento en que se preservó. Los
perfiles de ADN también se pueden comparar con colecciones de referencia (generalmente a través de bancos de
células; ver Tabla 19.5) que, aunque pueden no establecer identidad, establecerán que la línea no está contaminada
de forma cruzada con otra línea celular conocida (ver también la Sección 12.1.1 ) De lo contrario, una compilación de
varias características confirmará el origen (especie, tejido, etc., ver Sección 15.4) más allá de toda duda razonable.
Debe recordarse que uno o más de los criterios que se usan pueden ser específicos del laboratorio en el que se usan
las células, suficiente para el propósito, pero no necesariamente transferible fácilmente a otro laboratorio. Lo
importante es que Se deben tomar algunas medidas para autenticar la línea celular antes de comprometer un gasto
importante de tiempo, esfuerzo y fondos.

6.11.2 Procedencia

Parte del proceso de validación requiere que haya un registro de cómo se aisló una línea celular y qué le ha sucedido
desde el aislamiento: regímenes de mantenimiento, controles de contaminación, procedimientos de
descontaminación si se usan, propiedades expresadas, modificación genética, alteraciones espontáneas, etc. . Un
conocimiento de la procedencia de la línea celular, derivado de la literatura publicada o de boca en boca de un
colega, habrá sido la razón para seleccionarla en primer lugar, pero debe documentarse de manera independiente y
agregarse a medida que avanza el trabajo con la célula. línea. Esto significa que se deben mantener registros
adecuados en todo momento (consulte las Secciones 11.3.1, 12.4.9, 19.3.8), que detallan el mantenimiento de
rutina, las observaciones experimentales significativas y el crioconservador. Esto no tiene que ser laborioso, ya que
el uso de una hoja de cálculo o una base de datos permitirá que se realice un nuevo registro de un procedimiento
repetido sin tener que volver a escribir todos los datos excepto la fecha y la que es nueva o ha cambiado. Una línea
celular con una procedencia detallada y completa gana valor como un mueble antiguo o una pintura.

6.11.3 Contaminación

Por detallados que sean sus registros o meticulosa su técnica experimental, el trabajo resultante carece de valor, o al
menos está muy comprometido, si se demuestra que la línea celular está contaminada con uno o más
microorganismos. Cuando la contaminación es evidente, no es un problema, ya que los cultivos se pueden descartar,
pero a menudo es críptico porque (1) las células se han mantenido en antibióticos (ver Sección 12.4.8), (2) pruebas
de rutina para organismos como el micoplasma no se ha llevado a cabo (consulte la Sección 18.3.2), o (3) no hay una
prueba de rutina disponible para el organismo, como es el caso de algunos virus o priones (consulte la Sección
18.3.7). Se puede evitar la contaminación (1) observando una técnica aséptica adecuada (ver Sección 5.1); (2)
obteniendo líneas celulares de una fuente debidamente validada, como un banco de células (ver Tabla 19.5); (3)
cultivando células en ausencia de antibióticos, aunque solo sea por una parte del tiempo (ver Sección 12.4.8 y Fig.
12.7); (4) mediante la detección periódica de micoplasma, es decir, mediante tinción con Hoechst 33258 para
detectar cualquier organismo que contenga ADN lo suficientemente grande como para resolverse con un
microscopio de fluorescencia (ver Protocolo 18.2); o (5) mediante la detección de los virus más comunes mediante
PCR o un contrato comercial. Las líneas celulares que se hayan validado correctamente deben almacenarse en
nitrógeno líquido y enviarse a los usuarios finales según sea necesario (consulte la Sección 19.5.1). Los usuarios
finales pueden almacenar sus propias existencias durante la duración de un proyecto; cuando estas existencias de
usuarios ya no se validan por completo, no se deben transmitir y los nuevos usuarios deben volver a las existencias
validadas.

También podría gustarte