CONVOCATORIA PARA PROYECTOS DE CIENCIA, TECNOLOGÍA E INNOVACIÓN

EN SALUD 744 - 2016

1. Título del proyecto

Dinámica espacio temporal y caracterización molecular de Escherichia coli y colifagos somáticos

aislados de muestras de agua del Lago Guamuéz (Nariño-Colombia)-Modelado matemático.

2. Lugar de ejecución

Municipio de San Juan de Pasto y Corregimiento el Encano, Departamento de Nariño.

3. Investigador principal y co-investigadores

1. Edith Mariela Burbano Rosero (IJ) –Investigadora Principal- Grupo Biotecnología

Microbiana-Grupo GIBIMMA
2. Eduardo Ibargüen Mondragón (IJ) -Co-Investigador- Grupo GIBIMMA
3. María de Lourdes Esteva Peralta (IS) -Co-Investigadora Departamento de Matemáticas,
Universidad Autónoma de México, DF.
4. Claudia Pio Ferreira -Co-Investigadora- Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Instituto de Biociências. Departamento de Bioestatística-SP-Brasil.
5. Noemi Nosomi Taniwaki -Coinvestigador- Seção de Microscopia Eletrônica-Instituto Adolfo
Lutz, São Paulo, SP-Brasil.
6. Sandra Patricia Bonilla – Co-investigadora- Universidad de Investigación de Tecnología
Experimental YACHAY, Ecuador.
7. Miller Orlando Cerón Gómez -Co-investigador Grupo GIBIMMA
8. Arsenio Hidalgo Troya - Co-investigador – Grupo
9. Pablo Fernández Izquierdo (IJ) - Co-investigador - Grupo Biotecnología Microbiana.
10. Jhonatan Pinta Melo - Co-investigador - Grupo Biotecnología Microbiana.
11. Deisy Lorena Guerrero - Co-investigador - Grupo Biotecnología Microbiana.
12. Patricia Molano -Co-Investigadora- Universidade de Campinas-SP, Brasil.
13. Maira Quiroz- Co-investigadora-Grupo de Biotecnología Microbiana.
14. Melissa Inguilan – Co-investigadora - Grupo GIBIMMA.
15. Monitores (NN) 2.

4. Conformación del equipo de investigación y perfiles

Grupo de Investigación en Biología Matemática y Matemática Aplicada GIBIMMA

(COL0126928). Categoría B.

1. Edith Mariela Burbano Rosero (Investigador principal - 15 Horas semanales) - Desarrollo de

estudios moleculares. Redacción de manuscritos científicos.
2. Eduardo Ibargüen (Co-investigador- 10 horas semanales) - Determinación variables –
Modelación matemática-Redacción de manuscritos científicos.
3. Miller Orlando Cerón Gómez-Co-investigador Grupo GIBIMMA Co-investigador 1 (Co-
investigador - 10 horas semanales) Modelamiento matemático.
4. Melissa Inguilán. (Co-Investigadora – 1 hora semanal). Análisis Bioinformático y
Programación matemática.
5. Estudiante 1 (Monitor - 20 horas).

50
Grupo de Investigación en Biotecnología Microbiana (COL0021327). Categoría B

1. Pablo Fernández Izquierdo (Co-investigador - 10 horas semanales) – Desarrollo de estudios

microbiológicos- Redacción de manuscritos científicos.
2. Co-investigador Jhonatan Pinta Melo (40 horas semanales). Estudios Moleculares.
3. Co-investigador Deisy Lorena Guerrero (40 horas semanales). Estudios Microbiológicos.
4. Co-investigador Maira Alejandra Quiroz (20 horas semanales). Estudios Microbiológicos.
5. Estudiante 1 (Monitor - 20 horas).

Grupo de Investigación Aplicado en Sistemas (GRIAS). Categoría C

1. Arsenio Hidalgo Troya (Co-investigador – 5 horas semanales)- Análisis estadístico.

Colaboradores Internacionales

1. María de Lourdes Esteva Peralta Co-Investigadora Departamento de Matemáticas,

Universidad Autónoma de México. Colaboración en el Modelado Matemático, EDPs y
EDOs, Teoría de control (1 hora semanal de asesoría )
2. Claudia Pio Ferreira- Co-Investigadora Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Instituto de Biociências. Departamento de Bioestatística. Colaboración en el
Modelado Matemático, Métodos numéricos, Autómatas Celulares, Redes neuronales, EDPs
y EDOs (1 hora semanal de asesoría)
3. Patricia Molano-Co-Investigadora Universidade Estadual de Campinas. Estudios de
Bioindicadores microbiológicos. (1 hora semanal)
4. Noemi Nosomi Taniwaki -Coinvestigador- Seção de Microscopia Eletrônica-Instituto Adolfo
Lutz, São Paulo, SP-Brasil. Dirección de estúdios em microscopia electronica. (1 hora
semanal de asesoría)
5. Sandra Patricia Bonilla. Universidad de Investigación de Tecnología Experimental
YACHAY, Ecuador. Estudio de parámetros fisicoquímicos- Modelado Matemático. (1 hora
semanal de asesoría).

5. Resumen ejecutivo

La contaminación de agua es uno de los mayores problemas de salud pública, principalmente en

áreas donde los sistemas de tratamiento de agua potable son insuficientes, esto genera problemas
de salubridad y enfermedades vehiculadas con el consumo de agua contaminada por residuos
tóxicos o patógenos.
Entre los principales factores que afectan la calidad de las fuentes de abasto de agua potable y los
ecosistemas acuáticos naturales se resalta la inadecuada disposición de desechos sólidos y
líquidos de origen doméstico, la presencia de altas concentraciones de materia orgánica y de
microorganismos patógenos, que ocasionan serios problemas a nivel ambiental y de salud; frente
a esta problemática, los organismos nacionales de sanidad ambiental realizan pruebas rutinarias
de laboratorio que permiten determinar la presencia y concentración de este tipo de
microorganismos en las diferentes fuentes de agua potable, residuales y de recreación. Sin
embargo, las pruebas en mención, no son frecuentes, no reflejan el potencial de infección real, ni
la presencia de genes que están asociados a factores de virulencia, en este sentido los grupos de
investigación internos y externos involucrados en esta propuesta, pretenden en ecosistemas
acuáticos de interés ecológico, social y comercial, como el Lago Guamuéz, proveer datos reales
sobre la presencia, la cuantificación, la variación espacio temporal y la variabilidad genética en

50
 cuanto a la amplificación de genes asociados a la virulencia de los bioindicadores de
contaminación antropogénica Escherichia coli y colifagos somáticos, con la finalidad de
acoplarlos a la formulación de un modelo matemático que explique la dinámica poblacional de
estos patógenos en el ambiente estudiado. Estos datos en un futuro próximo, pueden
complementarse para establecer sistemas de vigilancia epidemiológica, sistemas que infelizmente
son nulos en nuestra región.

Pregunta de investigación: En este estudio se plantea las siguientes preguntas:

¿Cuál es la dinámica espacio temporal de Escherichia coli y colifagos somáticos aislados de muestras
de agua del Lago Guamuez?

¿Cuál es la variabilidad genética de Escherichia coli y colifagos somáticos aislados de muestras de

agua del Lago Guamuez respecto a perfiles genéticos y amplificación de genes asociados a factores
de virulencia?

¿Cuál es la dinámica de formación de Escherichia coli y colifagos somáticos con relación a los
factores fisicoquímicos determinados en el área de estudio?

¿Cuál es la población de Escherichia coli y colifagos somáticos que amplifican genes asociados a
factores de virulencia?

6. Temática de investigación

Salud Ambiental.

7. Antecedentes y resultados previos del equipo de investigación solicitante en la temática

específica del proyecto

Con relación al estudio de microorganismos de interés médico, económico y ambiental se han

adelantado diversas investigaciones interdisciplinarias, entre las cuales se resaltan:

1. Modelamiento matemático con patógenos de interés en salud pública,

2. Interacciones moleculares en poblaciones celulares.

3. Análisis preliminar de la diversidad genética de bacterias productoras de

polihidroxialcanoatos (PHA) aisladas de la Laguna de la Cocha, Nariño.

4. Colifagos somáticos, indicadores potenciales de genes asociados a islas de patogenicidad.

5. Reducción del tamaño poblacional de la bacteria acumuladora de biopolímero (Aeromona

sp.), por infección de colifagos somáticos aislados del Lago Guamuéz, Nariño.

6. Estudio previo sobre la variabilidad genética de colifagos somáticos respecto a los genes
asociados a la virulencia a partir de muestras de agua del Lago Guamuez.

50
En lo concerniente al modelamiento matemático, el grupo de investigación en biomatemática y
matemática aplicada ha adelantado proyectos enfocados en la modelación matemática de la dinámica
de diferentes sistemas biológicos, entre estos estudios encontramos:

1. Un modelo matemático sobre la dinámica de Mycobacterium tuberculosis en el granuloma.

2. Mathematical modeling on bacterial resistance to multiple antibiotics caused by
spontaneous mutations.
3. A mathematical model for cellular immunology of tuberculosis.
4. Modelling the dynamics of dengue real epidemics.

Las alianzas colaborativas internacionales también tienen una amplia trayectoria investigativa, la cual
se evidencia en las siguientes publicaciones científicas:

1. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "Age-dependency in host-vector models: The

global analysis" . En: México. Applied Mathematics And Computation. ISSN: 0096-3003
ed: Elsevier. v.243 fasc. p. 969 - 981 ,2014

2. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "qualitative stdudy of transmission dynamics

of drug-resistant malaria". En: México. Mathematical And Computer Modelling ISSN:
0895-7177 ed: Pergamon Press. v.50 fasc. p.611 - 630 ,2009.

3. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, GUSTAVO CRUZ PACHECO,

CRISTOBAL VARGAS, "Vaccination Strategies for SIR Vector-Transmitted Diseases" . En:
México. Bulletin Of Mathematical Biology. ISSN: 0092-8240 ed: Springer. v.2 fasc. p.1 - 20
,2014.

4. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "On CTL Response against Mycobacterium

tuberculosis" . En: Colombia. Applied Mathematical Sciences. ISSN: 0066-5452 ed: v.8
fasc. p.2383 - 2389 ,2014.

5. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CP FERREIRA, "landscape diversity

influences dispersal and establishment of pest with complex nutritional ecology" . En: Brasil.
Bulletin Of Mathematical Biology. ISSN: 0092-8240 ed: Springer. v.76 fasc. p.1747 - 1761 ,
2014

6. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "En las interacciones de los sensibles y

resistentes de Mycobacterium tuberculosis a los antibióticos". En: Colombia. Mathematical
Biosciences. ISSN: 0025-5564 ed: v.246 fasc. p.34 - 93 ,2013.

7. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CRISTOBAL VARGAS, "Analysis of a

dengue disease transmission model" . En: Estados Unidos. Mathematical Biosciences And
Engineering. Mbe. ISSN: 1551-0018 ed: v.150 fasc.N/A p.131 - 151 ,1998.

8. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CRISTOBAL VARGAS, "Influence of

vertical and mechanical transmission on the dynamics of dengue disease." . En: Estados
Unidos Mathematical Biosciences And Engineering. Mbe. ISSN: 1551-0018 ed: v.167
fasc.n/A p.51 - 64 ,2000.

9. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, GUSTAVO CRUZ PACHECO, JA

MONTANO HIROSE, CRISTOBAL VARGAS, "Modelling the dynamics of West Nile

50
 Virus" . En: Inglaterra Bulletin Of Mathematical Biology. ISSN: 0092-8240 ed: Springer
v.67 fasc.N/A p.1157 - 1172 ,2005.

10. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "Mathematical model to assess the control of
Aedes aegypti mosquitoes by the sterile insect technique." . En: Estados Unidos
Mathematical Biosciences. ISSN: 1879-3134 ed: v.198 fasc.N/A p.132 - 147 ,2005.

11. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, RC THOME, "Optimal control of Aedes

aegypti mosquitoes by the sterile insect technique and insecticide." . En: Estados Unidos
Mathematical Biosciences. ISSN: 0025-5564 ed: v.223 fasc.N/A p.12 - 23 ,2010.

12. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CRISTOBAL VARGAS, "Coexistence of

different serotypes of dengue virus." . En: Inglaterra Journal Of Mathematical Biology.
ISSN: 1432-1416 ed: v.46 fasc.N/A p.31 - 47 ,2003.

13. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CP FERREIRA, PF MANCERA, WA

BOEGER, A OSTRENSKY, "Modelling the lethargic crab disease" . En: Inglaterra Journal
Of Biological Dynamics ISSN: 1751-3758 ed: v.3 fasc.N/A p.620 - 634 ,2010.

14. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, EDUARDO IBARGUEN MONDRAGON,

LESLIE CHAVES GALAN, "A MATHEMATICAL MODEL FOR CELLULAR
IMMUNOLOGY OF TUBERCULOSIS" . En: Estados Unidos. Mathematical Biosciences
And Engineering. Mbe ISSN: 1551-0018 ed: v.8 fasc.4 p.973 - 986 ,2011.

15. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, ST PINHO, CP FERREIRA, FR BARRETO,

VC MORATO E SILVA, MG TEIXEIRA, "Modelling the dynamics of dengue real
epidemics" . En: Estados Unidos. Philosophical Transactions Of The Royal Society A-
Mathematical Physical And Engineering Sciences. ISSN: 1471-2962 ed: v.368 fasc.N/A
p.5679 - 5693 ,2010.

16. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, J ALAVEZ RAMIREZ, JR

CASTELLANOS, JA FLORES, JL FUENTES ALLEN, GUILLERMO GOMEZ, G
GARCIA RAMOS, J LOPEZ ESTRADA, "Within-host population dynamics of antibiotic-
resistant M. tuberculosis". En: Inglaterra. Mathematical Medicine And Biology-A Journal Of
The Ima. ISSN: 1477-8599 ed: v.24 fasc.N/A p.35 - 56 ,2007.

17. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, GUSTAVO CRUZ PACHECO, A

MINZONI, M LOPEZ CERVANTES, P PANAYOTAROS, A AHUED ORTEGA, I
VILLASENOR RUIZ, "Modelling of the influenza A(H1N1)v outbreak in Mexico City,
April-May 2009, with control sanitary measures" . En: Inglaterra. Euro Surveillance :
Bulletin Européen Sur Les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease
Bulletin ISSN: 1560-7917 ed:
v.14 fasc.N/A p.1 - 10 ,2009.

18. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CRISTOBAL VARGAS, GUSTAVO CRUZ

PACHECO, "Seasonality and outbreaks in West Nile virus infection" . En: Inglaterra Bulletin
Of Mathematical Biology. ISSN: 0092-8240 ed: Springer. v.71 fasc.N/A p.1378 - 1393 ,
2009

50
19. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "Coexistence of different serotypes of dengue
virus." En: Inglaterra. Journal Of Mathematical Biology ISSN: 1432-1416 ed: v.46 fasc.N/A
p.31 - 47 ,2003.

20. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, CRISTOBAL VARGAS, "A model for
dengue disease with variable human population". . En: Inglaterra. Journal Of Mathematical
Biology. ISSN: 1432-1416. ed: v.38 fasc.N/A p.220 - 240 ,1999.

21. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, "Modelling parasitism and predation of

mosquitoes by water mites.". En: Inglaterra. Journal Of Mathematical Biology ISSN: 1432-
1416. ed: v.26 fasc.N/A p.540 - 555 ,2006.

22. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, RICARDO AVILA, PF MANCERA, CP

FERREIRA, "Traveling waves in the Lethargic Crab Disease". En: México Applied
Mathematics And Computation. ISSN: 0096-3003. ed: Elsevierv.218 fasc.19 p.9898 -
9910 ,2012.

23. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, GUSTAVO CRUZ PACHECO,

CRISTOBAL VARGAS, "Multi-species interactions in West Nile virus infection." . En:
México Journal Of Biological Dynamics. ISSN: 1751-3766 ed: v.6 fasc.N/A p.281 - 298 ,
2012.

24. MARIA DE LOURDES ESTEVA PERALTA, GUSTAVO CRUZ PACHECO,

CRISTOBAL VARGAS, "Control measures for Chagas disease." . En: México.
Mathematical Biosciences ISSN: 1879-3134 ed: v.1 fasc.2 p.49 - 60 ,2012.

25. FERREIRA, I. E. P. ; TRINCA, A. L. ; FERREIRA, C P . EFFICIENT EXPERIMENTAL

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27. FERREIRA, C.P.; ESTEVA, L. ; GODOY, W. A. C. ; CONSOLI, F. L. . Landscape

diversity influences dispersal and establishment of pest with complex nutritional ecology.
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28. GARCIA, A. G. ; GODOY, W. A. C. ; CONSOLI, F. L. ; FERREIRA, C.P. . A mathematical

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29. FERREIRA, I. E. P. ; MORAL, R. A. ; FERREIRA, C.P. ; GODOY, W. A. C. . Modelling

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50
 Citações:1

31. VILCHES, T. N. ; FERREIRA, C.P. . Um modelo para a dengue com influência sazonal
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32. ÁVILA, RICARDO P. ; MANCERA, PAULO F.A. ; ESTEVA, LOURDES ; PIE, MARCIO
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34. PINHO, S. ; FERREIRA, C.P. ; ESTEVA, L. ; BARRETO, F. R. ; MORATO, V. C. ;

TEIXEIRA, M. . Modelling the dynamics of dengue real epidemics. Philosophical
Transactions - Royal Society. Mathematical, Physical and Engineering Sciences (Print), v.
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35. SANCHES, R. P. ; FERREIRA, C.P. . Modelando a dispersão da doença do caranguejo

letárgico entre estuários. TEMA. Tendências em Matemática Aplicada e Computacional, v.
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36. FERREIRA, C.P.; PIE, M. R. ; ESTEVA, L. ; MANCERA, P. F. A. ; BOERGE, W. A. ;

OSTRENSKY, A. . Modelling the Lethargic Crab Disease. Journal of Biological Dynamics
(Print), v. 3, p. 620-634, 2009. Citações:2

37. LIMA, E. A. B. F. ; BERNARDES, A. M. ; FERREIRA, C.P. ; GODOY, W. A. C. .

Neighborhood Interactions and Larval Dispersal Behavior in Blowflies. Journal of Insect
Behavior, v. 22, p. 245-255, 2009. Citações:2|2

38. LIMA, E. A. B. F. ; FERREIRA, C.P. ; GODOY, W. A. C. . Ecological Modeling and Pest

Population Management: a Possible and Necessary Connection in a Changing World.
Neotropical Entomology (Impresso), v. 38, p. 699-707, 2009.Citações:4|7

39. YANG, H. M. ; FERREIRA, C.P. . Assessing the effects of vector control on dengue
transmission.. Applied Mathematics and Computation, v. 198, p. 401-413, 2008. Citações:18|
21

40. FERREIRA, C.P.; YANG, H. M. ; ESTEVA, L. . Assessing the Suitability of Sterile Insect
technique applied to Aedes Aegypti. Journal of Biological Systems, v. 16, p. 565-577, 2008.
Citações:7|7

41. SANTOS, R. M. Z. ; PINHO, S. ; FERREIRA, C.P. ; SILVA, P. C. . On the Study of the

Dynamic Aspects of Parasitemia in the Blood Cycle of Malaria. The European Physical
Journal. Special Topics, v. 143, p. 125-134, 2007. Citações:3|4

42. FERREIRA, C.P.; PULINO, P. ; YANG, H. M. ; TAKAHASHI, L. . Controlling dispersal

dynamics of aedes aegypti. Mathematical Population Studies, v. 13, p. 215-236, 2006.
Citações:6|8

50
43. DOMINGUEZ, G. Z. ; FERREIRA, C.P. ; VELASCO-HERNANDEZ, J. X. . Porosity and
tortuosity relations as reveled by a mathematical model fo biofilm structure. Journal of
Theoretical Biology, v. 233, n.2, p. 245-251, 2005. Citações:8|9

44. LUNA, E. ; DOMINGUEZ, G. Z. ; FERREIRA, C.P. ; VELASCO-HERNANDEZ, J. X. .

Detachment and diffusive-convective transport in an evolving heterogeneous two-
dimensional biofilm hibrid model. Physical Review E. (Cessou em 2000. Cont. 1539-3755
Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics), v. 70, n.6, p. 061909,
2004. Citações:5|6

45. YANG, H. M.; FERREIRA, C.P ; TERNES, S. . Dinâmica Populacional do Vetor

Transmissor da Dengue. TEMA. Tendências em Matemática Aplicada e Computacional, v. 4,
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46. FERREIRA, C.P.; YANG, H. M.. Estudo Dinâmico da população de mosquitos Aedes
aegypti. TEMA. Tendências em Matemática Aplicada e Computacional, v. 4, p. 187-196,
2003.

47. FERREIRA, C.P.; YANG, H. M. . Estudo da transmissão da dengue entre individuos em

interação com a população de mosquitos Aedes. TEMA. Tendências em Matemática
Aplicada e Computacional, v. 43, p. 323-332, 2003.

48. FERREIRA, C.P.; FONTANARI, J. F. . Nonequilibrium phase transitions in a model for the
origin of life. Physical Review E. (Cessou em 2000. Cont. 1539-3755 Physical Review. E,
Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics), v. 65, p. 021902-1, 2002. Citações:15|16

49. ROSAS, A. ; FERREIRA, C. P. ; FONTANARI, J. F. . Evolution of protein synthesis in a

lattice model of replicators. Physical Review Letters (Print), v. 89, p. 18810, 2002.
Citações:6

50. FERREIRA, C.P.; SANTOS, R. M. Z. ; FONTANARI, J. F. . Phase transitions in a model for

the formation of herpes simples ulcers. Physical Review E. (Cessou em 2000. Cont. 1539-
3755 Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics), v. 64, p. 041903-1,
2001.
Citações:4|4.

51. DE SOUZA FERREIRA, CLÁUDIA ; PENNACCHI, PAULA COMMUNE ; ARAÚJO,

TOMAZ HENRIQUE ; TANIWAKI, NOEMI NOSOMI ; DE ARAÚJO PAULA,
FERNANDA BORGES ; DA SILVEIRA DUARTE, STELLA MARIS ; RODRIGUES,
MARIA RITA . Aminoguanidine treatment increased NOX2 response in diabetic rats:
Improved phagocytosis and killing of Candida albicans by neutrophils. European Journal of
Pharmacology, v. 772, p. 83-91, 2016.

52. ROTTINI, M. M. ; AMARAL, A. C. F. ; FERREIRA, J. L. P. ; SILVA, J. T. A. ;

TANIWAKI, NOEMI N. ; SOUZA, C. S. F. ; DESCOFFIER, L. N. ; ALMEIDA-DE-
SOUZA, F. ; HARDOIN, D. J. ; COSTA, S. C. G. ; CALABRESE, K. S. . In vitro evaluation
of (-)alpha-bisabolol as a promising agent against Leishmania amazonensis. Experimental
Parasitology (Online), v. 148, p. 66-72, 2015.

53. SESSO, ANTONIO ; YAMASHIRO-KANASHIRO, EDITE HATSUMI ; ORII, NOEMIA

MIE ; TANIWAKI, NOEMI NOSOMI ; KAWAKAMI, JOYCE ; CARNEIRO, SYLVIA

50
 MENDES . LOOSE AND COMPACT AGGLOMERATES OF 50 NM MICROVESICLES
DERIVED FROM GOLGI AND ENDOPLASMIC RETICULUM MEMBRANES IN PRE-
AND IN -APOPTOTIC MYCOPLASMA INFECTED HELA CELLS: HOST-PARASITE
INTERACTIONS UNDER THE TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE. Revista
do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (Impresso), v. 57, p. 89-91, 2015.

54. COELHO, G. R. ; MENDONCA, R. Z. ; VILAR, K. S. ; FIGUEIREDO, C. A. ; BADARI, J.

C. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; NAMIYAMA, G. ; OLIVEIRA, M. I. ; CURTI, S. P. ;
SILVA, P. E. ; NEGRI, G. . Antiviral action of hydromethanolic extract of geopropolis from
Scaptotrigona postica against AntiHerpes Simplex Virus (HSV-1) s. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine (Online), v. 2015, p. 2015, 2015.

55. OKADA, S. S. ; OLIVEIRA, E. M. ; ARAUJO, T. H. ; RODRIGUES, M. R. ;

ALBUQUERQUE, R. C. ; MORTARA, R. A. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ;
NAKAYA, H. I. ; CAMPA, A. ; MORENO, A. R. M. . Mieloperoxidase in human peripheral
blood lymphocytes: Production and subcellular localization.. Cellular Immunology (Print), v.
2015, p. 1, 2015.

56. REIMÃO, JULIANA Q. ; MIGUEL, DANILO C. ; TANIWAKI, NOEMI N. ; TRINCONI,

CRISTIANA T. ; YOKOYAMA-YASUNAKA, JENICER K. U. ; ULIANA, SILVIA R. B. .
Antileishmanial Activity of the Estrogen Receptor Modulator Raloxifene. PLoS Neglected
Tropical Diseases (Online), v. 8, p. e2842, 2014.

57. TEIXEIRA, S. R. L. ; DEPIRO, T. T. S. ; PINHEIRO, E. T. ; SIMIONATO, M. R. L. ;

Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; KISIELIUS, J. J. ; MAYER, M. P. A. . Lineage variability
in surface components expression within Pophyromonas gingivalis. Microbial Pathogenesis,
v. 77, p. 100-104, 2014.

58. ARAUJO, T. H. ; OKADA, S. S. ; GHOSN, E. E. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ;

ALMEIDA, S. R. ; MORTARA, R. A. ; Russo M ; CAMPA, A. . Intracellular localization of
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Immunology (Print), v. 281, p. 27-30, 2013. Citações:6|5

59. MESQUITA, J. T. ; PINTO, E. G. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; Galisteo Jr AJ ;

TEMPONE, A. G. . Lethal action of the nitrothiazolyl-salicylamide derivative nitazoxamide
via inductionof oxidative stress in Leishmania (L) infantum.. Acta Tropica, v. 128, p. 666-
673, 2013. Citações:3|4

60. COLARES, A. V. ; SOUZA, F. A. ; TANIWAKI, NOEMI N. ; SOUZA, C. S. F. ; COSTA,

J. G. M. ; CALABRESE, K. S. ; ABREU-SILVA, A. L. . In Vitro Antileishmanial Activity
of Essential Oil of Vanillosmopsis arborea (Asteraceae) Baker. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine (Online), v. 2013, p. 727042, 2013. Citações:3|4

61. CORREA, D. S. ; TEMPONE, A. G. ; REIMAO, J. Q. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ;

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trypanosomal potential of polygodial isolated from stem barks of Drimys brasiliensis Miers
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62. Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N; GONCALVES, V. M. ; ROMERO, J. K. ; SILVA, C. V. ;

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50
 chronic phase of infection and after immunosuppression. Parasitology Research (1987. Print),
v. 109, p. 431-440, 2011. Citações:1|1

63. REIMAO, J. Q. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; TEMPONE, A. G. . Furazolidone is a

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64. TEMPONE, A. G. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; REIMAO, J. Q. . Antileishmanial

activity and ultrastructural alterations of Leishmania (L.) chagas treated with the calicium
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65. KOSUGA, M. H. ; NASCIMENTO, A. M. ; REIMAO, J. Q. ; TEMPONE, A. G. ; Taniwaki,

N. N. ou Taniwaki, N ; VELOSO, K. ; FERREIRA, A. G. ; CAVALCANTI BC ; PESSOA,
C. ; MORAES, M. O. ; MAYER, A. M. ; HAJDU, E. ; BERLINCK, R. G. . Antiparasitic,
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angulospiculatus collected in Brazil. Journal of Natural Products, v. 71, p. 334-339, 2008.
Citações:40|39

66. TEMPONE, A. G. ; Pimenta, DC ; LEBRUM, I. ; SARTORELLI, P. ; Taniwaki, N. N. ou

Taniwaki, N ; ANDRADE JR, H. F. ; ANTONIAZZI, M. M. ; JARED, C. . Antileishmanial
and antitrypanosomal activity of bufadienolides isolated from the toad Thinella jimi parotoid
macrogland secretion. Toxicon, v. 52, p. 13-21, 2008. Citações:44|45

67. Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N; SILVA, C. V. ; SILVA, S. ; MORTARA, R. A. .

Distribution of Trypanosoma cruzi stage-specific epitopes in cardiac muscle of Calomys
callosus, Balb/c mice, and cultured cells infected with different infective forms. Acta
Tropica, v. 103, p. 14-25, 2007. Citações:5|4

68. Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N; MACHADO, F. S. ; MASSENSINI, A. R. ; MORTARA,

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496, 2006. Citações:10|10

69. ANDREOLI, W. K. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; MORTARA, R. A. . Survival of

Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes within Coxiella burnetti vacuoles:
differentiation and replication within an acidic milieu. Microbes and Infection, Paris, v. 8,
n.1, p. 172-182, 2006. Citações:9|10

70. MORTARA, R. A. ; ANDREOLI, W. K. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; FERNANDES,

A. B. ; CV da Silva ; MCDCFernandes ; C L'Abbate ; SILVA, S. . Mammalian cell invasion
and intracellular trafficking by Trypanosoma cruzi infective forms. Anais da Academia
Brasileira de Ciências, Brasil, v. 77, n.1, p. 1-18, 2005. Citações:32

71. Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N; ANDREOLI, W. K. ; CALABRESE, K. S. ; SILVA, S. ;

MORTARA, R. A. . Disruption of myofibrillar proteins in cardiac muscle of Calomys
callosus chronically infected with Trypanosoma cruzi and treated with immunosuppressive
agent. Parasitology Research, Alemanha, v. 97, n.4, p. 323-331, 2005. Citações:7|8

72. CASTILHO, J. C. ; BOTELHO, M. V. J. ; LAURETTI, F. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki,

N ; LINHARES, R. ; NOZAWA, C. M. . The in vitro Cytopathology of a Porcine and the

50
 Simian (SA-11) strains of Rotavirus. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.
99, n.3, p. 313-317, 2004. Citações:6|7

73. ABRAHAO, D. S. ; PIZA, A. R. T. ; MARTINS, M. A. ; SILVA, J. C. ; FERREIRA, E. C. ;

RAPADO, L. N. ; HOSODA, T. M. ; SILVA, R. C. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ;
PIRES, M. F. C. . Estudo comparativo com diversos fixadores para aplicação em microscopia
eletrônica de transmissão. Revista do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v. 63, n.2, p. 248-254,
2004. Citações:1

74. MORTARA, R. A. ; SILVA, S. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N . Confocal fluorescence

microscopy: a powerful tool in the study of Chagas'disease. Revista da Sociedade Brasileira
de Medicina Tropical, Minas Gerais, v. 33, n.01, p. 79-82, 2000. Citações:6|4

75. Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N; KATCHBURIAN, E. . Ultrastructural and lanthanum tracer

examination of rapidly resorbing rat alveolar bone suggests that osteoclasts internalize dying
bone cells. Cell and Tissue Research, Heidelberg, v. 293, p. 173-176, 1998. Citações:10|11

76. TOLEDO, O. M. S. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; SALDIVA, P. H. N. ; MONTES, G.

S. . Effect of aqueous and nonaqueous fixatives on the quantitative estimation of collagen-
proteoglycan interaction in tissue sections. Biotechnic & Histochemistry, v. 71, n.3, p. 109-
114, 1996. Citações:2|4

77. RODRIGUES, C. J. ; OLIVEIRA, R. M. ; Taniwaki, N. N. ou Taniwaki, N ; BUENO, C. ;

MARCHIORI, P. ; COSSERMELLI, W. . Epidermal nuclear immunoglobulin deposition in
connective tissue diseases. Revista do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
São Paulo, São Paulo, v. 45, n.04, p. 154-157, 1990. Citações:3

Finalmente, el grupo de Biotecnología Microbiana ha adelantado proyectos orientados a la evaluación

de microorganismos presentes en ecosistemas acuáticos en colaboración con o Instituto de Ciências
Biomédicas-Universidade de São Paulo. Laboratório de Ecologia Microbiana Molecular e o
Instituto Adolfo Lutz, SP-Brasil, entre los trabajos realizados con algunos de nuestros
investigadores, sobresalen:

1. Caracterización molecular de bacterias silvestres reductoras de Cr (VI) a Cr (III) aisladas de

efluentes contaminados con metales pesados.
2. Caracterización de colifagos somáticos marinos aislados de tres ecosistemas con diferente
actividad antropogénica.
3. Characterization of Vibrio isolated from seawater, plankton and oysters samples of the
Coastal Region of São Paulo, Brazil.
4. Detection of the genes that ecode thermolabil (LT) and thermoestable toxins (ST) in somatic
coliphages isolated from three Coastal Regions with different level of anthropogenic activity.
5. Bacterial diversity from coastal regions.
6. Phylogenetic diversity of chitinolytic bacteria isolated from plankton samples collected in
three marine ecosystems of Sao Paulo State, Brazil.
7. Marine bacterial communities along the São Paulo Coast in Brazil.

Por lo anteriormente expuesto, los grupos desde sus enfoques de trabajo, aportarían datos que
mejorarían las condiciones de vida de las poblaciones aledañas al corregimiento del Encano, como
también al resto de la población, ya que el recurso agua, propiedad de todos, estará siendo foco de
uso sostenible y vigilancia epidemiológica.

50
8. Palabras clave

Escherichia coli, colifagos somáticos, calidad de agua, variabilidad genética, factores de virulencia,
Lago Guamuéz, modelamiento matemático, variación espacio-temporal, dinámica poblacional.

9. Planteamiento del problema

El Lago Guamuez es un centro estratégico de diversidad en el Departamento de Nariño, es rico en

especies, genes y recursos hídricos, su principal fuente económica son las actividades generadas por
el uso del agua, en mayor medida para la producción de la especie Oncorhynchus mykiss (trucha
arcoíris), que por su alta demanda comercial, ha ocasionado un gran impacto ecológico, tanto por la
adaptación de jaulas que funcionan como criaderos, como también por la descarga de excretas
humanas y de ganado, ocasionando de forma directa el deterioro de la calidad de las aguas y
generando un grave problema de contaminación hídrica (Rivas, 2004). El recurso agua en la
población, es también direccionado para el consumo animal y adicionalmente, como riego para los
alimentos como frutas y hortalizas que se cultivan en esta zona; estas actividades pueden estar
ocasionando la transmisión de patógenos en los cultivos y consecuentemente, pueden estar vinculadas
con la producción de infecciones en los humanos, ya que la vía fecal-oral es de consideración
importante por la presencia de los criaderos que conllevan al asentamiento de restaurantes cerca de
los lugares de producción. La población que habita en el corregimiento de El Encano, departamento
de Nariño-Colombia, presenta problemas relacionados con esa contaminación antropogénica, reportes
de la Secretaria de Salud de Pasto (2014), referencian un alto índice de enfermedades
gastroinstestinales vinculadas con el uso del recurso hídrico y la alimentación como causa de
morbilidad en todas las edades.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Fondo de las Naciones Unidas para la
Infancia (UNICEF), alrededor del 18% de la mortalidad en menores de cinco años es resultado de
enfermedades diarreicas agudas, este hecho ocurre principalmente en los países en desarrollo, por el
mal estado de saneamiento de las fuentes de abastecimiento de agua (Gastroenterología
Latinoamericana, 2013).

El mal manejo e inadecuada disposición de los desechos sólidos y líquidos generados a partir de las
diferentes actividades antropogénicas (Agricultura 70%, Industria 20%, Uso doméstico 6% y Otros
4%) son la principal causa de contaminación vinculada. En el caso específico de la contaminación de
origen doméstico, el mayor riesgo se encuentra en las altas concentraciones de materia orgánica y
microorganismos patógenos que pueden difundirse a través del agua, generando serios problemas a
nivel ambiental y de salud. Los principales agentes biológicos involucrados en la transmisión de
enfermedades de vehiculación hídrica son los virus, protozoos y las bacterias (Arcos, Ávila,
Estupiñan & Gómez, 2005; Romeu , Lugo y Rojas, 2011).

El gobierno departamental de Nariño ha incentivado políticas para mejorar la calidad de vida de esta
población, no obstante, aún no son claras las acciones ni las estrategias que el gobierno asumirá para
minimizar el impacto de las actividades humanas. Un ejemplo de ello, es el acuerdo de
competitividad del sector piscícola de Nariño, el cual se encuentra enmarcado dentro de las políticas
del Plan de Desarrollo Nacional bajo los lineamientos de una política de construcción de región con
el empoderamiento de las comunidades que generan su sustento e ingresos de la piscicultura,
teniendo en cuenta un desarrollo sostenible con aprovechamiento racional de los recursos naturales,
plan que no tiene un direccionamiento ni las vías para lograr el desarrollo sostenible. Dentro de las
iniciativas de impacto social del sector agropecuario elaboradas por el Ministerio de Agricultura y
Desarrollo Rural, está priorizada la actividad piscícola, las proyecciones esperadas son tendientes a la

50
fuente de generación de ingresos, empleo rural alternativo, seguridad alimentaria y crecimiento, tanto
en mercados Nacionales como Internacionales (Acuerdo de Competitividad de la Cadena Piscícola en
el Departamento de Nariño, 2010). Pese a todo este marco legal, las entidades como el Ministerio de
Medio Ambiente y la Corporación Autónoma Regional de Nariño (CORPONARIÑO), autoridades
ambientales del departamento, admiten no tener políticas de seguimiento ante los graves problemas
de contaminación del lago, todavía no se cuenta con planes de contingencia, ni de monitoreo
ambiental, mucho menos de manuales de vigilancia epidemiológica, y como siempre, una de las
causas más relevantes de ello es el vacío de conocimiento en la región, sobre la inocuidad hídrica y
alimentaria.

Como vía de control en el Lago Guamuez, las entidades ambientales ocasionalmente realizan pruebas
a nivel de laboratorio que permiten estimar la presencia y la concentración de microorganismos
patógenos, usados como indicadores microbiológicos (Coliformes, y coliformes termo-tolerantes)
para el control de aguas potables, residuales y de recreación, pero no se hacen estudios minuciosos
sobre otros indicadores y sobre los genes que estos microorganismos pueden estar vinculando con su
proliferación.
Teniendo en cuenta, que los análisis de coliformes y coliformes termo-tolerantes se basan en el
recuento de UFC/mL y con base en los valores aceptables para esta y otras características físicas y
químicas contempladas en la Resolución 2115 de 2007, se calcula el índice de riesgo del agua para
consumo humano (IRCA), es evidente que estos resultados no reflejan el potencial de infección real
de las aguas, ya que, enterobacterias como E coli tienen la capacidad de causar enfermedades
entéricas y diversos tipos de infecciones intra y extraintestinales en humanos y animales ( Touchon,
Hoede, Tenaillon, Barbe, Baeriswyl, Bidet, Denamur, Bonacorsi, 2009).

Adicionalmente, hasta la fecha, son muy escasos los estudios orientados a la detección de
bioindicadores de contaminación antropogénica, los pocos que se han realizado se han enfocado en la
detección de coliformes, sin existir estudios consolidados sobre la detección de bioindicadores como
colifagos somáticos, tampoco existen reportes representativos dirigidos a la amplificación de genes
involucrados en islas de patogenicidad que otorgan a las poblaciones microbianas, sobrevivencia y
dispersión por la adquisición de genes exógenos. Por consiguiente, el estudio de la variación espacio
temporal, la caracterización morfológica, la determinación de la variabilidad genética y la
amplificación de genes asociados a islas de patogenicidad de los colifagos somáticos y Escherichia
coli, la formulación de un modelo de la dinámica poblacional de estos patógenos se tornará en una
aproximación relevante y prioritaria para establecer el verdadero panorama de contaminación que
está afectando al Lago Guamuez en su zona de estudio, así mismo como las medidas de control que
podrán asumirse desde un contexto científico y aproximado a la realidad.

10. Marco conceptual

10.1 Enfermedades de transmisión hídrica

En el mundo científico cada vez es más claro que “No podremos acabar con ciertas enfermedades del
mundo hasta que no hayamos ganado la batalla del agua potable y del saneamiento” (OMS, 2012).El
Programa de Naciones Unidas para el Desarrollo (PNUD) establece que el agua desempeña un papel
fundamental en el desarrollo sostenible, incluida la reducción de la pobreza. Y por esta razón la
gestión de los recursos hídricos adquiere una enorme relevancia.
Los patógenos trasmitidos por el agua tienen un gran impacto socioeconómico tanto en países
desarrollados como en desarrollo, dicho impacto es de mayor magnitud en las regiones del mundo
con ambientes altamente contaminados (FAO, 2006).

50
Una gestión sostenible del agua implica atender las demandas de agua y también proteger las aguas
superficiales y subterráneas para que alcancen un buen estado. Un modelo de gestión sostenible
fomenta el ahorro de agua, asegura que el agua se devuelve al medio ambiente con la calidad
adecuada y garantiza el suministro de la demanda mediante fuentes alternativas de agua (FAO, 2006).

Actualmente, y a pesar de los avances científicos y tecnológicos, en el mundo más de 1.000 millones
de personas no tienen acceso al agua potable y pasan hambre de forma crónica. En contrapartida
1.400 millones de personas sufren de sobrepeso. Y más de 2.500 millones de personas no disponen de
saneamiento adecuado (letrinas apropiadas, alcantarillado, etc.).
Como datos actuales, el 85% de las enfermedades del tercer mundo se deben a la mala calidad del
agua. La crisis mundial del agua provoca más de 2 millones de muertes infantiles al año por diarreas.
Cada año mueren millones de animales y se pierde el 25% de la superficie agrícola sembrada por
efecto de las sequías y las inundaciones. Éstas cifras no van acordes al derecho humano al agua
establecido por las Naciones Unidas que otorga el derecho al agua en cantidad y calidad para todas
las personas. A día de hoy existe incertidumbre del impacto del cambio climático en la disponibilidad
del agua (Babiano-Amelibia, 2016).

Las infecciones intestinales que resultan de la exposición a aguas potables y recreativas contaminadas
han sido reportadas ampliamente. Se estima que casi un cuarto de las camillas en los hospitales en el
mundo está ocupada por pacientes que presentan complicaciones derivadas de infecciones causadas
por microorganismos entéricos. Los microorganismos de mayor importancia en la transmisión de
enfermedades vehiculadas por el agua, se derivan de residuos fecales humanos; su número y
distribución en las aguas residuales contaminadas dependen tanto de la carga de las enfermedades en
la población y de la disponibilidad de tratamiento de las aguas residuales (Rodríguez-Díaz, 2009).

Una forma de detectar el grado de contaminación fecal del agua, es mediante el uso del grupo de las
bacterias coliformes, ya que su detección es rápida y sencilla; los microorganismos que lo conforman
son, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Edwarsiella, Citrobacter y Escherichia, viven como
saprófitos independientes o como bacterias intestinales. Todos pertenecen a la familia
enterobacteriaceae, son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados y
constituyen aproximadamente el 10% de los microorganismos intestinales de los seres humanos y
otros animales. Su capacidad de reproducción fuera del intestino es favorecida por la existencia de
condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad, así como por su versatilidad de
proliferación (Miagostovich, Ferreira, Guimarãe, Fumian, Diniz-Mendes, Luz, Silva, Leite, 2008).

Estos microorganismos pueden causar enfermedades con diferentes niveles de gravedad, desde una
gastroenteritis simple hasta cuadros graves de diarrea, fiebre tifoidea o hepatitis. Los potenciales
problemas de salud pública asociados con la contaminación de organismos patógenos en las
descargas de aguas residuales tratadas y no tratadas en las cuencas receptoras, se ha convertido en
uno de los mayores problemas que se afronta; en este sentido se ha determinado que una de las
enfermedades que ha tomado mayor importancia a nivel mundial es la diarrea, ocupa el tercer lugar
entre las causas de muerte que afecta a los niños menores de 5 años, y representa el 18% de todas las
muertes. Adicionalmente, se estima que 1,5 mil millones de episodios ocurren cada año, la mayoría
de los casos causados por la presencia de bacterias entéricas como Escherichia coli (Miagostovich,
Ferreira, Guimarães, Fumian, Diniz-Mendes, Luz, Silva, Leite, 2008).

10.2 Bioindicadores de la calidad de agua

Es importante destacar que cada vez es más frecuente que las enfermedades de origen hídrico, estén
relacionadas con la presencia de microorganismos emergentes y reemergentes. Las enfermedades

50
emergentes son aquellas cuya incidencia en los seres humanos ha aumentado en las dos últimas
décadas; dengue, cólera (Arcos, Ávila, Estupiñan & Gómez, 2005). Las enfermedades reemergentes
son las que reaparecen después de una disminución significativa en su incidencia; malaria,
tuberculosis, peste. El aumento de este tipo de microorganismos está relacionado con cambios
drásticos en el ambiente y en la población aumentados por los procesos de urbanización, la expansión
de la pobreza, la ocupación de regiones no habitadas anteriormente, las migraciones no controladas
con gran número de refugiados y desplazados, la facilidad y rapidez en los desplazamientos y el
movimiento creciente de animales y de productos de origen animal. A esto se suma que la resistencia
a los agentes antimicrobianos continúa reduciendo la eficacia de los medicamentos incrementando los
niveles de mortalidad y de costos sanitarios. Este grupo de microorganismos no está limitado a
ninguna región en el mundo ni se circunscribe a países en desarrollo o desarrollados; representa una
amenaza general, que exige una respuesta coordinada de los servicios de salud de todos los países.
Asimismo, constituyen una carga financiera que obliga a gastos enormes para el control de brotes
epidémicos y la atención médica y de salud pública (OMS, 2012).
Determinar el tipo de microorganismos presentes en el agua y su concentración proporciona
herramientas indispensables para conocer la calidad de la misma y para la toma de decisiones en
relación al control de vertidos, tratamiento de aguas y conservación de ecosistemas, evitando así el
riesgo de contaminación de las personas y el ambiente (Arcos, Ávila, Estupiñan & Gómez, 2005).

No obstante, existe una gran dificultad para determinar la presencia de todos los microorganismos
patógenos implicados en los procesos de contaminación ambiental. Dicha determinación implica
costos elevados, tiempo, y laboratorios especializados. Frente a estas dificultades y a la necesidad de
hacer una evaluación rápida y fiable de la presencia de patógenos en el agua, se ha planteado la
necesidad de trabajar con determinados grupos indicadores (Arcos, Ávila, Estupiñan & Gómez,
2005)
Los microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a los
patógenos, concentración y reacción frente a factores ambientales, pero son más fáciles, rápidos y
económicos de identificar. Una vez se ha demostrado la presencia de grupos indicadores, se puede
inferir que los patógenos se encuentran presentes en la misma concentración y que su
comportamiento frente a diferentes factores como pH, temperatura, presencia de nutrientes, tiempo de
retención hidráulica o sistemas de desinfección es similar a la del indicador.
Un microorganismo indicador de contaminación fecal debe reunir las siguientes características
(Fernández, Molina, Álvarez, Alc·ntara, Espigares, 2001)

- Ser un constituyente normal de la microbiota intestinal de individuos sanos.

- Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotérmicos.
- Estar presente cuando los microorganismos patógenos intestinales lo están.
- Presentarse en número elevado, facilitando su aislamiento e identificación.
- Debe ser incapaz de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos.
- Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las bacterias patógenas, su
resistencia a los factores ambientales debe ser igual o superior al de los patógenos de origen fecal.
- Debe ser fácil de aislar y cuantificar.

10.2.1 Escherichia coli

Es una bacteria Gram negativa cilíndrica con 1,1 – 1,5 µm de diámetro por 2,0 – 6,0 µm de largo que
se dispone aislada o en parejas. Conforme a la definición general de la familia Enterobacteriaceae a
la que pertenece, es una bacteria quimioheterótrofa facultativa teniendo metabolismo fermentativo y
respiratorio, no forma esporas, están desprovistas de oxidasa, producen catalasa y β-galactosidasa,
pueden ser móviles por flagelos peritricos o inmóviles y normalmente reducen nitrato a nitrito. El
género Escherichia comprende cinco especies distintas, E. coli, E. hermanni, E. fergusonii, E.

50
vulneris y E. blattae. La especie tipo es E. coli, además es la única de importancia epidemiológica.
No obstante, en algunos casos se reporta que E. hermanii y E. vulneris provocan infecciones en
heridas (Albertini, 2009).

E. coli es un microorganismo facultativo, que se puede encontrar en el tracto gastrointestinal de los

animales de sangre caliente en pequeña proporción en relación al contenido total de bacterias en este
sitio anatómico; por lo cual es utilizada como indicador de contaminación fecal. La Familia
Enterobacteriaceae es parte del animal normal y microbiota entérica humana. Según Dufour (1984),
la concentración de E. coli en heces de seres humanos varía de 106 - 109 / g; sin embargo, las cepas de
E. coli, han sido asociadas con infecciones severas en vías urinarias, septicemia, meningitis neonatal,
síndrome urémico hemolítico y diarrea (Albertini, 2009).

Clases de E. coli diarreicas

Existen algunos patotipos de E. coli que han adquirido factores virulentos específicos que confieren
la capacidad de adaptarse a nuevos nichos, causando un amplio espectro de enfermedades entéricas ó
diarrea, infecciones en el tracto urinario y sepsis ó meningitis; en relación a esto se ha determinado
que cinco tipos de E. coli actúan como agentes de diarrea en humanos, entre estas encontramos a E.
coli enteroagregativa (CEEA), E. coli enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroinvasiva (EIEC), E.
coli (EPEC) y E. coli enterotoxigénica (ETEC) ( Zambrano, 2012).

E. coli enteroagregativa (EAEC)

Las cepas de Escherichia coli enteroagregativa (CEEA) están bien caracterizadas, ya que se ha
determinado que no secretan enterotoxinas LT y ST y forman un patrón de adhesión de agregación
cuando se asocian con células HEp-2 y células HeLa. El patrón de adhesión de agregación (AA) de
las cepas EAEC está mediada por fimbrias "Adherencia de agregación" (AAS) y factores de
adherencia. Adicionalmente, se ha determinado que la enterotoxina termoestable llamada
"enteroagregativa E. coli estable al calor enterotoxina 1" se encuentra en esta cepa y puede inducir
el aumento en la concentración de cGMP intracelular (Albertini, 2009).

Cepas de EAEC están asociadas con casos de diarrea en niños, estas son capaces de adherirse a la
mucosa del intestino de niños y adultos y parecen estar relacionadas con casos crónicos de diarrea
(diarrea prolongada), durante al menos 14 días con sangre por lo menos en el 11% de los casos. Uno
de los métodos de detección de la CEEA es el ensayo de adhesión de las células HEp2, que muestra
el patrón característico de la adhesión de agregación (AA) recordando a la disposición de ladrillos
apilados (Albertini, 2009).

E. coli enterohemorrágica (EHEC)

Las cepas de E. coli enterohemorrágica (EHEC) serotipo O157 específicamente: H7, provocan
diarrea y son causa importante de enfermedades entéricas y renales en seres humanos, al respecto se
han descrito en diferentes especies de animales, especialmente en bovinos; sin embargo, los
serogrupos enterohemorrágicos O26: H11, O111: H8, O103: H2, O113: H21 y O104: 21 se han
aislado en otras especies (Michanie, 2003). Las epidemias y enfermedades endémicas causadas por
E. coli enterohemorrágica, en su mayoría se asocia con el consumo de carne picada cocida u otros
derivados de la carne, así como leche y zumos de frutas crudos contaminados con heces del ganado.

La infección causada por cepas de E. coli O157 enterohemorrágica: H7, según varios autores, pueden
desencadenar un cuadro de enfermedad púrpura trombótica trombocitopénica (PTT), caracterizada
por microangiopatía hemolítica, trombocitopenia, anemia, manifestaciones neurológicas,

50
insuficiencia renal y fiebre. Actualmente, dos clases de toxina Shiga se han identificado, la toxina
Shiga 01 (Stx1) y Shiga Toxina 02 (Stx2) (Bosilevac & Koohmaraie, 2011). Cada toxina consiste en
una subunidad A (35 KDa) y cinco subunidades B (10,7 kDa) (Albertini, 2009).

E. coli enteroinvasiva (EIEC)

En 1987 Levine, destacó la importancia de E. coli enteroinvasiva (EIEC) como agente causal de la
diarrea en los países en desarrollo y que puede causar un marco similar a la disentería clínica causada
por Shigella spp. Generalmente, E. coli Enteroinvasiva incluye un grupo relativamente pequeño de
serogrupos, en particular: O28, O29, O112, O121, O124, O135, O136, O143, O144, O152, O164,
O167 y O173 (Rúgeles, Bai, Martínez, Vanegas & Gómez-Duarte, 2010). Cepas EIEC y Shigella son
similares bioquímicamente y antigénicamente, sin embargo, la principal diferencia entre ellos está
relacionado con el potencial patógenico que causa la enfermedad, es decir se ha determinado que
EIEC requiere por encima de 109 células y Shigella menos de 103células. Para la detección de EIEC
se utiliza la prueba de Sereny (Albertini, 2009).

E. coli Enteropatogénica (EPEC)

Las cepas de E. coli (EPEC) ha sido una de las principales causas de diarrea aguda en niños
provenientes de países en desarrollo, se asocia con frecuencia con casos de diarrea persistente (Kaper
J, 2005). Sin embargo, muchos adultos considerados portadores de la cepa no presentan síntomas de
la enfermedad, lo que conlleva a pensar que la inmunidad adquirida se produce con el paso del
tiempo (Meng, Feng & Doyle, 2001). En general, la prevalencia de muertes es mayor del 30%,
cuando la diarrea es causada por EPEC.

E. coli enteropatógena incluye un grupo relativamente pequeño de serogrupos. Los principales

serotipos EPEC involucrados en enfermedades humanas son: O55: H6, O86: H34, O111: H2, O114:
H2, O119: H6, O126: H2, O127: H6, O128: H2 y 0142: H6. Cepas EPEC clásicas son portadores del
gen eaeA, ubicado en una isla de patogenicidad, conocido como "locus de esfacelamiento de
enterocito" (LEE) y son negativos para las toxinas Shiga, LT y ST. El gen eaeA, codifica para una
proteína de 94 KDa llamada intimina, la que facilita la adherencia del organismo a la célula epitelial
y es responsable de la lesión de la íntima adherencia "adhesión y esfalecensia" (A / E); los
determinantes genéticos responsables de la producción de la lesión A / E. A diferencia de la mayoría
de cepas de EPEC típicas, las cepas EPEC atípicas no presentan el plásmido EAF (“ Factor EPEC de
Adherencia”) y expresan factores de virulencia que no están codificados en la región LEE (Albertini,
2009).

E. coli enterotoxigénica (ETEC)

La ETEC es uno de los patotipos más estudiados, asociado con morbilidad infantil, en los adultos
puede ser asintomática, poco frecuente o puede provocar la denominada diarrea del viajero. Los
principales síntomas de la ETEC son: diarrea acuosa, dolor abdominal, náuseas y vómitos; la ETEC
coloniza la superficie de la mucosa del intestino delgado y secreta dos enterotoxinas, la toxina termo-
lábil LT y aquella termo-estable ST; provocando inhibición de la absorción del sodio y secreción
estimulada del ion cloro lo que hace que sea acuosa. La colonización es inmediata por una o más
fimbrias o factores de colonización fibrilar (Zambrano, 2012).

La Toxina termolábil, está codificada por cromosomas, son oligoméricas, están relacionadas con la
enterotoxina del cólera, por que comparten algunas características como: la estructura de la
holotoxina, secuencia proteica, identificación del receptor primario, y actividad enzimática. La termo-

50
lábil LTI está asociada a enfermedades de humanos y animales y LTII solo en animales. LLTI: es una
toxina oligomérica de 86 KDa compuesta de una subunidad A de 28 KDa y cinco idénticas
subunidades de 11.5 KDa. La enterotoxina LT aumenta el nivel intracelular de monofosfato
adenosina cíclico cAMP, provocando que se abran los canales de cloro y exista una reducción de la
absorción del NaCl, como resultado se dará una diarrea osmótica (Zambrano, 2012).

Aislamiento e identificación

En condiciones aerobias, la bacteria crece aproximadamente a una temperatura de 37ºC, por lo

general se siembran en un agar selectivo como MacConkey. La identificación de cepas de E. coli
patógenas, debe realizarse en casos de diarrea persistente, especialmente en viajeros, niños y personas
inmunodeprimidas, así como en brotes diarreicos (Zambrano, 2012).Su identificación puede ser por
reacciones bioquímicas: oxidasa negativa, fermentadora de glucosa, lactosa y sacarosa, positiva al
indol, descarboxilasa de la lisina, fermentación de manitol y gas a partir de glucosa, su pH óptimo es
de 6.0-7.0. El 90% de E. coli son lactosa positiva, sin embargo, existen algunas cepas patógenas,
incluyendo ciertas E. coli enteroinvasivas que son lactosa negativa (Zambrano, 2012).

10.2.2 Bacteriófagos

Los Virus a diferencia de las bacterias, no se encuentran normalmente en las heces del hombre, están
presentes en el tracto gastrointestinal, de individuos que han sido afectados. Más de 140 virus
patógenos entéricos pueden ser transmitidos al hombre a través del agua, cuando son eliminados de
las heces de personas infectadas. Los más comunes son los virus causantes de gastroenteritis y el
virus de la hepatitis. Algunos de estos virus, rotavirus, virus Norwalk, no generan una inmunidad
protectora a largo plazo por lo que la infección puede repetirse varias veces durante la vida. El
poliovirus ha sido propuesto como indicador viral, sin embargo, las cantidades de este virus
encontradas en ambientes acuáticos son demasiado variables como para que sea considerado un buen
indicador. Además de estas variaciones, la detección de virus entéricos requiere laboratorios
especializados y los resultados demandan mucho tiempo.
Estas dificultades en el uso de los enterovirus como indicadores de contaminación, han llevado a la
búsqueda de indicadores alternativos que sean rápida y fácilmente detectables. Entre los cuales se han
propuesto a los colifagos somáticos y a los colifagos F-específicos, por las siguientes razones: Los
fagos se encuentran abundantemente tanto en agua residual como en agua contaminada; las
poblaciones de colifagos son mucho más grandes que las de los enterovirus; los colifagos no pueden
reproducirse fuera del hospedero bacteriano, se pueden aislar y contar por métodos sencillos.
Adicionalmente, se obtienen resultados más rápidos cuando se analizan estos indicadores (Burbano-
Rosero, 2009).

Cuando las condiciones ambientales son desfavorables, los coliformes fecales no son buenos
indicadores de contaminación fecal, ya que desaparecen rápidamente, por consiguiente, es mejor usar
microorganismos más resistentes, como los colifagos que reflejan los niveles de contaminación
(Burbano-Rosero, 2009).

La denominación de los fagos se relaciona directamente con la célula hospedera infectada. Así, el
nombre de colifagos es dado por su capacidad de infectar a la bacteria Escherichia coli. Los
colifagos se dividen en dos grupos principales: colifagos somáticos y colifagos de RNA F-
específicos. Estos se diferencian por la vía de infección. Los colifagos de RNA F-específicos inician
la infección uniéndose a las fimbrias de fertilidad (fimbrias F- o sexuales) de la bacteria hospedera,

50
estas fimbrias son producidas exclusivamente por las bacterias portadoras del plásmido de fertilidad
(F); mientras que en el caso de los colifagos somáticos, la infección se inicia por la unión a receptores
ubicados permanentemente en la pared celular de los hospederos; suelen replicarse en el aparato
digestivo de los animales de sangre caliente, pero también pueden hacerlo en medios acuáticos, es así
como los colifagos al igual que su célula hospedera E. coli se han convertido en uno de los mejores
indicadores de contaminación antropogénica del agua (Wok, 2001; Díaz, 2006).

Relaciones ecológicas entre colifagos somáticos y células hospederas.

La comprensión de cómo las interacciones entre las especies afectan a la estructura y dinámica
espacio-temporal de las poblaciones y comunidades biológicas es un objetivo fundamental dentro de
la ecología de comunidades. Cuando se descubrió que la concentración de bacteriófagos en aguas
naturales no contaminadas se encontraba en hasta 2,5 x 10 8 partículas de virus por mililitro, se
comprendió la importancia de estudiarlos, ya que estas concentraciones indican que la infección por
virus puede ser un factor importante en el control ecológico de microorganismos planctónicos, y que
los virus podrían mediar el intercambio genético entre bacterias en ambientes acuáticos naturales
(Brezina & Baldini, 2008).

Para determinar el efecto de los bacteriófagos en la mortalidad bacteriana se ha utilizado una variedad
de enfoques, incluido el recuento de bacterias visiblemente infectadas, la eliminación de las partículas
virales, la decadencia de la infectividad viral, y las mediciones de las tasas de producción virales, al
igual que la tasa de mortalidad de células afectadas. Suttle (2005) afirma que los “cyanophages” son
responsables de la eliminación de aproximadamente el 3% de Synechococcus marina sobre una base
diaria. Además de la infección lítica, asociaciones lisogénicas fueron demostradas claramente en las
cianobacterias filamentosas y unicelulares. Lo anterior nos hace comprender que los factores
ambientales y el estado fisiológico de las células hospederas, en este caso las cianobacterias afectan
claramente las interacciones “cyanophage”-cianobacterias, pero, aun así, siguen siendo poco
conocidas estas interrelaciones.

Complementariamente, los resultados que dan a conocer Peduzzi & Schiemer (2004), Filippini &
colaboradores (2006, 2008) sugieren que, en promedio, alrededor del 20% de las bacterias
heterótrofas marinas están infectadas por virus y entre un 20-40% de la comunidad bacteriana se lisan
diariamente tanto en sistemas acuáticos marinos como en lagos de agua dulce, llevando así a una
disminución en la tasa poblacional de las bacterias que están siendo infectadas por estos virus.

Jackson y Jackson en el año 2008, hacen una recopilación de aproximadamente 50 estudios

relacionados con el papel de los bacteriófagos en aguas de humedales, encontrando que estos
cumplen al menos seis funciones muy importantes en el ambiente: (i) los virus pueden ser
responsables de la significativa mortalidad bacteriana (ii) La lisis celular inducida por virus desvía el
carbono de la materia orgánica articulada a la materia orgánica disuelta, (iii) la lisis viral libera
nutrientes, generalmente en formas orgánicas, que pueden cambiar la disponibilidad de nutrientes
para otros organismos; (iv) los virus de algas o cianobacterias pueden llevar a la disminución de las
floraciones de fitoplancton o incluso prevenir la formación de las flores; (v) los virus afectan la
diversidad y la estructura de las comunidades microbianas y (vi) los fagos pueden mediar el
intercambio genético a través de transducción o a través de la liberación de DNA de la célula
hospedera durante la lisis que posteriormente podría ser adoptada por otras células mediante
transformación.

Ecología de Bacteriófagos

50
La dinámica de la población de bacterias puede verse afectada por la presencia de depredadores como
los bacteriófagos. Su abundancia, y su impacto sobre las bacterias, hacen que la comprensión de la
ecología del fago cada vez sea más, sea relevante para la ecología de los ecosistemas bacterianos.
Estos al tener una relación íntima de parasitismo con su hospedero para reproducirse, disminuyen
drásticamente la población bacteriana (Saldaña, 2015). La presencia de una especie infectiva en un
hospedador está determinada por la interacción de diferentes factores intrínsecos y extrínsecos; el
primero se relacionan con la susceptibilidad del hospedero a las infecciones parasitarias, mientras que
el extrínseco se relaciona con la dinámica poblacional, distribución, comportamiento y dieta de los
hospederos, así como con las características físicas y bióticas del hábitat (Esch y Fernández, 1993;
Wisnivesky, 2003;Cattadori et al.,2006; Robles, 2008).

Detección y caracterización de bacteriófagos

Los fagos están divididos en seis grupos de acuerdo al tipo morfológico, tipo de ácido nucleico y tipo
de hospedero. Estos fagos pueden ser tanto de DNA (cadena simple o de cadena doble) o de RNA
(cadena simple o de cadena doble). Los fagos de DNA de cadena doble pueden ser: fagos con cauda
contráctil (A), con cauda no contráctil (B), con cauda corta (C), fagos sin cauda (D3) y fagos
pleomórficos protegidos por una envoltura lipídica (G). Los fagos de DNA de cadena simple son
diferentes, pueden ser icosaédricos (D1 y D2) o filamentosos (F1 y F2) (Figuras 1 y 2) (Ackermann,
2001; Burbano-Rosero, 2009).

Los fagos del grupo E son icosaédricos con RNA de cadena simple (E1) o doble (E2). Cerca del 96%
de los fagos estudiados poseen cauda y están divididas en tres familias distintas, teniendo en cuenta
sus características morfológicas. Aproximadamente, el 60% de los fagos con cauda larga y no
contráctil pertenecen a la familia Siphoviridae, 25% de fagos con cauda contráctil pertenecen a
Myoviridae y los de cauda corta y no contráctil son Podoviridae (Ackermann, 2001; Burbano-Rosero,
2009).

Figura 1. Morfotipos de bacteriófagos. Fuente: Burbano-Rosero, 2009.

50
Figura 2. Clasificación de fagos con base en la morfología y tipo de ácido nucleico. Fuente: Burbano-
Rosero, 2009.

10.3 Islas de patogenicidad

Las islas patogénicas (PAI) son segmentos de DNA bacteriano que portan uno o más genes de
virulencia, los cuales han sido adquiridos en bloque de una fuente externa mediante transferencia
horizontal de genes. El genoma de un patógeno usualmente, representa un mosaico entre estas islas
recién adquiridas mediante procesos de transducción y un DNA perteneciente a célula hospedera. Las
PAI son elementos genéticos móviles (>10Kb) que se integran en el genoma o se mantienen en
plásmidos asociados a secuencias de tRNA. Son identificadas por su diferencia en el porcentaje
de contenido de G+C en relación a la media del cromosoma y por otras características, que sugieren
su adquisición a través de elementos genéticos móviles. Genes para una amplia gama de
determinantes de virulencia están asociados con PAI, incluyendo los que codifican para ciertos
mecanismos que le permiten resistencia a los antibióticos y a los diferentes mecanismos de defensa
del hospedador, factores de colonización, adquisición de nutrientes, adhesinas, toxinas y otros
factores de virulencia. Son codificados por factores relacionados con la movilidad genética
transposasas, integrasas y orígenes de replicación (Fernández et al., 2004).

Una PAI puede portar solo un gen de virulencia, y en ese caso se les refiere como islotes de
patogenicidad, por ejemplo; el islotes ifA de Salmonella, que codifica una proteïna secretada e
involucrada en la multiplicación intracelular. En otros casos, pueden contener varios operones
asociados con virulencia, y otras pueden ser muy grandes, por ejemplo, la PAI II de UPEC
(Escherichia coli Uropatógena) tiene un tamaño cercano a 190 Kb (Fernández et al., 2004). El
estudio y conocimiento de las PAI provee evidencias importantes de la biologia de las bacterias
patógenas, los productos de las PAI podran representar, en un futuro, blancos para la terapia
antimicrobiana, vacunas y herramientas diagnósticas (Marcus et al., 2000; Fernández et al., 2004).

Factores de adherencia y colonización

La habilidad de adherirse a la superficie del epitelio es esencial para la mayoría de los patógenos que
interactúan con los hospederos humanos. La adherencia generalmente es mediada por moléculas

50
secretadas a la superficie celular de la bacteria y que se unen a ligandos específicos en la superficie
de las células del hospedador o en la matriz extracelular. Han sido identificado un gran número de
factores de adherencia, divididos en dos grandes grupos; fimbrias (pili) y adhesinas. Las
adhesinas son estructuras complejas en forma de barra, las cuales se proyectan desde la superficie
bacterial y median el contacto entre la bacteria y la célula del hospedero. En las E.
coli uropatogénicas, los genes que codifican las proteínas del pilus, prf (P-related fimbriae), están
localizados en una PAI, la cual también codifica otros factores de uropatogenicidad. La pérdida de
esta PAI ocurre naturalmente a una frecuencia relativamente alta, y resulta en la perdida de la
virulencia. Un sistema de adhesión inusual esta codificado por el "Locus Enterocyte Effacement"
(LEE), una PAI de 35 Kb, que contiene los genes eae, esp, tir y esc, presente en las E. coli
enteropatogénicas y enterohemorrágicas, el cual codifica un sistema TTSS (Armendáriz, Domínguez,
Acosta-Muñiz, Guerrero-PrietoParra-Quezada, Orozco, & Ávila-Quezada, 2016). Este sistema
inyecta la proteína Tir (“TranslocatedIntimin Receptor”) en la membrana de la célula epitelial
intestinal del hospedero, la cual actúa como receptor de otra proteína codificada en LEE, la intimina
(eae), resultando en una fuerte de adherencia a las células epiteliales. Por otra parte, las cepas de E.
coli que poseen PAI y que pueden codificar las fimbrias S, que se unen a los receptores de ácido
siálico presentes en las células endoteliales del sistema microvascular del cerebro, pueden causar
sepsis o meningitis (Lindsay et al., 1998; Fernández et al., 2004).

Los factores de virulencia como las toxinas a menudo son codificados por elementos genéticos tales
como los plásmidos, los transposones y los bacteriófagos. Estos elementos se mueven de manera
horizontal y vertical por las poblaciones bacterianas confiriendo una ventaja evolutiva para las células
hospederas a las que se les transfirió el material exógeno. Es así, como la patogenicidad de las
bacterias infectadas está relacionada con los patógenos que las infectan, de tal manera que estas
bacterias pueden estar asociadas a factores de virulencia (Fernández et al., 2004; Dini, 2011).

Uno de los principales factores de virulencia es la toxina Shiga (Stx): dentro de esta familia de
toxinas existen 2 grupos principales denominados Stx1 y Stx2, entre sí poseen una identidad
promedio del 55 y 57% en las secuencias de las subunidades A y B, respectivamente; la toxina Stx2
ha demostrado ser codificada por bacteriófagos lisogénicos que presenta una secuencia con gran
variabilidad, a diferencia de la Stx1 que es altamente conservada. Entre las variantes conocidas de
Stx2 se encuentran Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e y se ha encontrado que la toxicidad de Stx2 es hasta
1000 veces mayor que la Stx1 (Muniesa, 1998; Donnenberg, 2002; Miko et al., 2013).

La toxina LT es una toxina termolábil muy parecida a la toxina colérica que provoca un cuadro
característico de diarrea acuosa, está compuesta por una subunidad catalítica denominada A y cinco
subunidades llamadas B cuya función es la de ligarse a receptores celulares del enterocito, igualmente
esta toxina tiene la capacidad de inactivar la señalización de proteínas quinasas activadas por
mitógenos (MAPK) en el hospedero, proteínas que desempeñan un papel clave en la transducción
intracelular de señales, permitiendo a la célula integrar diferentes estímulos extracelulares al igual
que regular procesos como mitosis, cambios en la expresión genética y metabolismo (Arias y Huguet,
2002; Salinas et al., 2011).

La toxina ST o toxina termoestable son pequeños péptidos de origen plasmídico y eventualmente

transposónico, soporta tratamientos a temperaturas de 100ºC y contiene residuos de cisteína, cuyas
uniones son las responsables de la estabilidad al calor, actúan en la superficie celular de modo que
afecta diversos cambios intracelulares de señalización; esta toxina se produce principalmente por
E.coli (ETEC) atacando a las células del epitelio intestinal causando principalmente diarrea (Huarani,
2005; Arias y Huguet, 2010). Existen dos subtipos que son STa y STb que difieren en estructura y
mecanismos de acción, los genes para ambas clases se hallan en plásmidos (Huarani, 2005; Albertini,
2009).

50
En el caso del gen terd por ser poco estudiado, su función aun no es completamente conocida, sin
embargo, se presume que puede causar la oxidación directa de los tioles celulares y que participan en
la resistencia al telurito (TEO32-), compuesto altamente tóxico para bacterias Gram negativas, razón
por la cual puede ser apreciados como factores de virulencia (Brzuszkiewicz et al., 2001; Arias &
Huguet, 2002; Ponnusamy, Hartson & Clinkenbeard, 2011; Ru, Lou, Seven, Rizo, & Chen, 2011;
Sanssouci, Lerat, Gilles, Shareck, & Beaulieu, 2011).

El rfb por su parte ha sido catalogado como responsable de las enzimas involucradas en la biosíntesis
del antígeno-O de las bacterias hospederas (Fitzgerald, Gheesling, Collins, & Campos, 2006). En el
caso de Flic es una proteína estructural del filamento flagelar (flagelina) que codifica para antígenos
flagelares de motilidad bacteriana y está involucrado en el control de varias cascadas de señalización
celular (Miko et al., 2013).

Uno de los determinantes genéticos para la producción de daños en las células epiteliales intestinales,
denominado como adherencia y esfacelamiento (A/E) esta codificado en una isla de patogenicidad
llamado locus de esfacelamiento del enterocito (LEE), el cual codifica para la proteína intimina de la
membrana externa codificada por el gen eae localizado en la región central del LEE, adicional al cual
también posee un sistema de secreción de tipo III, un número de proteínas segregadas (ESP) y Tir
( receptor translocador de intimina), una proteína codificada antes del gen eae, que se transloca en las
células del hospedero. Las lesiones A/E inician con el proceso de adherencia de la intimina (A/E),
caracterizado por la destrucción de las microvellosidades intestinales y la reorganización de las
proteínas del citoesqueleto de los enterocitos (Albertini, 2009).

10.4 Caracterización por RFLP [Restriction Fragment Length Polymorphism]-Polimorfismos de

Longitud de Fragmentos de Restricción

La técnica de RFLP permite diferenciar distintos organismos mediante análisis de patrones de

bandas, lo que permite comparar perfiles obtenidos a partir del uso de enzimas de restricción,
endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster de la molécula de DNA en determinadas secuencias
nucleotídicas, específicas para cada enzima, denominadas dianas o sitios de restricción. Los sitios de
reconocimientos de estas enzimas suelen ser secuencias compuestas por cuatro o seis pares de bases
que cortan el DNA en secuencias específicas denominadas palindrómicas, Las secuencias de
restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición en el DNA de
diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos
fragmentos de restricción (Rodríguez, 2004; Burbano-Rosero, 2009).

En general, cuanto menor es el tamaño de la secuencia diana, mayor es el número de fragmentos que
se generan. En la actualidad se han purificado un gran número de enzimas de restricciones diferentes
y procedentes de numerosas bacterias. Estas enzimas sirven en la naturaleza para proteger a las
bacterias de la penetración de DNA extraño, como el de un fago, puesto que son capaces de
destruirlo. Las endonucleasas de restricción se nombran con tres o cuatro letras que proceden del
nombre de la bacteria en la que se han aislado (por ejemplo, la enzima Eco procede de Escherichia
coli) y además se les añade un número romano (Eco RI, Eco RII, Eco 47III, Eco NI, Eco 0109I),
puesto que se pueden encontrar varias enzimas de restricción diferentes, que reconocen distintas
dianas, en la misma bacteria (Rodríguez, 2004).

10.5 Caracterización por BOX-PCR (BOX-A1R- Based Repetitive Extragenic Palindromic)

BOX PCR es una técnica de amplificación de secuencias repetidas (rep-PCR), cuyo principal
objetivo es la rápida obtención de huellas genómicas, se basa en la diversidad de repeticiones en

50
tándem (secuencias de elementos de BOX) en el genoma, se ha usado ampliamente para la
tipificación molecular de las cepas, debido a su buena reproducibilidad y poder de discriminación,
adicional a que es un procedimiento sencillo y de bajo costo (Olive y Bean, 1999 y Zhu, Zheng,
Zhao, Xing, & Li, 2006 ). Los elementos 5′–3′ BOX se compone de tres subunidades (boxA, boxB,
and boxC), que son 59, 45, y 50 nucleótidos de longitud, respectivamente (Martin et al., 1992).

10.6 Modelamiento matemático

Los modelos matemáticos son una herramienta importante en la evaluación del comportamiento,
consecuencias y trasmisión de diferentes patógenos, lo cual ha proporcionado las bases necesarias
para estimar las acciones necesarias a la hora de hacerle frente a la propagación de estos
microorganismos; el desarrollo de modelos matemáticos puede jugar un papel muy importante a la
hora de analizar y estudiar tanto la patogenicidad de un microorganismo, como el establecimiento y
evaluación de estrategias de control ante la epidemiología de dichos patógenos (Ayscue, Lanzas,
Ivanek, & Gröhn, 2009; Fresnadillo-Martínez, García-Sánchez, García-Merino, Martín-Del-Rey,
Rodríguez-Encinas, Rodríguez-Sánchez & García-Sánchez, 2012). La implementación de modelos
matemáticos en los cuales se incluyen, variables y parámetros que influyen en la propagación de
patógenos, ha demostrado su efectividad al describir la dinámica de diversas enfermedades
infecciosas, neumonía (Gómez-Hernández et al, 2014), síndrome urémico hemolítico SUH (Olvera,
Signorini & Tarabla, 2010), entre otras enfermedades ocasionadas por enterobacterias.

La evidente aparición y detección de nuevas enfermedades infecciosas y las enfermedades

reemergentes han llevado a un renovado interés en la formulación y validación de modelos, se han
tornado en herramientas fundamentales a la hora de aclarar supuestos, variables y parámetros que
favorecen el análisis de la propagación y control de estas enfermedades, así como de sus agentes
causales (Hethcote, 2000; Turner, Bowers, Begon, Robinson & French, 2006). Por otra parte, los
modelos matemáticos son empleados en la comparación, planificación, ejecución, evaluación y
optimización de diversos programas de detección, prevención y vigilancia epidemiológica,
encaminando la nueva información, al desarrollo de modelos que impliquen la transmisión vertical y
horizontal de genes para entender la propagación infectiva de los microorganismos en un ambiente
determinado (Bubniakova, 2007).

11. Estado del arte

La Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia
(UNICEF) reportan que alrededor del 18% de la mortalidad en menores de cinco años es resultado de
enfermedades diarreicas agudas vinculada con el uso de agua y alimentos, este hecho ocurre
principalmente, en los países en desarrollo por el mal estado de saneamiento de las fuentes de
abastecimiento del recurso hídrico (Arcos, Ávila, Estupiñan & Gómez, 2005; Gastroenterología
Latinoamericana, 2013).

Entre los principales microorganismos asociados a la diarrea infantil se puede encontrar a los
diferentes patotipos de E. coli diarrogénicas (DEC), trasmitida por diversas fuentes, siendo una de las
más frecuentes la transmisión por vehiculación hídrica. Según su patogénesis y las características
epidemiológicas, este grupo de bacterias se divide en seis patotipos: E. coli enteropatógena (EPEC,
por sus siglas en inglés Enteropathogenic E.coli), productora de toxina shiga (STEC),
enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAEC) y difusamente adherente
(DAEC), todas ellas de interés epidemiológico en la actualidad (Albertini, 2009; Ochoa et al, 2011;
Zambrano, 2012).

50
Estudios realizados en la costa norte de Colombia (Urbina, Arzuza, Young, Parra, Castro & Puello,
2003) reportan que alrededor del 31,2% de los casos de síndrome diarreico están asociados a DEC, en
comparación con los reportes de años anteriores (58,8%). Estos estudios no disminuyen la
importancia de otras enterobacterias como causantes de diarrea, sino que señalan que las condiciones
de riesgo pueden operar de manera amplia en relación al tipo de población analizada ( Gómez-Duarte
et al, 2010). No obstante, es muy escasa o nula, la información sobre la caracterización molecular de
cepas de E. coli diarreogénicas en asociación con las infecciones gastrointestinales reportadas
(Rúgeles et al, 2010).

En este sentido, Arcos, Ávila, Estupiñan & Gómez, (2005); Ávila & Estupiñán (2009) al igual que
Romeu, Lugo & Rojas (2011) mencionan que la inadecuada disposición de desechos domésticos es
uno de los mayores riesgos a nivel ambiental y de salud, ya que contienen gran concentración de
materia orgánica y microorganismos patógenos que pueden difundirse a través del agua, aumentando
el riesgo de contraer infecciones urinarias, gastroenteritis, colitis hemorrágica entre otras
enfermedades asociadas a enterobacterias. Además, los autores recalcan que los sistemas de salud,
como los de monitoreo ambiental, deben establecer políticas de calidad y uso sostenible del recurso
hídrico, con la finalidad de tener registros más minuciosos que den vía para la instauración de
sistemas de vigilancia epidemiológica a nivel nacional.

Según Rivas (2004) en su trabajo denominado “Efecto de un cultivo de trucha arcoíris

(Oncorhynchus mykiis) en la proliferación de bacterias heterótrofas en el lago Guamuez, Municipio
de Pasto” se identifican por pruebas bioquímicas convencionales, la presencia de las bacterias:
Aeromona sp., Pseudomonas sp. y Enterobacterias. Los datos confrontados permitieron determinar
que este lago presenta una baja contaminación fecal, sin embargo en reportes posteriores, como el
informe preventivo de la Procuraduría General de la Nación (2013) se hace evidente la grave
preocupación por la contaminación que se está generando por sobrecarga de los desechos producidos
por los cultivos de trucha, lo que puede conllevar a que en el 2018 difícilmente a nivel mundial, este
lago pueda ser nuevamente reconocido como un “Ecosistema conservado por su gestión en los
niveles ambiental, social y económico.”

Muchos estudios se han realizado a nivel mundial con el fin de determinar la contaminación
antropogénica en los cuerpos de agua, uno de ello es el realizado por Brezina & Baldini en el 2008,
quienes, en búsqueda de nuevos indicadores de contaminación antropogénica, encontraron que los
colifagos somáticos son los que mejor sobreviven a procesos de cloración y desinfección, tornándose
en un indicador prevalente en el ambiente. En el 2008 Reinoso, quien tenía como objetivo principal
determinar los principales mecanismos de eliminación y/o inactivación de patógenos indicadores de
contaminación, encontraron que la presencia de colifagos somáticos es un factor determinante en el
control del tamaño poblacional de E. coli.

Abedon en el año 2008 publicó el libro titulado “Bacteriophage Ecology Population Growth,
Evolution, and Impact of Bacterial Viruses” en él se recopila minuciosamente la información
generada por una amplia diversidad de investigaciones en fagos, especialmente vinculada con el
entendimiento desde todas las perspectivas de la ecología sobre la actividad celular y la
comunicación entre la asociación de bacteriófago-célula hospedera, al igual que muestra el
crecimiento demográfico, la evolución y el impacto de los virus bacterianos en el ambiente; la
capacidad de manipular las historias de vida y la evolución de sus hospederos. Esta publicación
también genera datos para aplicar modelos matemáticos que se aproximen a la explicación ecológica
de estos bacteriófagos, al igual que las limitaciones y las adaptaciones en su crecimiento poblacional,
tanto en medios acuáticos como terrestres.

50
Sime-Ngado y Colombet, 2009 enfocaron su estudio en el rol que cumplen los virus en ecosistemas
acuáticos, interacciones y participación en ciclos biogeoquímicos. Este enfoque les permitió
determinar el papel crucial de los bacteriófagos para el desarrollo de los ciclos biogeoquímicos y la
complejidad de las interacciones entre las poblaciones microbianas.

Se ha utilizado la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para determinar la presencia de los

genes que codifican toxinas, estudios realizados por Silveyra y colaboradores (2016), confirman que
los genes que codifican para la toxina Stx en las bacterias E.coli y Shigella dysenteriae, son
transmitidos por fagos. Hasta la actualidad, la toxina shiga ha sido la más estudiada, esta inhibe la
síntesis proteica dentro de las células hospederas, lo que genera enfermedades severas como colitis
hemorrágica (CH), el síndrome Urémico hemolítico (SUH) y Púrpura Trombocitopénica Trombótica
(PPT) (Bielaszewska et al., 2011).

Los mecanismos moleculares de patogenicidad utilizados por bacterias entéricas involucran una gran
cantidad de genes agrupados en regiones IP. Éstas pueden contribuir directamente a la virulencia del
patógeno u otorgar nuevas características que le permitan cursar un ciclo infectivo exitoso. La
capacidad de cepas patógenas como E. coli puede causar distintos tipos de infecciones
extraintestinales y se correlaciona con la expresión de múltiples factores de virulencia incluyendo
adhesinas, toxinas, sideróforos, sistemas de secreción, formación de biopelículas y otros factores que
contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenicidad (Silva, 2009; Faleiro, 2010).

En Colombia, aunque se tiene un conocimiento acerca de las condiciones microbiológicas y

fisicoquimicas de lagos, lagunas y ciénagas al igual que de su flora y fauna, aún falta mucha
investigación acerca del funcionamiento de estos ecosistemas, el grado de eutrofización en el cual se
encuentran y modelos que garanticen la recuperación y conservación de los mismos (Roldán, 2009).

La modelación matemática de la dinámica poblacional de diferentes patógenos ha permitido en cierto

grado el entendimiento de su comportamiento y por ende se han establecido medidas de contingencia
en relación a su trasmisión; el aumento en el número y severidad de los brotes de enfermedades
trasmitidas por organismos enteropatogénicos en los últimos años han dado como resultado un mayor
enfoque en el control de estos microorganismos, tales como Escherichia coli enteropatógena (EPEC)
(Whiting & Buchanan, 1997). En este contexto estudios realizados Domínguez (2015) desarrollaron
un modelo de probabilidad para definir el crecimiento y la interfaz de no crecimiento de Escherichia
coli en función de la temperatura, pH y la concentración de ácido láctico y NaCl en el cual se
determinó que los principales factores limitantes de crecimiento para este organismo fueron el pH y
la concentración del ácido, los cuales varían dependiendo de la temperatura.

Por otra parte, se han desarrollado modelos matemáticos de la dinámica poblacional de E. coli para
entender de alguna manera como se comporta este microorganismo frente algunos parámetros y
poder establecer planes para reducir eficazmente la carga de E. coli en aquellos lugares donde existe
un mayor riesgo de infección por parte de este organismo. Desde esta perspectiva, Ayscue y
colaboradores (2009) proponen un modelo matemático para evaluar el papel de los distintos hábitats
en una granja de ganado respecto a la propagación de E. coli O157: H7, con el fin  proporcionar un
marco para examinar las contribuciones relativas de los animales y el entorno en la dinámica del
patógeno; los resultados indicaron que E. coli O157: H7 fue capaz de mantener poblaciones viables
en los diferentes lugares de la granja y que los bebederos de agua y suelos contaminados del gallinero
parecen ser particularmente fuentes influyentes de conducción en la dinámica poblacional del
patógeno y por lo tanto servirían como principales objetivos para reducir eficazmente la carga de este
organismo a nivel de la granja.

50
Signorini (2008) modeló el crecimiento microbiano de Escherichia coli O157 en carne vacuna
(hamburguesas) como parte de una evaluación cuantitativa de riesgos; se seleccionaron dos modelos
predictivos terciarios, a partir de los cuales se generaron datos sobre el tiempo de latencia (ë) y tasa
de crecimiento (μ) en un rango de temperaturas (5°C a 34°C) y pH (5,6 – 6,5), obteniéndose la
relación lineal entre cada parámetro y temperatura. También se incluyeron ecuaciones lineales en
distribuciones de probabilidad para cada parámetro y se corrió un modelo para analizar el
comportamiento de las ecuaciones lag-exponencial y Gompertz en la predicción del crecimiento
de E. coli O157. En conclusión, se determinó que el modelo Gompertz fue el que mejores resultados
generó, ya que al considerar la concentración de bacterias que alcanza la fase estacionaria de
crecimiento, evita obtener valores extremadamente elevados.

12. Justificación

El Lago Guamuéz ubicado en el corregimiento del Encano (Nariño - Colombia), es un ecosistema

acuático de gran valor natural; fue declarado humedal de importancia internacional, reconocido como
riqueza ecológica de la humanidad por el Ministerio de Medio Ambiente de la Republica de
Colombia mediante el decreto 698 de 18 de abril de 2000. Sin embargo, esto no implicó que no pueda
ser usado para algunas actividades antropogénicas, como la pesca, la acuacultura y el turismo entre
otras. Estas actividades han sido desarrolladas a través de los años por los moradores de la región
como única fuente de sustento económico. En consecuencia, en los últimos años se ha intervenido
casi la totalidad de la cuenca tanto para la explotación acuícola como para el asentamiento de
poblaciones de importancia como es el corregimiento del Encano (Macías & Benavides, 2013), lo
que ha ocasionado de forma directa el deterioro de la calidad del agua y un gran impacto ecológico
debido a las actividades antropogénicas agrícolas, la erosión producto de la deforestación intensa con
los consiguientes arrastres de materia orgánica, pesticidas y fertilizantes, la adaptación de estructuras
flotantes para la cría de peces, como también por la descarga de aguas residuales al efluente (Macías
& Benavides, 2013; Quiroz-Cabrera, 2015).

La forma como este ecosistema ha venido siendo utilizado por el hombre en las últimas décadas ha
llevado a la degradación del mismo, debido al aumento de su explotación y la contaminación
acelerada. De esta manera, se agravan las condiciones de vida de la población aledaña al Lago,
exponiendo a sus habitantes a riesgos diarios perjudiciales para su salud, por eventos adversos
directos o indirectos relacionados con agentes biológicos que afectan al medio ambiente (Romeu,
Lugo & Rojas, 2011). La exposición a agentes infecciosos presentes en las aguas del Lago Guamuéz
puede ocurrir a través de la ingestión directa de agua, peces, frutas y hortalizas cuyos cultivos hayan
sido irrigados, lavados o preparados con estas aguas contaminadas. A su vez, el contacto al bañarse o
al realizar otras actividades recreativas, durante las cuales el agua salpica a las personas o sus
alimentos es también una fuente de riesgo para la salud (Schwarzenbach, Egli, Hofstetter, Von
Gunten & Wehrli, 2010). En este sentido, la evaluación de bioindicadores de contaminación fecal
como Escherichia coli permite establecer la calidad del agua empleada para el consumo humano.

No obstante, los parámetros evaluados para la determinación de la calidad del agua no permiten
establecer el grado de patogenicidad de este organismo, ya que puede expresar diferentes factores de
virulencia que le facilitan la colonización de seres humanos y varias especies de animales provocando
infecciones severas de difícil tratamiento a causa de la emergente resistencia a los antimicrobianos
(Nicolas-Chanoine, et al, 2008; Moresco, et al, 2012).

Complementariamente, es transcendental el estudio de colifagos somáticos, ya que la ausencia de

coliformes no ofrece ninguna seguridad que los virus estén ausentes y por lo tanto no exime de una
posible infección; pues se debe tener en cuenta que estos colifagos tienen la capacidad de inducir a

50
cambios en las bacterias, principalmente por la incorporación de segmentos de DNA viral que
codifican para proteínas (toxinas, factores o propiedades de señalización) como las enterotoxinas
termolábiles (LT), termoestables (ST), que son entre otros, factores asociados a la virulencia de
amplia atención epidemiológica (Schwartzbrod, 1995; Dini, 2011). Esta capacidad de infección a
células patógenas, al igual que la transferencia de los genes asociados a las islas de patogenicidad,
amplifica la necesidad de ejecutar estudios relacionados con su diversidad con la finalidad de estimar
el peligro microbiológico al que están expuestas las poblaciones que usan estas fuentes de agua
(Abedon, 2008; OMS, 2012).

Por lo anteriormente expuesto, es importante el aislamiento y caracterización molecular de los

bioindicadores de contaminación antropogénica (E. coli y colifagos somáticos) de ecosistemas
acuáticos de interés general, como es el humedal Ramsar Laguna de la Cocha (Lago Guamuéz), este
estudio proveerá datos durante un año de muestreo, que podrán ser utilizados para la formulación de
un modelo matemático, que incluya las características ambientales, microbiológicas y moleculares,
datos que permitan establecer en un futuro sistemas de vigilancia epidemiológica; una vez que los
resultados de variabilidad genética y amplificación de genes asociados a la virulencia se integren;
constituirán un aporte importante en la estimación de los riesgos a la salud en este ambiente de interés
ecológico, social y comercial de nuestro departamento.

13. Objetivos

Objetivo general

Determinar la dinámica espacio temporal y la caracterización molecular de Escherichia coli y

colifagos somáticos aislados de muestras de agua del Lago Guamuéz (Nariño-Colombia) para la
formulación de un modelo matemático.

Objetivos específicos

Caracterizar los aislados de E.coli y colifagos somáticos a nivel molecular mediante los marcadores
moleculares BOX-PCR, RFLP y secuenciación.

Determinar la amplificación de genes asociados a factores de virulencia (stx2, terD, rfb0104, fliCH4,
st, lt y eae).

Caracterizar por microscopia electrónica a nivel de morfotipos los colifagos somáticos aislados.

Modelar matemáticamente las observaciones obtenidas a nivel experimental (factores de aislamiento,

características microbiológicas, moleculares y la amplificación de genes asociados a la virulencia).

Validar el modelo matemático formulado.

14. Materiales y métodos

Área de estudio

El Lago Guamuéz es un humedal RAMSAR, ubicado al occidente del municipio de Pasto, en el

corregimiento de El Encano, a 20 minutos de la capital del departamento de Nariño, por la vía que
conduce al departamento del Putumayo. Está ubicado a una altura de 2700 metros sobre el nivel del

50
mar, tiene una extensión de 13 kilómetros de largo por 6 kilómetros de ancho y una profundidad
máxima de 75 metros, lo cual permite una capacidad de almacenamiento de 1.554 millones de metros
cúbicos de agua, aportados por 26 quebradas que lo convierten en una gran reserva hidrográfica.
“Esta laguna es una de las áreas protegidas más extensas y la mejor conservada de las que existen en
los andes del norte (desde el norte del Perú hasta Venezuela)”

Las muestras de agua se tomarán en nueve puntos del Lago Guamuéz (Figura 3), ubicado en la parte
sureste del Departamento de Nariño, localizado entre las coordenadas 0° 50’ Norte y 77° 20’ Oeste.
Tiene una superficie aproximada de 39000 ha que pertenecen a la región llamada Cuenca Alta del
Río Guamuéz. Los nueve puntos de muestreo presentan diferencia en cuanto a la contaminación
antropogénica, datos reportados por la Secretaria de Medio Ambiente en el 2009, siendo los tres
primeros puntos (P1, P2 y P3) los sitios que presentan mayor contaminación antropogénica, los
puntos P4, P5 y P6 que tendrían aparentemente una contaminación antropogénica intermedia; en
cuanto a los puntos P7, P8 y P9 se consideran puntos con una influencia antropogénica menor (Figura
3). Las coordenadas para cada punto de muestreo serán:

P1: 1° 07’ 46’’ N - 77° 09’ 52’’ W

P2: 1° 07’ 45’’ N - 77° 08’ 37’’ W
P3: 1° 06’ 41’’ N - 77° 09’ 16’’ W
P4: 1° 06’ 00’’ N - 77° 08’ 07’’ W
P5: 1° 05’ 20’’ N - 77° 09’ 07’’ W
P6: 1° 04’ 43’’ N - 77° 07’ 58’’ W
P7: 1° 04’ 13’’ N - 77° 09’ 38’’ W
P8: 1° 03’ 42’’ N - 77° 08’ 33’’ W
P9: 1° 02’ 58’’ N - 77° 09’ 32’’ W

Diseño muestreal

La recolección de las muestras se realizará en frascos estériles; en cada sitio de muestreo se tomará
una muestra de 1L de agua a 10 cm de profundidad. El muestreo se ejecutará una vez por mes durante
un año. Las muestras de agua serán rotuladas y llevadas bajo refrigeración al laboratorio de Procesos
Microbianos de la Universidad de Nariño, donde se procederá con el aislamiento y caracterización de
los bioindicadores.

50
Figura 3. Mapa Lago
Guamuez indicando los
nueve puntos de
muestreo. Mapa
modificado de
GAIA, 2014. Fuente: Este
estudio.

50
Caracterización Fisicoquímica del Agua

Teniendo en cuenta que los parámetros fisicoquímicos del agua, son factores fundamentales y
determinantes en el crecimiento de microorganismos como baterías, se realizará una caracterización
fisicoquímica de las muestras de agua según las técnicas implementadas en el Laboratorio de Aguas
de la Universidad de Nariño acreditado ante la Superintendencia de Industria y Comercio (SIC). Es
así como para la determinación de nutrientes (Nitritos, Nitratos, Fosfatos, Sulfatos) se emplearán
métodos fotométricos Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater (Standard
Methods, 2005); para las mediciones de pH se utilizará un pHmetro marca Metrohm (691pHmeter);
para la Salinidad, Conductividad y Sólidos Totales un conductímetro marca HACH (EC150). La
demanda bioquímica de oxígeno (DBO5) se realizará midiendo el oxígeno disuelto inicial y después
de cinco días de incubación aplicando el método Winkler, sin inoculación; la cuantificación de
materia orgánica se realizará aplicando el procedimiento de oxidación con permanganato en caliente
descrito por Garay-Tinoco y colaboradores (2003); la clorofila mediante el método
espectrofotométrico (Standard Methods 2005; Parsons, 2013), la temperatura y la transparencia se
medirá in situ, utilizando un termómetro de cazoleta y un disco Secchi, respectivamente . También
serán medidos los parámetros de Oxígeno Disuelto (Método Winkler), CO2 (Método de la Fenolftaleína),
Alcalinidad según la metodología propuesta por Pérez & Restrepo (2008) Cloruros y Fósforo Reactivo;
mediante el uso de un espectrofotómetro marca HACH modelo DR2010.

Procesamiento de muestras de agua para ensayos de detección de Escherichia coli

Para el aislamiento de E. coli se empleará la técnica de filtración, utilizando membranas de

nitrocelulosa 0,45 micrómetros (Millipore, Billerica, MA, USA.) y se seguirá el método descrito en el
(Standard Methods, 2005).Para cada muestra se filtrará 100 ml. Después de la filtración, las
membranas se depositarán en cajas Petri con agar MFC (Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ/
USA). Después de la incubación a 44,5 °C durante 24 horas, se verificará las colonias azules
características, se repicarán en Agar Luria Bertani (LB) disuelto en agua del Lago, previamente
estéril.  Los aislados sospechosos se sembrarán en agar eosina azul de metileno (EMB) y las colonias
verdes brillante típicas de E. coli se almacenarán en agar Luria para su posterior identificación
bioquímica, utilizando el método IMVC (producción de indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y
asimilación de citrato). Todas las colonias identificadas preliminarmente como E. coli se almacenarán
en agar Luria inclinado (Albertini, 2009) hasta su estudio a nivel molecular, posteriormente, de su
confirmación bioquímica y molecular se procederá a la elaboración del Banco de Células Primarias
de los aislados y la construcción de la base de datos.

Preparación del medio stock para la cepa hospedera Escherichia coli (ATCC 13706) detección
de colifagos somáticos

La cepa hospedera Escherichia coli (ATCC 13706) se reactivará en medio de cultivo TSB (APHA,
1995), la incubación se realizará entre 12 horas y 18 horas o hasta lograr una absorbancia de 0,6.
Posteriormente, se tomaran 500 µL de la suspensión bacteriana y se trasladaran a un tubo criogénico
conteniendo 500 µL de glicerol a 60%, el tubo se mezclará por inversión y se repetirá este proceso
para la construcción de 30 tubos criogénicos, que constituirán el banco de células primarias de la cepa
hospedera. Los tubos serán almacenados a -20ºC para ser utilizadas en los diferentes ensayos que se
requerirán en el desarrollo de este estudio.

50
Procesamiento de muestras de agua para ensayos de detección de colifagos somáticos

Las muestras de agua colectadas en los diferentes puntos del lago Guamuez, se centrifugarán a 7800
rpm por 30 minutos. El sobrenadante se filtrará a través de un tamiz de membrana de nitrocelulosa
(“Milipore”) 0.22 µm y su sobrenadante se utilizará para la detección de colifagos somáticos según lo
establecido por las normas APHA, 1995.

De cada tipo de muestra se seleccionarán las placas de lisis y se describirán las características
morfológicas teniendo en cuenta parámetros como forma, tamaño color, borde y halo de las placas y
se les asignará un código (Fago y N°), de tal manera que se pudiese identificar el lugar y el tiempo en
el que fueron aislados. Cada placa de lisis será transferida a un tubo de ensayo con 5 mL de caldo
tripticasa de soya (TSB) y 1 mL de medio de cultivo con bacteria hospedera E.coli ATCC 13706,
previamente activada por 2 horas en caldo TSB, con agitación a 35ºC. Cada tubo se incubará a 37ºC
por 3 horas y posteriormente, se centrifugará a 3000 rpm por 30 minutos. El sobrenadante se filtrará a
través de un tamiz de membrana de nitrocelulosa (“Milipore”) 0.22 µm y diámetro de 25mm, la
suspensión de fagos será titulada, conservada a 4ºC y protegida de la luz para su posterior
caracterización.

Titulación de colifagos somáticos aislados

Para determinación del título fágico, a partir de las suspensiones de fagos, se realizarán diluciones
seriadas en solución salina 0.85%. A un tubo con 5.5 mL de TSA modificado se le adicionará 1.0 mL
de cultivo de la célula hospedera, 1.0 mL de la dilución más 80µ/L de Trifenil de tetrazolio, la mezcla
será llevada a una caja de Petri estéril, se homogenizará, se solidificará y se incubará a 35 ºC por 6 a
24 horas, hasta observar placas de lisis.

Verificación de infectividad por ciclo lítico de colifagos somáticos sobre la bacteria hospedera
Escherichia coli ATCC 13706

Para verificar que los colifagos somáticos estuviesen lisando las células bacterianas de E.coli, a un
tubo con 7 mL de TSA modificado en estado líquido se le adicionará 1.0 mL de cultivo de célula
hospedera y se colocará sobre una caja Petri estéril, una vez este solidificado se colocará 10 µl de
suspensión fágica en 5 puntos diferentes y distantes en la caja, se dejará en incubación a 35°C por 12
horas y se verificará la presencia de placas de lisis.

Caracterización por microscopía electrónica de trasmisión de colifagos somáticos

Con el fin de caracterizar microscópicamente los colifagos somáticos aislados a partir de muestras del
Lago Guamuez, se tomará 1mL de la suspensión fágica con un título superior a 10 8 UFP/mL, se
alicuotarán en tubos eppendorf cubiertos con papel aluminio, se empacarán y rotularán con las
medidas de bioseguridad requeridas para su transporte y serán llevadas para su procesamiento
microscópico a la Secção de Microscopia Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, SP-Brasil.

La morfología de los fagos se observará mediante la técnica de coloración negativa (Brenner y

Horne, 1959). La adhesión de las partículas víricas se realizará en grades de cobre de 300 “malla”
recubiertos con formvar y carbón. La grade se colocará en contacto con 50 µL de muestra
resuspendida en fosfotungstato de potasio al 2%, pH 6,4 por 10 minutos y el exceso será retirado con
papel filtro. Después de secadas la grades (duplicado por fago) serán analizadas en un microscopio

50
electrónico JEOL EM1011 operado a 60V. Las muestras serán fotografiadas en un aumento de
150.000X utilizando cámara digital acoplada al sistema de fotodocumentación. Las medidas de los
fagos se realizarán mediante el software image- pro Plus
[http://www.mediacy.com/products/viewall].

Caracterización molecular

Caracterización molecular de Escherichia coli aislada del Lago Guamuéz, mediante la

amplificación del gen 16s rRNA.

Extracción de DNA cromosomal de aislados bacterianos de E.coli

Se realizará la extracción de DNA de las colonias de E. coli, identificadas previamente mediante

pruebas bioquímicas; para esto se aplicará el protocolo de Burbano-Rosero, Otero & Álvarez, 2013.
Inicialmente, se inoculará una colonia en 10 mL de caldo Luria Bertani (LB) el cual se llevará a
incubación por 18 horas a 27 °C; después de este tiempo se transferirá a un tubo falcon de 15 mL y
se centrifugará a 7800 rpm por 5 minutos, el pellet celular será tratado con 567 µL de solución
tampón TE 1 M, los tubos se mantendrán en hielo y posteriormente se adicionará 30 µL de SDS al
10% y 9 µL de proteínasa K en una concentración de 20 mg mL-1 en agua milli-q, se agitará
suavemente y posteriormente será llevado a baño maría por 1 hora a 37°C. Una vez transcurrido este
tiempo, los tubos se colocarán nuevamente sobre hielo y se adicionará 100 µL de NaCl 5M, se agitará
y adicionará 80 µL de CTAB precalentado a 65 °C, se agitará vigorosamente y se colocará en baño
maría por 20 minutos a 65°C. Después de este tiempo, se enfriarán los tubos a temperatura ambiente
para agregarles igual volumen de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1). Se centrifugará a 10000 rpm
por 25 minutos.

El sobrenadante será transferido a otro tubo y se le agregará 1µL de RNAsa (10 mg mL-1), se
incubará por 1 hora a 37°C. Después de este tiempo se adicionará igual volumen de cloroformo, se
agitará vigorosamente y centrifugará a 10000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante se transferirá a
otro tubo. El DNA será precipitado con 0,6 volúmenes de alcohol isopropílico frío y agitando el tubo
lentamente por inversión, se centrifugará nuevamente a 10000 rpm por 5 minutos, se eliminará el
sobrenadante y secará a temperatura ambiente. Finalmente, el DNA será resuspendido en 50µL de
agua milli-q (Burbano-Rosero, Otero & Álvarez, 2013). Todas las centrifugaciones se realizarán a
temperatura ambiente.

La integridad del DNA extraído se verificará en geles de agarosa al 1% a los cuales se les adicionará,
2µL de TE 1M, 1µL de azul de bromofenol, y 2µL de DNA. Como marcadores de tamaño molecular
se utilizará Lambda Hind III, las condiciones de corrida serán 70V (5 V/cm) por 1 hora y 30 minutos.
El gel será visualizado en un foto-documentador Benchtop 3UV Transilluminator a una longitud de
onda de 302 nm. La concentración de DNA se verificará mediante comparación de intensidad de
bandas respecto al marcador. Posteriormente, para todos los marcadores moleculares se ajustarán
todos los DNA extraídos a una concentración de 100 ng/uL usando el nanodrop 2000c.

Amplificación de la subunidad ribosomal 16S

Para la amplificación se utilizarán los primers s 27F 5' (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'
(Lane, 1991)) y 1041R 5'(CGG TGT GTA CAA GAC CC 3' (Nubel et al, 1996)); inicialmente estos
primers se diluirán en agua milli-Q formando una solución stock de cada primer, con una

50
concentración de 100 µM, a partir de esta se preparará la solución de trabajo a una concentración de
20 µM. Por otra parte, se preparará un mix de DNTPs a una concentración de 25 mM a partir del cual
se hará un mix de DNTPs a una concentración de 2,5 mM.

Se adicionará agua a un control negativo y posteriormente se adicionará el DNA blanco a la reacción,

se centrifugará por 20 segundos a 10000 rpm y se colocará en el termociclador con un programa de
termociclado de: 95°C por 2 minutos; 30 ciclos de: 94°C por 2 minutos, 55°C por 1 minuto y 72°C
por 3 minutos y una extensión final de 10 minutos a 72°C. Posteriormente, se retirarán los tubos del
termociclador y se analizarán las muestras mediante electroforesis en geles de agarosa ( Burbano-
Rosero, Otero & Álvarez, 2013).

Extracción de ácido nucleico de colifagos somáticos

Protocolo Miniprep para extracción de ácidos nucleicos de fagos (colifagos). Modificación de la

técnica de Lockett (1990).

La extracción de DNA se realizará partiendo de suspensiones de fagos con títulos aproximados a 10 8

UFP/mL. A un volumen de 1000 µL de la suspensión de fagos se adicionará 5 µL de RNAsa (20
mg/mL) y 5 µL de DNAsa (1 u/µL), se homogenizará e incubará la suspensión a 37 °C por 30
minutos en baño maría. Posteriormente, se adicionarán 20 µL de una solución filtrada de ZnCl 2 2 M;
la mezcla será homogenizada e incubada a 37°C por 5 minutos. Después de esta etapa, la solución
será centrifugada a 8000 rpm por 5 minutos a 20 °C. Se descartará la fase acuosa y se resuspenderá el
pellet en 500 µL de tampón TES (0,1 M de Tris-HCl pH=8.0, 0,1 M de EDTA y 0.3% de SDS). Se
dejará en incubación por 15 minutos a 65 °C, y se adicionarán 60 µL de acetato de potasio 3M pH 4.
Se homogenizará la mezcla con vórtex y se incubará en hielo por 15 minutos. Posteriormente, se
centrifugará la solución por 1 minuto a 8000 rpm, el sobrenadante será llevado a un tubo “eppendorf”
nuevo y estéril, al que se le adicionará lentamente igual volumen de alcohol isopropílico para la
precipitación del ácido nucleico; el precipitado será lavado con 200 µL de alcohol etílico y se dejará
secar por 15 minutos a 47 ºC. Posteriormente, se suspenderá el ácido nucleico en 30 µL de agua
milliQ y se almacenará a 4 °C protegido de la luz. La concentración y calidad del ácido nucleico
serán determinadas por densitometría mediante electroforesis en gel de agarosa y por
espectrofotometría, observando la relación de absorbancia 260/280 (Sambrook et al., 1989).

La electroforesis se realizará en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1X y como marcador de

tamaño molecular se utilizará λ Hind III (Promega). La corrida electroforética será realizada en una
cámara de electroforesis (ENDURO™ Gel XL Electrophoresis System) por 2 horas a 70V. El gel
será observado y registrado en un fotodocumentador (Benchtop 3UV transilluminator).

Caracterización del tipo de material genético del colifago DNA/RNA

El tipo de material genético de los colifagos se identificará a través de incubación con D NasaI o
RNasa A (Promega). Para ello, se colocarán en dos tubos “eppendorf” muestras de ácido nucleico
conteniendo 200 ng, en cada uno. Un tubo se tratará con 1U de RNAsa y otro con una 1U de DNAsa.
Posteriormente, las muestras se incubarán por un periodo de 30 minutos a 37 ºC. La enzima será
inactivada por calor a 65ºC. Las muestras serán observadas en un gel de agarosa al 1%, utilizando
como marcador de tamaño molecular λ HindIII (Promega).

50
Caracterización de DNA de colifagos utilizando enzimas de restricción.

Las muestras de ácido nucleico de cada uno de los fagos serán ajustadas a 200 ng/µL las cuales serán
sometidas a digestión a 37°C por las enzimas de restricción: EcoRI, DraI, HindIII, HinfI. Para ello se
trabajará con un volumen final de 20 µL, de los cuales 16.3 µL serán de agua desionizada estéril, 2
µL de buffer 10X, 0.2 µL de BSA (10 µg/µL), 1 µL de DNA (1µg/ µL) y 0.5 µL de enzima de
restricción 10U/ µL. Con el fin estandarizar esta técnica se realizarán diferentes ensayos, en donde se
verificará el tiempo de óptimo para la digestión (Burbano-Rosero, 2009). Adicionalmente, se
realizará una digestión multicorte (se remplazará el buffer 10X por el Buffer Multicore 10X)
utilizando en conjunto las enzimas EcoRI con HinfI y EcoRI con DraI, se dejará en incubación a
37°C por 2 horas. El producto obtenido será inmediatamente observado en un gel de agarosa al 1%
con bromuro de etidio 0,5 ng/µL, la corrida se realizará a 70 V, por 1 hora.

Determinación de la variabilidad genética de E. coli mediante enzimas de restricción (RFLP)

La variabilidad genética de E. coli será analizada mediante los polimorfismos del tamaño de los
fragmentos de restricción (RFLP) del gen 16s rRNA, amplificada por PCR. Los amplicónes de
aproximadamente 1500 pb serán ajustados a 200 ng/μL y sometidos a digestión a 37°C por las
enzimas de restricción: EcoRI, DraI, HindIII, HinfI. Para ello se trabajará con un volumen final de 20
μL, de los cuales 16,3 μL serán de agua desionizada estéril, 2 μL de buffer 10X, 0,2 μL de BSA (10
μg/μL), 1 μL del amplicón correspondiente (1μg/ μL) y 0,5 μL de enzima de la respectiva enzima de
restricción 10U/ μL. Con el fin de estandarizar esta técnica se realizarán diferentes ensayos variando
el tiempo de incubación (Burbano-Rosero, 2009).

Por último, se realizará un multicorte (se remplazará el buffer 10X por el Buffer Multicore 10X)
utilizando en conjunto las enzimas EcoRI con HinfI y EcoRI con DraI, se dejará en incubación a
37°C por 2 horas. Para todos los procedimientos ensayados se utilizó como control positivo; el
producto obtenido será visualizado en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio 0,5 ng/μL, las
condiciones de corrida será 70 V por 1 hora, buffer TAE y se utilizará como marcador de tamaño
molecular λ HindIII (Promega).

Caracterización molecular por el marcador BOX-PCR (Secuencias Repetitivas Palindrómicas

Extragénicas BOX -A1R)

El DNA de cada aislado se someterá a la técnica de BOX-PCR utilizando el primer BOX-A1 (5 'CTA
CGG CAA GGC GAC GAC GCT G 3') (Versalovic et al., 1994), técnica que ya fue estandarizada en
el Laboratorio de Biotecnología Microbiana de la Universidad de Nariño en un estudio previo sobre
bacterias productoras de polihidroxialcanoatos.

La reacción de BOX-PCR será realizada en un volumen final de 50 μL, siendo 10 μL de Buffer

colorless (Go TaqTM Reaction Buffer – Promega), 2 μL MgCl2, 1 μL de solución mix de dNTPs a
2,5 mM (Promega), 2 μL del iniciador BOX A1 a 20 μM (IDT - Integrated DNA Technologies), 0,25
μL de la enzima GoTaq ® flexi DNA Polimerase (Promega), 32.75 μL de agua milliq-Q y 2 μL de
DNA ajustado a 100 ng/µL.

Después de la amplificación, 15 μL de la reacción de PCR serán evaluados por electroforesis en gel

de agarosa (Invitrogen) 1,0% (p/v) con bromuro de etídio (0,5 µg/mL), en tampón TAE 1X a 70 V
por 90 minutos. En cada gel, el DNA digerido del fago Lambda HindIII (Promega) será utilizado

50
como marcador de tamaño molecular. El gel será fotografiado en el sistema de fotodocumentación
UVP Digidoc-ItTMImaging System.

Amplificación de genes asociados a islas de patogenicidad

Se amplificarán los genes stx2, terD, rfb0104, fliCH4, st y lt que están asociados a islas de
patogenicidad en bacterias. Las condiciones de PCR con las que se trabajará serán: desnaturalización
inicial a 94 ºC por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización (94 ºC, 30 segundos), annealing (55 ºC, 60
segundos), una extensión a 72 ºC por 60 segundos y la extensión final de 72 ºC por 5minutos para
los genes rfb010, , fliCH4, Stx2 y terD; para los genes lt y st se trabajará bajo las condiciones propuestas
por Burbano-Rosero (2009): desnaturalización inicial 95 ºC (5 minutos), 40 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 40 segundos), annealing (58 ºC, 60 segundos), extensión (72 ºC, 2 minutos)
y extensión final (72 ºC, 7 minutos) (Tabla 1).
Para la amplificación de todos los genes se utilizará como control negativo agua miliq-grado
molecular (Albertini, 2009).

Tabla 1. Secuencias de “Primers” para amplificación de genes asociados a virulencia en Escherichia

coli y colifagos somáticos.

“Primer” Secuencia (5´-3`) Ciclos de amplificación Producto

(pb)
0104rfb0-f TGAACTGATTTTTAGGATGG
0104rfb0-r AGAACCTCACTCAAATTATG rfb0101 (351)
fliCH4-a GGCGAAACTGACGGCTGCTG 94 °C, 5 min/ 30 ciclos de
fliCH4-b GCACCAACAGTTACCGCCGC desnaturalización (94 °C, 30 s),fliCH4 (201)
LP43 ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG annealing (55 °C, 60 s), extensión
LP44 GCGTCATCGTATACACAGGAGC (72 °C, 60 s), y extensión finalStx2 (584)
TerD1 AGTAAAGCAGCTCCGTCAAT (72°C, 5 min)
TerD2 CCGAACAGCATGGCAGTCT terD (434)

LT-F GGCGACAGATTATACCGTGC lt (450)

LT-R CGGTCTCTATATTCCCTGTT 95 ºC-5 min/40 ciclos de
ST-F ATTTTTMTTTCTGTATTRTCTT desnaturalización (95 ºC, 40s),st (190)
ST-R CACCCGGTACARGCAGGATT “annealing” (58 ºC, 60s),
extensión (72 ºC-2 min), y
extensión final (72 ºC, 7 min)

Fuente: Burbano-Rosero, 2009 y Bielaszewska et al., 2011.

Edición y análisis de secuencias

Los amplificados obtenidos se enviarán a la compañía MACROGEN (Korea) para su secuenciación.

Una vez obtenidas las secuencias se visualizarán en el programa Chromas lite versión 2.01. Cada
secuencia será verificada en su totalidad y se descartarán las que presentarán ruidos por
contaminación, por falta de purificación o errores propios del secuenciador utilizado en el proceso de
secuenciación de MACROGEN (Korea). Posteriormente, las secuencias serán editadas, es decir, se
procederá a recorrer la totalidad de la secuencia para corroborar que las bases correspondan a los
picos de detección, también se verificó aquellas bases asignadas como N y, cuando el pico no tenía su

50
base correspondiente le fue asignada. Como es recomendado por algunos autores, se cortarán las
caudas (colas de la secuencia) y se alinearán las secuencias en el programa BioEdit versión 7.0.4 para
obtener mayor fiabilidad de los resultados al compararlas en los bancos de datos (Tamura et al.,
2013).

Comparación con las bases de datos Ribosomal Database Project y GenBank

Para las secuencias de los aislados de E.coli, se compararán las secuencias obtenidas después del
proceso de edición en la base de datos Ribosomal Database Project (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu/)
se ingresará al link Classifier y cargará el archivo guardado en BioEdit con las secuencias de interés,
una vez obtenida la información preliminar de las secuencias, la cual se tomará como resultado
preliminar; se ingresará en el link Seqmatch, ahí se cargará nuevamente la secuencia que se guardó en
BioEdit. Una vez especificados los parámetros requeridos se seleccionará la opción Submit.

Finalmente, el resultado se visualizará en la opción Show printer friendly results de acuerdo con el
número de KNN Matches escogido (Cole et al., 2009). Por otra parte, para comparar las secuencias
obtenidas después del proceso de edición en la base de datos del GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) se ingresará en la opción BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool) específicamente nucleotide blast, se cargará las secuencias editadas en formato fasta, se
seleccionó nucleotide collection (nr/nt), Highly similar sequences (megablast) y finalmente se
aplicará la opción BLAST para visualizar el resultado (Altschul et al., 1990).

Análisis estadístico

Para los datos que resultaron ser paramétricos se realizó una medida de desviación estándar con
análisis de varianza. Para los datos no paramétricos se consideró el test de Kruskal- Wallis.
Adicionalmente, se realizó una Chi 2 de Pearson para observar la significancia estadística de
diferenciación de los colifagos por familia

Análisis mediante construcción de dendrograma

Una vez digitalizada la información obtenida a partir de RFLPs y BOX PCR, tanto de los colifagos
como aislados de E.coli, los datos de tamaño molecular de los fragmentos generados serán
convertidos en una matriz de datos y serán analizados usando el programa Multivariate Analysis
System - v.1.7 NTsys-pc. La matriz de similaridad se estimará por coincidencia simple y en la
construcción del dendrograma, se empleará el método de media aritmética no ponderado (UPGMA)
(Vargas, et al, 2007).

Descripción del modelo

Por medio del modelamiento matemático se han analizado diferentes procesos de control para el uso
del agua en lagos, reservas hídricas, ríos, etc. La variedad de modelos formulados abarca una amplia
gama de ramas tanto de matemática como estadística. No obstante, en lo concerniente al modelado
matemático relacionado con bioindicadores (Escherichia coli y Colifagos somáticos) los factores de
crecimiento, fisicoquímicos, transporte, difusión, patogenecidad, etc; se encuentran en una literatura
robusta basada en modelos definidos a través de Ecuaciones Diferenciales Parciales, Ecuaciones
Diferenciales Ordinarias, Autómatas Celulares y Redes Neuronales. Áreas del conocimiento en las
cuales, los Co-investigadores del área de las matemáticas proponentes del proyecto, tienen una
amplia trayectoria. Razón por la cual, para abordar las preguntas de investigación y los objetivos del
proyecto se formularán modelos en las ramas mencionadas anteriormente. En la siguiente tabla

50
presentamos tópicos relacionados con E. coli y Coliformes similares a los que se desarrollarán en el
proyecto, abordados por medio de modelamiento matemático.
Referencias bibliográficas del modelo
TÓPICOS
Modelos que predicen el crecimiento de Colifagos y E. coli
con base en parámetros o variables fisicoquímicas y
ambientales
Procesos de transporte, advención y difusión de Colifagos y
E. coli en lagos
El movimiento Escherichia coli en diferentes entornos en
espacio y tiempo
15. Resultados esperados de la investigación.
1. Este estudio permitirá la construcción de un banco de células primarias de aislados
bacterianos (E.coli) y de colifagos somáticos del Lago Guamuez, el cual puede ser utilizado para
futuras investigaciones en la región.
50
REFERENCIAS
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Contribution of Transduction to Antimicrobial Gene
Spread, Applied and Environmental Microbiology p. 4350
– 4362
2. Se espera caracterizar diferentes patotipos de E. coli y morfotipos de colifagos somáticos
aislados de muestras de agua del Lago Guamuéz, al igual que la obtención de amplicones de genes
asociados a factores de virulencia presentes en los aislamientos.

3. Obtención de las secuencias nucleotidicas de los aislados de E coli mediante la amplificación

del gen rRNA 16s.

4. Generar las bases necesarias para el desarrollo de un plan de vigilancia epidemiológica en el

Lago Guamuéz.

5. Formulación de un modelo matemático.

16. Productos esperados.

1. Sometimiento a evaluación de dos artículos con los resultados obtenidos para su publicación
en revistas indexada.

2. Participación en eventos de divulgación científica, presentando los resultados obtenidos en el

desarrollo del proyecto.

3. Publicación de las secuencias del gen rRNA 16s de los aislados de E coli y de genes
relacionados a islas de patogenicidad en bases de datos de disponibilidad pública.

4. Registro del banco de aislados bacterianos y de colifagos somáticos en el cepario de la

Universidad de Nariño.

5. Modelo matemático validado

17. Trayectoria del equipo de investigación.

GIBIMMA

El Grupo de Investigación en Biología Matemática y Matemática Aplicada, se fundó en el año 2011

avalado por la Universidad de Nariño. Presenta dos líneas de investigación en las temáticas de
Biomatemática y Matemática Aplicada a nivel molecular, celular y de poblaciones.
Actualmente cuenta con 18 integrantes, en categoría de Estudiantes, Profesionales y Docentes, y
entre sus trabajos principales se destacan:

- Modelos matemáticos aplicados al estudio de la respuesta inmune y resistencia a los antibióticos del
bacilo de la tuberculosis.

- Modelación Matemática de la interacción Ligando-Receptor de Mycobacterium tuberculosis en las

células dendríticas.

- Modelos matemáticos sobre resistencia bacteriana a los antibióticos.

50
 - Modelación matemática en epidemiologia de la neumonía en la primera infancia en San Juan de
Pasto
- Análisis lineal de estabilidad de un modelo matemático para la transmisión de la enfermedad de la
malaria y el comportamiento numérico del modelo con datos tomados de la población de Tumaco,
Nariño.

-Un modelo matemático sobre la dinámica del Mycobacterium tuberculosis en el granuloma.

-Mathematical modeling on bacterial resistance to multiple antibiotics caused by spontaneous

mutations.

-A mathematical model for cellular immunology of tuberculosis.

BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA

El grupo de Investigación en Biotecnología Microbiana, hace parte de la Universidad de Nariño

desde el 2003, presenta dos líneas de investigación en las temáticas de producción de metabolítos de
origen microbiano y bioprocesos. Su función investigativa dio apertura con la ejecución del proyecto
"Producción de Polihidroxialcanoatos a partir de bacterias silvestres de suelos del departamento de
Nariño" financiado por el Sistema de Investigaciones de la institución.
Atento al cumplimiento de misión y visión institucional, el grupo colabora con la formación de
investigadores de los programas de Biología, Química e Ingeniería agroindustrial, actualmente cuenta
con 10 integrantes, en las categorías de estudiantes, profesionales y doctores investigadores.
Actualmente, es considerado como el primer grupo enfocado al desarrollo biotecnológico de la
región.
Entre los trabajos de investigación realizados en el grupo, relacionados con bioprocesos, se pueden
mencionar:

- Diseño e implementación de reactores sulfidogénicos para el tratamiento de lixiviados del Relleno

Sanitario Antanas de la Ciudad de Pasto.

- Remoción de materia orgánica del río pasto por bacterias productoras de polihidroxialcanoatos.

- Degradación de endosulfan a partir de bacterias aerobias aisladas del relleno sanitario Antanas de la
ciudad de Pasto

- Optimización de un medio de cultivo para la producción de Polihidroxialcanoato sintetizado por una

cepa de Bacillus mycoides.

- Evaluación del efecto de los extractos de hojas y tallo de Solanum nigrum L. colectadas en la Granja
Experimental Botana, Municipio de San Juan de Pasto, sobre Escherichia coli & Klebsiella sp.

- Potencial para la producción de PHAs en relación al tipo de gen phaC, en bacterias marinas
hidrocarburoclasticas.

- Aislamiento y caracterización molecular de bacterias oxalotróficas productoras de PHAS mediante la

secuenciación del gen 16s.

- Screening de genes biosinteticos de policetidos (pks) en una biblioteca metagenomica proveniente del
suelo atlántico Brasilero.

50
La vinculación de nuevos profesionales en el grupo aporta un enfoque en líneas de transcriptómica,
biología molecular del cáncer gástrico y cultivo de células vegetales, en trayectorias con trabajos
como:

Estandarización de la técnica RNA-Seq para el estudio del transcriptoma de Mycobacterium

tuberculosis cultivada en medio rico de ácidos grasos y sometida a éstres celular in vitro.

Incidencia de factores genético-ambientales en la susceptibilidad al cáncer gástrico en pacientes del

municipio de Pasto.

Comportamiento de explantes de Solanum phureja juz et buk en cuatro medios de cultivos.

Evaluación de dos medios de cultivos con tres niveles hormonales en la propagación in vitro del
laurel de cera Myrica pibescensh.b.k. a partir de meristemos.

Estandarización de un medio de cultivo para la propagación in vitro de watsimba (tigridia pavonea).

Posibles evaluadores

alba.trespalacios@javeriana.edu.co
Dra. ALBA ALICIA TRESPALACIOS RANGEL
Docente Tiempo Completo
Investigadora Asociada
Pontificia Universidad Javeriana

gpadilla@icb.usp.br
Prof. Dr. GABRIEL PADILLA MALDONADO
Diretor Laboratório de Genética de Microrganismos
Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade de São Paulo
São Paulo. SP. Brasil
CEP 05508-900
Tel 55 11 3091 7349
Fax 55 11 3091 5374

lukneif@usp.br
Profa. Dra.LUIZIANA FERREIRA DA SILVA
Diretora Laboratório de Fisiologia de Microrganismos  
Tel. + 55 11 3091 7730
Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade de São Paulo

50
18. Cronograma.

Duración del proyecto: 3 años

Número Actividad Desde Hasta Tiempo

1 Búsqueda bibliografía 1 36 Meses

2 Adquisición de materiales y reservación de equipos 2 5 Meses

3 Toma de muestras 5 17 Meses

Procesamiento de muestras de agua para ensayos de detección

4 7 17 Meses
de Escherichia coli y colifagos somáticos

Extracción total de DNA cromosomal – verificación de

5 8 18 Meses
calidad

Caracterización molecular de Escherichia coli aislada del

6 9 19 Meses
Lago Guamuéz, mediante la secuencia del gen 16s rRNA

7 Secuenciación y edición de secuencias 19 20 Meses

Caracterización por microscopia electrónica de colifagos

8
somáticos aislados

Comparación con las bases de datos Ribosomal Database

9 20 21 Meses
Project y GenBank.

Caracterización molecular E. coli y colifagos somáticos por la

10 técnica BOX-PCR (Secuencias repetitivas palindrómicas 19 24 Meses
extragénicas.

Amplificación de genes asociados a factores de virulencia

11 18 24 Meses
presentes en E. coli y colifagos somáticos

Determinación de la variabilidad genética de E. coli y

12 18 24 Meses
colifagos somáticos mediante enzimas de restricción (RFLP)

13 Formulación de un modelo matemático 5 29 Meses

14 Análisis de resultados 29 24 Meses

15 Informe Final 32 36 Meses

16 Publicación de resultados 36 36 Meses

19. Posibles riesgos y dificultades

50
1. Disturbios de orden publico

Por la historia de los municipios asociados al área de estudio, que tienen amplia experiencia en la
participación en la ejecución de proyectos de carácter investigativo no se presentaría este riesgo; sin
embargo, en las últimos se han presentado diferentes manifestaciones de inconformismo en la
comunidad, por la exigencia de soluciones a problemas ambientales generados por algún tipo de
proyecto , como por ejemplo el proyecto multipropósito Guamuéz (PMG) lo cual podría dificultar en
cierta medida el acceso al área de muestreo.

2. Problemas asociados con el cambio climático

En los últimos años en el Departamento de Nariño, al igual que en el resto del país, se han producido
diversos desastres naturales a razón de la temporada invernal, la cual produjo fuertes aguaceros que
causaron inundaciones en diferentes zonas de Colombia. Los torrenciales aguaceros, vendavales e
indisposiciones atmosféricas como tormentas eléctricas y lloviznas frecuentes, pueden dificultar tanto
el transporte como el acceso al sitio de muestreo.

3. Fallas humanas

Las fallas humanas se presentan, con más probabilidad, en la etapa de laboratorio, aunque en todas
las etapas se contará con personal idóneo y capacitado para realizar las labores, mediante la
implementación del programa de higiene, bioseguridad y salud ocupacional. Los ejecutores del
proyecto y los mecanismos para realizar estas labores, asegurarán que las fallas se minimicen al
máximo, y por tal motivo, el riesgo es calificado como Bajo.

20. Impacto ambiental.

El desarrollo del presente proyecto de investigación contempla las normas y mecanismos necesarios
con el fin de que los procedimientos a realizarse no impliquen riesgo de contaminación o peligro para
los investigadores o la comunidad. Cabe aclarar que los residuos generados tras el desarrollo de la
investigación serán previamente tratados antes de su eliminación según las normas vigentes
establecidas para evitar la contaminación ambiental y la exposición de la comunidad a sustancias
potencialmente tóxicas y a material biológico, debido a que los laboratorios de Biotecnología y
Microbiología cuentan con un programa de bioseguridad y manejo de residuos biológicos con el fin
de evitar cualquier dificultad que se presente.

Los resultados obtenidos a partir del desarrollo del presente proyecto proporcionaran las bases
necesarias para el establecimiento de un modelo matemático para aplicarse en un plan de vigilancia
epidemiológica con el fin de prevenir el brote de enfermedades de vehiculación hídrica asociadas a
microorganismos entero-patogénicos.

21. Bibliografía.

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Licencias ambientales, consulta previa y contrato de acceso a recursos genéticos y/o productos
derivados.

La Universidad de Nariño ha viabilizado con Corponariño el permiso marco para recolección de

especímenes silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica y no
comercial (Resolución 126 de 19 de febrero de 2015).

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