Preparación de extracto de melocotón y purificación de Pru p 3

El extracto de melocotón (Prunus persica) de la variedad autóctona española “amarillo tardío”,

clon Calante, se preparó a partir de piel fresca. Se homogeneizó una cantidad determinada de
cáscaras de melocotón en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 6) que contenía EDTA 2 mM,
dietilditiocarbamato de sodio 10 mM, polivinilpolipirrolidona sólida al 2% y azida de sodio 3 mM
en una proporción de 1: 2 (p: v) usando un ultraturrax. La mezcla se agitó durante 2 horas a 4ºC y
se centrifugó a 12.000 xg durante 30 minutos a 4ºC.

El sobrenadante se dializó frente a tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 6 durante 48 horas a

4ºC utilizando un tubo de diálisis con un punto de corte de peso molecular de 3,5 kDa.

Pru p 3 se aisló mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna SPSepharose (5

x 2 cm). Se aplicó un volumen de 80 ml de extracto de melocotón dializado sobre la columna y la
columna se lavó con el mismo tampón hasta que la absorbancia a 280 nm fue <0,02. Las proteínas
retenidas se eluyeron usando el mismo tampón que contenía NaCl 1 M. Las fracciones eluidas se
mezclaron, se concentraron por ultrafiltración y se aplicaron sobre una columna Sephadex G-50
(77 x 1 cm) y posteriormente, la columna se lavó con tampón acetato.

El extracto de melocotón y las fracciones cromatográficas se analizaron mediante SDSPAGE en

condiciones reductoras de acuerdo con Laemmli (1970) utilizando geles de poliacrilamida
prefabricados al 4-20% en una Mini PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, Milán, Italia). Se utilizó azul de
Coomassie para teñir los geles.

Análisis de espectrometría de masas de manchas de proteínas.

La banda electroforética con un peso molecular de aproximadamente 9 kDa se cortó

manualmente del gel. La proteína para el análisis se redujo en gel, se alquiló y se digirió con
tripsina según Sechi y Chait (1998). Brevemente, la muestra se redujo con ditioeritritol 10 mM en
bicarbonato de amonio 25 mM durante 30 min a 56ºC y posteriormente se alquiló con
yodoacetamida 55 mM en bicarbonato de amonio 25 mM durante 15 min en la oscuridad.
Finalmente, la muestra se digirió con 12,5 ng / μl de tripsina de grado de secuenciación (Roche
Molecular Biochemicals, Barcelona, España) en bicarbonato de amonio 25 mM (pH 8,5) durante la
noche a 37 ° C.

Después de la digestión, se recogió el sobrenadante y se vertió 1 µl en una placa diana MALDI y se

dejó secar al aire a temperatura ambiente. Luego, se añadieron 0,6 μl de una matriz de ácido α-
ciano-4-hidroxicinámico de 3 mg / ml (Sigma, Misuri, EE. UU.) En acetonitrilo al 50% a los puntos
secos de digestión de péptidos y se dejaron secar nuevamente al aire en la habitación.
temperatura. Los análisis de EM MALDI-TOF se realizaron en un espectrómetro de masas MALDI-
TOF / TOF 4800 Plus Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, MDS Sciex, Toronto, Canadá) en el
Centro de Genómica y Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid.

Para la identificación de proteínas se buscó NCBInr sin restricción taxonómica utilizando MASCOT
2.3 a través del software Global Protein Server v 3.6 (AB Sciex, Madrid, España). Los parámetros de
búsqueda fueron: carbamidometil cisteína como modificación fija y metionina oxidada como
modificación variable.
Obtención y conjugación de anticuerpos anti-Pru p 3

Los antisueros se obtuvieron en conejos mediante inmunización con purificado

Pru p 3 como se describió previamente por Wehbi et al. (2005). Todos los procedimientos
realizados con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de

Experimentos con animales de la Universidad de Zaragoza (Licencia de proyecto PI 30/19). El

cuidado de los animales se realizó de acuerdo con la Política Española de Protección Animal RD
53/2013, que cumple con la Directiva de la Unión Europea 2010/63 sobre la protección de
animales utilizados con fines experimentales y otros fines científicos.

Los anticuerpos específicos contra Pru p 3 se purificaron mediante inmunoadsorción utilizando

una columna HP activada HiTrap NHS de 1 ml (GE Healthcare,

Farfield, Connecticut, EE. UU.) Previamente acoplado con Pru p 3. Se aplicó un volumen de 15 ml
de antisuero en la columna y la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de KH2PO4 1,5
mM, Na2HPO4 8 mM, KCl 0,14 mM y NaCl 0,14 M, pH 7,4 (PBS). Los anticuerpos unidos se
eluyeron con tampón de glicina HCl 0,1 M, pH 2,8, que contenía NaCl 0,5 M y se neutralizó
inmediatamente con tampón Tris 0,5 M, pH 8,0, para alcanzar un pH de 7,4. La conjugación de
anticuerpos purificados contra Pru p 3 con peroxidasa de rábano picante (HRP) se realizó
utilizando el kit de conjugación Lighting-link HRP (Innova Biosciences, Cambridge, Reino Unido).

Tratamientos HP y PEF

Se introdujeron muestras de Pru p 3 (1 mg / mL en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 6,0) y

extracto de melocotón en tubos Eppendorf sin espacio de cabeza y se sometieron a tratamiento a
presión a 400 MPa, 500 MPa o 600 MPa durante 5 y 10 min a 20 ° C, 50 ° C y 80 ° C. Los
tratamientos se aplicaron utilizando un equipo isostático discontinuo de Stansted Fluid Power FPG
11500 B (Stansted, Essex, Reino Unido). El fluido transmisor de presión, compuesto por una mezcla
de etanol y aceite de ricino (70/30, v / v), fue previamente equilibrado a la temperatura para ser
utilizado en los tratamientos correspondientes. El aumento de temperatura debido al
calentamiento adiabático fue de aproximadamente 3 ° C por 100 MPa. La velocidad de aumento
de la presión fue de aproximadamente 240 MPa / min y el tiempo de liberación de presión fue
inferior a 30 s. Se empleó un dispositivo automático para configurar y registrar la presión, el
tiempo y la temperatura durante cada ciclo de presurización.

Pru p 3 muestras (1 mg / ml en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 6,0) se sometieron a 50

pulsos de forma de onda cuadrada de 3 μs a 25 kV / cm para el tratamiento a 20 ° C y 50 ° C. Los
tratamientos se aplicaron en un equipo PEF y una cámara de tratamiento suministrados por
ScandiNova (Modulator PG, ScandiNova, Uppsala, Suecia), como describieron previamente
Saldaña et al. (2010). Las muestras se trataron en una cámara de tratamiento de electrodos
paralelos por lotes templada. La distancia entre electrodos fue de 0,25 cm y el área de los
electrodos fue de 1,76 cm2. La frecuencia de entrega del pulso fue de 1 Hz. La temperatura de la
solución de tratamiento se midió con un termopar antes y después del tratamiento y las
diferencias encontradas fueron inferiores a 2 ° C. La energía por pulso (W) y la energía específica
total (kJ / kg) se calculó considerando la conductividad eléctrica y la masa de cada medio de
tratamiento (Luengo, Condón-Abanto, Álvarez, & Raso, 2014).

ELISA sándwich

Se recubrieron placas de microtitulación (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 125 μl de una solución
de anticuerpos anti-Pru p 3 de conejo (1 μg / ml) en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6,
y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Luego, los pocillos se bloquearon con 300 μl de
ovoalbúmina al 3% (p / p) en PBS a temperatura ambiente (TA) durante 2 h. Antes de su uso, los
pocillos se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,05% (v / v) de Tween-20 (PBST) y se
incubaron con 100 μl por pocillo de estándares o muestras diluidas en PBS que contenía 5% de
sacarosa y 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA ) durante 1 ha TA. Después de lavar cinco veces
con PBST, los pocillos se incubaron durante 1 ha TA con 100 μl de anticuerpos anti-Pru p 3
marcados con peroxidasa diluidos 1/70000 en el mismo tampón. Después de lavar cinco veces, se
añadieron 100 µl / pocillo de un sustrato comercial que contenía tetrametilbencidina (TMB).
Después de la incubación durante 30 min a TA, la reacción enzimática se detuvo añadiendo 50 μl
de H2SO4 2 M y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas ELISA
Multiskan MS (Labsystem, Helsinki, Finlandia).

Pacientes y prueba cutánea

Un número de 22 pacientes adultos alérgicos a la fruta LTP fueron reclutados voluntariamente en

el Servicio de Alergia del Hospital Universitario Lozano Blesa de Zaragoza (España). Los pacientes
seleccionados tenían un diagnóstico clínico de alergia a LTP: síntomas tras la ingestión de
melocotón, prick test positivo con melocotón LTP (ALK-Abelló SA, Madrid, España) e IgE específica
a Pru p 3 superior a 0,35 kU / L (sistema ImmunoCAP FEIA , ThermoFisher Scientific / Phadia,
Uppsala, Suecia). Entre los pacientes seleccionados, 5 pacientes presentaron un síndrome de
alergia oral (SAO), 10 presentaron al menos uno de estos cuatro síntomas (urticaria, angioedema,
asma, dolor abdominal) en un brote agudo (ALOS) y 7 presentaron un shock anafiláctico (SNA). .
Antes de la prueba de punción, todos los sujetos recibieron un cuestionario y firmaron un
consentimiento informado para utilizar los resultados de este estudio. Las pruebas de punción se
realizaron en el Hospital Lozano Blesa tras la aprobación del protocolo de estudio por parte del
comité ético de investigación clínica de Aragón (CEICA) (Proyectos PI15 / 0323 y PI17 / 0351).
Todas las muestras se analizaron en una sesión única para cada paciente.

Las pruebas de punción cutánea se realizaron en la superficie volar del antebrazo utilizando una
lanceta de 1 mm de punta, de acuerdo con las recomendaciones de la EAACI (Dreborg, 1989). La
prueba de punción se realizó con muestras de Pru p 3 puro sin tratar y tratadas por alta presión
(600 MPa durante 10 min a 20, 50 y 80 ° C) y campo eléctrico pulsado (25 kV / cm a 20 ° C y 50 °
C ). También se analizaron en todos los pacientes un control positivo de clorhidrato de histamina
(10 mg / mL) y un control negativo de solución salina. Los diámetros mayor y menor del habón se
midieron en milímetros y se calculó el producto de ambos diámetros para cada paciente y
tratamiento. La prueba se consideró positiva cuando uno de los diámetros de la roncha era
superior a 3 mm o superior al producido por el control negativo. Para cada paciente, se calculó el
porcentaje del aumento o disminución en el producto de los diámetros de las muestras tratadas
con respecto a la muestra no tratada. Después de la prueba de punción, se tomó una muestra de
sangre de cada paciente y después de la coagulación y centrifugación, el suero se almacenó a -20 °
C hasta el análisis.

Inmunoensayo fluorescente ligado a enzimas de inhibición competitiva y no competitiva (ELFIA)

Se utilizó Pru p 3 ImmunoCAP (Referencia f420, Thermo Fisher Scientific) para las mediciones de
sIgE en un sistema Phadia 100 con sueros de pacientes individuales o con tres grupos de sueros,
en un formato no competitivo, de acuerdo con el protocolo del fabricante para la determinación
de sIgE. Los tres grupos de sueros correspondían a pacientes que presentaban uno de estos tres
tipos de sintomatología: OAS, ALOS y ANS. Para comparar la unión de sIgE a Pru p 3 no tratada y
muestras tratadas con HP y PEF, se diseñó un ensayo competitivo utilizando Pru p 3 ImmunoCAP.
En este ensayo, se mezclaron muestras de Pru p 3 tratadas o no tratadas diluidas 1/40 en PBS con
el conjunto de sueros (1/1, v / v) y se determinó sIgE. Como control negativo, también se ensayó
una mezcla de PBS con los sueros del grupo de pacientes (1/1, v / v). Los cambios en la unión de
IgE a Pru p 3 inducidos por los tratamientos (muestra de sIgE) con respecto a la muestra sin tratar
(sIgE 0%) y el control negativo (tampón, sIgE 100%) se estimaron para cada muestra de la siguiente
manera:

Unión de IgE= muestra de sIgE

Análisis estadístico

Para los datos de la prueba de punción, los análisis estadísticos se realizaron con SPSS versión 15.0
para Windows (Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Se
utilizaron estadísticas descriptivas, frecuencias, porcentajes, gráficos y tablas para resumir los
datos. Después de determinar que los datos no se distribuyeron normalmente mediante las
pruebas Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk W, se utilizaron pruebas no paramétricas para el
análisis. Usamos la prueba de rangos con signo de Wilcoxon para determinar las diferencias entre
el control y cada tratamiento. En todos los casos se predefinió un nivel de significancia de p <0,05.

Para la concentración de Pru p 3 obtenida por ELISA, los datos se analizaron para determinar la
significancia estadística con el software GraphPad Prism 5, utilizando una prueba de normalidad de
Kolmogorov-Smirnov y un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de
comparación múltiple de Tukey.