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Biochemical Engineering Journal

Volume 78, 15 de septiembre de 2013 , páginas 59-66

Artículo regular

Reutilización de la cáscara de cítricos para mejorar la formación

de metabolito-triterpenoide bioactivo en la fermentación en
estado sólido de A. cinnamomea
Fan-Chiang Yang a , Te-Wei Ma a, b, Ya-Han Lee a

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https://doi.org/10.1016/j.bej.2013.03.013 Obtén derechos y contenido

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• Se publican pocos artículos sobre la fermentación en estado sólido de A.
cinnamomea.

• La toronja fue la más eficaz para mejorar el contenido de triterpenoide

crudo.

• Con la adición de cáscara, el contenido de triterpenoides en bruto aumentó

más de cuatro veces.

• El análisis por HPLC muestra que el micelio era similar a los basidiomas
naturales.

• Algunos tipos de cáscaras de cítricos podrían mejorar la producción de

metabolitos bioactivos.

Abstracto
Antrodia cinnamomeaRecientemente se ha hecho popular como remedio farmacológico en Taiwán
debido a las propiedades fisiológicamente beneficiosas del hongo. Sin embargo, debido a la
especificidad de su hospedador, la tasa de crecimiento lenta y la rareza en la naturaleza, los
cuerpos fructíferos de A. cinnamomea se han convertido en los hongos más caros de Taiwán en los
últimos años. Cultivo artificial deA. Los basidiomas de cinnamomea para satisfacer la demanda del
mercado se considera la solución más eficaz.

En este estudio, la fermentación en estado sólido se llevó a cabo en placas de Petri para el
crecimiento de micelios y la formación de basidiomas de A. cinnamomea.Se agregaron diferentes
tipos de cáscaras de cítricos al medio para investigar la viabilidad de mejorar la producción de
compuestos bioactivos. El contenido de triterpenoides en bruto de los micelios en la prueba de
control alcanzó el nivel más alto de 9,66  mg / g de peso seco el día 30. Entre varios tipos de
cáscaras de cítricos, la cáscara de pomelo fue la más eficaz para mejorar el contenido de
triterpenoides en bruto. Además, en la proporción de adición de 4  g por placa de Petri, la
cantidad de triterpenoide crudo alcanzó 47,10 mg / g DW el día 30, con un aumento de más de
cuatro veces. Además, en comparación con el micelio del cultivo de control, los perfiles del
análisis de HPLC muestran que el micelio cultivado con la adición de piel de pomelo contenía más
tipos de triterpenoides y era similar a los basidiomas naturales. Este estudio demuestra que la
adición de algunos tipos de cáscaras de cítricos podría acelerar eficazmente la formación de
basidiomas y mejorar la producción de metabolitos bioactivos.

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Palabras clave
Antrodia cinnamomea; Triterpenoide; Fermentación en estado sólido; Cáscara de cítricos

1 . Introducción
Antrodia cinnamomea es un parásito fúngico exclusivo en la pared interna de la especie endémica
Cinnamonum kanehirai Hay. Los cuerpos fructíferos de A. cinnamomea se utilizan como medicina
tradicional en Taiwán. Debido a que los basidiomas fúngicos son tan raros y los intentos de
cultivarlos han fracasado, en los últimos años A. cinnamomea se ha convertido en un hongo
medicinal extremadamente caro en Taiwán que se usa ampliamente en el tratamiento de varios
cánceres y enfermedades hepáticas. Varios informes han indicado que A. cinnamomea posee
capacidades antioxidantes, antitumorales e inmunomoduladoras. Muchos tipos de compuestos
bioactivos identificados en los cuerpos fructíferos de A. cinnamomeaincluyen polisacáridos,
lactona sesquiterpénica, esteroides y triterpenoides [1] , [2] , [3] , [4] . Además de los polisacáridos,
los triterpenoides se consideraron recientemente como uno de los componentes biológicamente
más activos.

En la actualidad, la investigación de pequeños componentes bioactivos moleculares de A.

cinnamomea se centra en los triterpenoides. En 1995, se aislaron tres nuevos triterpenoides de
tipo ergostano, Antcina A, Antcina B y Antcina C de A. cinnamomea . Los estudios farmacológicos
preliminares revelaron que la Antcina A mostró citotoxicidad contra la leucemia murina P388 y la
Antcina B exhibió actividades anticolinérgicas y antiserotoninérgicas [1] , [2] . También se ha
demostrado que los triterpenoides extraídos de A. cinnamomea tienen actividades anticolinérgicas
y antiserotoninérgicas. Cuando se aislaron cuatro nuevos triterpenoides de tipo ergostano del
cuerpo fructífero del hongo A. cinnamomea por Cherng et al. [4]y Dai et al. [5] , se informó que
tanto el micelio como el esporocarpio de A. cinnamomea protegen contra el daño hepático agudo
inducido por el etanol. Los extractos de disolventes orgánicos de los cuerpos fructíferos de A.
camphorata son ricos en esteroides y triterpenoides. El extracto de acetato de etilo de los cuerpos
fructíferos de A. cinnamomea poseía actividades anticancerígenas y antiinflamatorias [6] , [7] y el
extracto de etanol podría inducir la apoptosis de las células HL 60 [8] . Los tres triterpenos de tipo
ergostano aislados de los cuerpos fructíferos de A. camphorata mostraron el efecto citotóxico más
potente con un valor de CI50 de 22,3 a 75,0 μM. También se demostró que los compuestos inducen
apoptosis en células HT-29 y SW-480, como lo confirma la detención del ciclo celular sub-G1 [9] .
Debido a tales funciones fisiológicas, la determinación de cómo aumentar la producción de
triterpenoides mediante el control de las condiciones de cultivo o la modificación de las
composiciones de los medios merece un estudio más detallado.

En la última década, varias investigaciones han investigado el efecto de las condiciones de cultivo
o composiciones del medio sobre los metabolitos bioactivos en los cultivos sumergidos de A.
cinnamomea . La mayoría de los artículos relacionados se han enfatizado en cómo mejorar la
producción de polisacárido por A. cinnamomea [10] , [11] , [12] , [13] . Se ha informado que la
producción de triterpenoides de A. cinnamomea se puede mejorar de forma espectacular
mediante la modificación de la composición del medio. De todas las fuentes de carbono
analizadas, la mayor producción global de triterpenoides (31  mg / g de peso seco) se obtuvo
después de 14 días de cultivo cuando se utilizó glucosa al 2% [13]. Según la metodología de
superficie de respuesta (RSM), los resultados indican que cuando se operó un cultivo sumergido
en matraces de agitación a 28  ° C, pH inicial de 5,5 y velocidad de rotación de 105  rpm, el
contenido de triterpenoides en base seca podría incrementarse a 31,8  mg / g [14] . Se
construyeron dos modelos de optimización, a saber, la metodología de superficie de respuesta
(RSM) y la red neuronal artificial (ANN) para optimizar el tamaño del inóculo y los componentes
medios para la producción de triterpenoides intracelulares de A. camphorata . La producción de
triterpenoides obtenida experimentalmente utilizando el medio diseñado por ANN-GA fue de
64,79  mg / l, lo que coincidió con el valor predicho [15] . Los resultados obtenidos son útiles en la
regulación y optimización deCultivo de A. cinnamomea para la producción eficiente de masa
celular y metabolitos bioactivos en el cultivo sumergido.

Por el contrario, se dispone de muy poca información sobre la influencia de las condiciones
ambientales o las composiciones del medio en la formación de componentes biactivos en la
fermentación en estado sólido de A. cinnamomea [16] , [17] , [18] , [19] . Se ha mostrado difícil el
cultivo in vitro de A. cinnamomea en placas de agar para inducir la formación de cuerpos
fructíferos, ya que muchos de sus procesos fisiológicos y de desarrollo no están claros. El informe
ha indicado que un aislado dicariota de un emparejamiento entre dos monokariones compatibles
obtenidos de dos basidiomas diferentes fue capaz de producir basidiomas en medios PDA y MEA a
temperaturas de 20-28ºC. ° C dentro de los 45 días posteriores a la incubación. Se observaron
microscópicamente los basidios y basidiosporas producidas en la capa de himen [16] . Se encontró
que las heridas físicas de las hifas rojas inducen la formación de cuerpos fructíferos en una placa
de agar. Los extractos metanólicos de hifas blancas y rojas, de cuerpos fructíferos cultivados de
forma salvaje e in vitro analizados por HPLC mostraron un patrón distinto entre las hifas y los
cuerpos fructíferos [17] . Se informó de que el uso de 10 componentes conocidos en A .
cinnamomeaincluyendo 5 ergostanos (Antcinas C y K, y ácidos zhankuic A, B y C), 4 lanostanos
(ácido sulfurénico, ácido deshidrosulfurénico, ácido eburicoico y ácido deshidroeburicoico) y 1
monofenil (4,7-dimetoxi-5-metil -1,3-benzodioxol) como estándares, micelio y basidiomas de A .
cinnamomea se diferenciaron. Los basidiomas naturales y los basidiomas cultivados contenían los
10 componentes de la prueba. Sin embargo, tanto el micelio natural como el micelio cultivado
contenían los 4 lanostanos y 1 monofenilo, pero no los 5 ergostanos. Estos resultados indican que
la producción de ergostanes está relacionada con la formación de basidiomatal de A . cinnamomea
, pero no está relacionado con el sustrato sobre el que crece el organismo [18]. Sin embargo, hay
muy poca información disponible en relación con la fermentación de estado sólido para el
crecimiento de micelios y la formación de basidiomatal de A . cinnamomea en placas de Petri [16] ,
[18] , [19] .

Como se describió anteriormente, A. cinnamomea crece específicamente en el tronco de un árbol

endémico de Taiwán, Cinnamomum kanehirai Hay. Esta especie hospedante nativa se está
volviendo escasa, lo que dificulta encontrar los cuerpos fructíferos de A. cinnamomea en el campo.
También se ha demostrado que la canela kanehirai aceite esencial ofrece un entorno favorable
que promueva el crecimiento de una . cinnamomea pero inhibe otros posibles hongos
competitivos, para una mejor colonización de los hongos en sus huéspedes individuales, pero no
son esenciales para la formación basidiomatal de los hongos [19]. Desde el punto de vista de la
conservación de las plantas, la búsqueda de un sustituto de las astillas de madera merece un
estudio más detenido. Entre muchas fuentes, las cáscaras de frutas cítricas son la más familiar y
una fuente rica de aceites esenciales. Esta investigación se centró en explorar la adición de
diferentes tipos de cáscaras de cítricos al medio como un medio para mejorar la producción de
compuestos bioactivos de A. cinnamomea en cultivos en estado sólido en placas de Petri.

2 . materiales y métodos

2.1 . Organismo e inóculo

A. cinnamomea CCRC35396 se obtuvo del Centro de Investigación y Recopilación de Recursos
Biológicos (BCRC) del Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria (Hsinchu,
Taiwán). La cepa se mantuvo en agar dextrosa de patata inclinadas (PDA). Las inclinaciones se
incubaron a 25  ° C durante 7 días y luego se almacenaron a 4  ° C.

2.2 . Preparación del inóculo

El medio para el cultivo de semillas estaba compuesto por los siguientes componentes (p / v):
glucosa 2,0%, extracto de malta 2,0% y peptona 0,1%. El pH se ajustó inicialmente a 5, seguido de
autoclave a 15  psi, 121  ° C durante 15  min. A. cinnamomea se transfirió al medio perforando
 discos de agar de 0,7 mm de diámetro del cultivo desarrollado en placas PDA; Se utilizaron cinco
discos para inocular 100  mL de medio líquido. El cultivo de siembra se hizo crecer en un  matraz
Erlenmeyer de 250 ml a 25  ° C en una incubadora con agitador rotatorio a 100  rpm.

2.3 . Fermentación en estado sólido en placa de Petri

La fermentación en estado sólido se realizó en una placa de Petri. El medio basal utilizado en este
estudio estuvo compuesto por 28  g de polvo de trigo sarraceno y 20  ml de agua destilada .
Además del medio basal, se añadieron al medio varios tipos o concentraciones de polvo de
cáscara de cítricos para estudiar su influencia en la formación de metabolitos bioactivos. Después
de esterilizar a 121  ° C durante 20  min y enfriar, se añadió inóculo al 10% a las placas de Petri,
que posteriormente se incubaron a 25ºC. ° C en la oscuridad durante aproximadamente un mes
para el crecimiento de micelios y la formación de basidiomas. Además del medio basal, se
añadieron al medio varios tipos y diferentes concentraciones de polvo de cáscara de cítricos para
estudiar su influencia. Al final de la incubación, la capa micelial en la parte superior del cultivo se
retiró de la placa de Petri para analizar el peso seco de la biomasa, los polisacáridos intracelulares
(IPS), los polifenoles totales y la producción de triterpenoides. Se requirió una placa de Petri para
cada ensayo, y se prepararon tres juegos de placas de Petri al mismo tiempo para cada prueba.
Los valores son las medias de determinaciones por triplicado. Todas las muestras de prueba se
secaron completamente en un horno a 50  ° C antes de extraerlas con etanol.

2.4 . Preparación de polvo de cáscara de cítricos

Se compraron cuatro tipos de frutas (mandarina, limón, naranja y pomelo) en un mercado local
de Taichung. Se  secaron unos 50 g de piel a 60  ° C hasta un peso constante y luego se molieron en
polvo para obtener aditivos medios.

2.5 . Determinación de la concentración de biomasa y almidón.

Para determinar la concentración de biomasa, los micelios de una muestra se filtraron a través de
una  malla de 30 μm de tamaño de poro y se lavaron con una gran cantidad de agua destilada,
luego se recogieron por filtración a través de un papel de filtro Whatman prepesado no. 2
(Whatman International Ltd., Maidstone, Reino Unido), seguido de liofilización hasta un peso seco
constante. Los valores son los medios de determinación por triplicado. Se adoptó un método de
almidón-yodo para el análisis de la concentración de almidón fuera de línea [20] .

2.6 . Mediciones de polisacáridos intracelulares.

Los polisacáridos intracelulares (IPS) se extrajeron de micelios secos (100  mg) suspendiendo el
micelio en 10  ml de agua destilada y esterilizándolos en autoclave a 15  psi, 121  ° C durante 15
 min [21] . Las muestras de los matraces de agitación se centrifugaron a 8000  rpm durante 10
 min y el sobrenadante resultante se filtró a través de papel de filtro Whatman. El filtrado de
cultivo resultante se mezcló con cuatro volúmenes de etanol al 95% (v / v), se agitó vigorosamente
y se dejó durante la noche a  4ºC. El polisacárido precipitado se recogió mediante centrifugación a
8000  rpm durante 10 min y luego liofilizado para eliminar el etanol residual. El polisacárido total
en el medio de cultivo se determinó mediante un ensayo de fenol-ácido sulfúrico según DuBois et
al. [22] . Debido a la interferencia de la composición del medio del almidón, en este estudio no se
ensayó el polisacárido extracelular.
2.7 . Ensayo de triterpenoide crudo
La determinación del contenido de triterpenoides crudos fue similar a la descrita por Tsujikura et
al. [23] . Los micelios secos (100  mg) se extrajeron con etanol al 50% (v / v) (3  ml) durante una
semana (dos veces). Después de eliminar los micelios por centrifugación, los sobrenadantes se
secaron a 50  ° C en condiciones de vacío. Los residuos se suspendieron en 3  ml de agua y luego
 se agregaron 3 ml de cloroformo para la extracción. Después de la eliminación de la capa de agua
superior, el triterpenoide crudo en cloroformo se extrajo por 5% (w / v) de NaHCO 3 .  Luego se
agregó HCl 2 M para ajustar el pH de la capa de NaHCO 3 por debajo de 3, y luego el triterpenoide
crudo en el NaHCO 3La capa se extrajo con cloroformo. Después de la eliminación del cloroformo
por evaporación a 40  ° C, se disolvió triterpenoide bruto en etanol absoluto y se detectó su
absorbancia a 245  nm en un espectrofotómetro (Genesys UV10, Thermo, EE. UU.). El contenido de
triterpenoide bruto se calculó sobre la base de una curva estándar preparada utilizando ácido
ursólico.

2.8 . Determinación de polifenol total

El polifenol total se determinó según el método de Singleton y Rossi con una ligera modificación
[24] . Cada extracto en agua o metanol (0,4  mL) se mezcló con agua destilada (9,6  mL) y reactivo
de Folin-Ciocalteu (1  mL). Después de 5  min a  22ºC,  se añadió carbonato de sodio al 5% (5 ml).
Después de 60  min de reposo a 22  ° C, se midió la absorbancia a 750  nm frente a un blanco. El
contenido total de polifenoles se calculó sobre la base de la curva de calibración del ácido gálico.

2.9 . análisis estadístico

Las variaciones entre los experimentos se estimaron a partir de las desviaciones estándar y la
significación estadística de los cambios en los parámetros fisiológicos se estimó utilizando la
prueba t de Student. En todos los gráficos, el símbolo * indicó una diferencia significativa con
respecto a los grupos no tratados, p  <  0,05; ** indicó significativamente diferente de los grupos no
tratados, p  <  0.01. Todos los datos fueron medias de tres medidas.

2.10 . Sistema de HPLC para el análisis de triterpenoides

Los micelios secos (100  mg) se extrajeron usando etanol al 50% (v / v) (3  mL) durante 12  h, y la
extracción fue asistida por sonicación sucesiva usando Delta D200H Sonication Cleaner. Después
de la eliminación de los micelios por centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se extrajo
el residuo micelial usando los mismos procedimientos y condiciones de vacío. Los residuos se
suspendieron en 3  ml de agua y luego  se agregaron 3 ml de cloroformo para la extracción.
Después de la eliminación de la capa de agua superior, el triterpenoide crudo en cloroformo se
extrajo usando 5% (w / v) de NaHCO 3 .  Luego se añadió la cantidad de HCl 2 M para ajustar el pH
de la capa de NaHCO 3 por debajo de 3, y el extracto en NaHCO 3La capa se secó en condiciones de
vacío y se resuspendió en etanol al 50% (v / v). Después de centrifugar a 8000  rpm durante 5  min,
el extracto se filtró a través de una  membrana de 0,45 my el filtrado se analizó en busca de
triterpenoides mediante HPLC.

Según el artículo de 2011 de Chang et al. [18] , se modificó el método para el análisis de
triterpenoides y se realizó HPLC en un Agilent serie 1100 con detección UV. La longitud de onda de
detección se estableció en 254  nm. La separación se obtuvo con una columna de fase reversa
(Cosmosil 5C18-AR-II, 250  mm  ×  4,6  mm, Kyoto, Japón) eluida a un caudal de 1  mL  min -1 con
una elución de gradiente de disolvente lineal de A (0,0085% H 3 PO 4 en H 2 O) y B (acetonitrito); la
columna se eluyó de acuerdo con el siguiente perfil: 0–65  min, 30–47% B, 65–110  min, 47–47% B,
110–140  min, 47–100% B, 140–160 min, 100–100% B, 160–165  min, 100–30% B, 165–180  min, 30–
30% B. La temperatura de la columna se estableció en 30  ° C. El volumen de inyección fue de 20
 μl.

3 . Resultados y discusión

3.1 . Cultivos en placa de Petri

La figura 1 muestra la cinética del crecimiento micelial y la acumulación de metabolitos por A.
cinnamomea en la fermentación en estado sólido usando placas de Petri. Se usó medio basal en el
cultivo y estos datos se usaron como control. De acuerdo con los resultados de la Fig. 1 , se
observaron aumentos lentos en la biomasa, triterpenoide crudo y contenido de polisacáridos
intracelulares dentro de los primeros 25 días, tiempo durante el cual las células permanecieron en
una fase de retraso. La biomasa micelial y las concentraciones de triterpenoides crudos
alcanzaron el máximo el día 30, y los valores máximos correspondientes fueron 3,86  g / placa y
9,66  mg / g DW (la producción de triterpenoides crudos 37,27 mg / placa), respectivamente. En
contraste, la acumulación de polisacárido intracelular muestra las características del producto
asociado al crecimiento mixto y aumenta hasta el nivel más alto de 164,83  mg / g DW mg / g (DW)
el día 20. En los cultivos sumergidos de A. cinnamomea , polisacárido intracelular normalmente se
consideraba un producto asociado al crecimiento [11] , [12] , [13] . Sin embargo, no se encontró en
este estudio, lo que podría atribuirse a nuestro medio de diseño especial y las características de
gran heterogeneidad de los cultivos en placa de Petri. Por lo tanto, todas las siguientes
fermentaciones se realizaron principalmente durante 30 días para investigar la influencia de los
aditivos en polvo de cáscara sobre la formación de metabolitos bioactivos.
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Figura 1 . Evolución temporal del crecimiento del micelio y la formación de metabolitos en la

fermentación en estado sólido de A. cinnamomea utilizando placas de Petri a 25  ° C.

3.2 . Efecto de diferentes tipos de adiciones de cáscara de cítricos

Como se describió anteriormente, se sabe que las cáscaras de frutas cítricas son ricas en aceite
esencial. Se agregaron al medio varios polvos de cáscara de cítricos, incluidos limón, naranja,
mandarina y pomelo, en una cantidad de 2  g por placa para estudiar la viabilidad de mejorar el
crecimiento de micelios y la formación de metabolitos de A. cinnamomea en la fermentación en
estado sólido. Figura 2indica la influencia de varios tipos de adiciones de cáscara de cítricos sobre
el crecimiento del micelio y la producción de metabolitos intracelulares. Es interesante notar que,
aparte de la cáscara de limón, los polvos de pomelo y cáscara de naranja parecen tener un efecto
inverso sobre el crecimiento de los micelios. Sin embargo, se demostró que cuatro cáscaras de
cítricos probadas mejoran el contenido de triterpenoide crudo, en el que el polvo de cáscara de
pomelo fue el más efectivo. En comparación con el control, el contenido de triterpenoide crudo
con la adición de cáscara de pomelo aumentó de 9,66  mg / g DW a 36,16  mg / g DW, que tuvo un
aumento de más de tres veces (ver Fig.2(RE)). Sin embargo, con respecto al contenido de
polisacáridos intracelulares, el pomelo obviamente tuvo un efecto negativo. Se demostró que el
naranja es el más eficaz para mejorar el contenido de polisacárido intracelular de 126,10  mg / g
de peso seco del control a 153,28  mg / g de peso seco .
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Figura 2 . Efecto de la adición de diferentes tipos de polvo de cáscara de cítricos sobre el

crecimiento del micelio (A) y el contenido de polisacáridos intracelulares (B), polifenol total (C) y
triterpenoide (D). Los cultivos se llevaron a cabo en placas de Petri con aditivos de cáscara en
polvo de 2  g por placa a 25  ° C durante 30 días. Los valores se expresan como la media  ±  DE de
tres experimentos; * diferencias significativas ( p  <  0,05) con respecto al control; ** diferencias
significativas ( p  <  0.01) con respecto al control.

Además del polisacárido intracelular y el triterpenoide crudo, se han aislado polifenoles de

hongos y se ha demostrado que poseen actividades antioxidantes eficaces debido a sus grupos
hidroxilo. Los fenoles típicos con actividad antioxidante se han caracterizado como ácidos
fenólicos y flavonoides. Como muestran los resultados en la Fig. 2 (C), sin importar qué tipo de
extractos se agregaron al medio, se mejoró el contenido de polifenol total en el micelio. En
comparación con el control, el contenido de polifenol con la adición de cáscara de pomelo
aumentó de 9,43  mg / g PS a 21,76  mg / g PS, respectivamente, un aumento de más del doble.

3.3 . Efecto de diferentes concentraciones de polvo de piel de pomelo

Se agregaron varias cantidades de polvo de cáscara de pomelo al medio para investigar la
influencia de la concentración y también para determinar un nivel de adición apropiado.
Basándose en los resultados representados en la Fig. 3 (A), es interesante observar que el nivel de
adición inferior o superior a 2,0  g / placa parece ser beneficioso para el crecimiento de micelios.
Para explicar un fenómeno tan peculiar, la cáscara de pomelo se dividió en dos categorías de
composición. La primera categoría tuvo un efecto positivo en el crecimiento de los micelios,
proporcionando una fuente de carbono, sales minerales y vitaminas. Esto explica el hecho de que
las adiciones de niveles inferiores, como 0,5  go 1 g por plato, mejoró la producción de biomasa.
Por el contrario, los componentes del segundo grupo, como los aceites esenciales, podrían inhibir
el crecimiento. Según el artículo de nuestro laboratorio publicado en 2012 [25] , una adición de
alto nivel de extracto de cáscara de cítricos obviamente tuvo un efecto negativo en el crecimiento
de micelios en el cultivo sumergido de A. cinnamomea , que se debió a que la composición
principal del extracto de cáscara eran aceites esenciales . Esto podría explicar por qué la adición
de 2,0  g por placa fue perjudicial para el crecimiento del micelio en esta prueba, pero no fue
coherente con el resultado de añadir 8  g por placa. Esto se atribuyó al hecho de que cuando un
gran 8 Se añadió una cantidad g de polvo de cáscara al medio de la placa de Petri para la
fermentación en estado sólido, la dureza y la estructura de la superficie del medio se habían
variado mucho. Esto podría provocar el alargamiento del crecimiento de los micelios y también
conducir al crecimiento de los micelios en diferentes morfologías, que alcanzaron una mayor
concentración de biomasa y un menor contenido de triterpenoide crudo.

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Figura 3 . Efecto de la adición de diferentes concentraciones de polvo de cáscara de pomelo sobre

el crecimiento del micelio (A) y el contenido de polisacáridos intracelulares (B), polifenol total (C)
y triterpenoide (D). Los cultivos se llevaron a cabo en placas de Petri con adición de varios pesos
de polvo de piel de pomelo por placa a 25  ° C durante 30 días. Los valores se expresan como la
media  ±  DE de tres experimentos; * diferencias significativas ( p  <  0,05) con respecto al control;
** diferencias significativas ( p  <  0.01) con respecto al control.

Con respecto a la influencia de las adiciones de diferentes niveles en la formación de IPS, no

importa cuánto polvo de cáscara se agregó, el contenido de IPS en el micelio fue menor, en
comparación con el control. Sin embargo, si la concentración de micelio por placa se combinó
para el cálculo de la tasa de producción de IPS, la cantidad de adición de 0,5  g todavía era
beneficiosa.

Con base en los resultados mostrados en la Fig.3 (C), cuando la cantidad de polvo de cáscara
agregada aumentó al nivel de 4  g por placa, el contenido de polifenol en el micelio aumentó de
9,43  mg / g DW del control a 24,11  mg / g DW, que tuvo un aumento de más del doble. Se
encontraron resultados similares en el contenido de triterpenoide crudo, que aumentó de 9,66
 mg / g de peso seco del control a 47,10  mg / g de peso seco y tuvo un aumento de casi cinco veces.
Aunque el contenido de triterpenoide crudo en micelios cultivados en la cantidad de adición de
8 g de polvo de cáscara por placa disminuyó, se consideró que la cifra estaba fuertemente
asociada con el tiempo de cosecha. Cuando se agrega una mayor cantidad de polvo de cáscara al
medio, sería necesario alargar el tiempo de cultivo para la acumulación de metabolitos
secundarios como el triterpenoide. Este estudio demostró que la adición apropiada de cáscara
tuvo un efecto significativo en la mejora del contenido de triterpenoides crudos. Las condiciones
beneficiosas para el crecimiento de los micelios podrían tener un efecto negativo en la formación
de triterpenoides y viceversa , lo que coincide con el artículo publicado [13] .

3.4 . Análisis HPLC de triterpenoides

Como se describe en la introducción, debido al elevado valor de basidiomas silvestres de A .
cinnamomea , algunos fabricantes han utilizado micelios para sustituir los basidiomas. Según el
artículo de Chang de 2011 [18] , se ha establecido el método para distinguir los micelios de los
basidiomas. Se indica que la producción de triterpenoides ergostano, tales como Antcins C y K, y
los ácidos zhankuic A, B y C, se asocia con la formación basidiomatal de A . cinnamomea , ya que
ambos basidiomas naturales cultivadas en la madera de C . kanehiraiy los basidiomas cultivados
producidos en medio PDA contenían los cinco triterpenoides ergostanos detectados, pero estos no
se encontraron ni en el micelio natural ni en el cultivado. Sin embargo, sólo los basidiomas de A .
cinnamomea produjo triterpenoides de ergostano y no el micelio, por lo que estos resultados
pueden aplicarse a controles de calidad comercial de los productos fúngicos. Los triterpenoides
ergostano aislados de basidiomas de A . cinnamomea mostró el efecto anticanceroso citotóxico
más potente. Los compuestos se demostraron para inducir la apoptosis en células HL-60, HT-29 y
SW-480  células [8] , [9] .

Los análisis de HPLC se realizaron en basidiomas silvestres y extractos de micelios de cultivos en

placa de Petri. Los perfiles resultantes se muestran en la Fig. 4 (A – C) . La parte (A) muestra los
resultados del basidioma salvaje. Estos resultados están de acuerdo con la conclusión del 2011
Chang et al. papel [18] . Se observaron cinco triterpenoides ergostano detectados, cuatro
triterpenoides lanostano detectados y un monofenilo. Por el contrario, la Parte (B) muestra los
resultados del extracto de micelio del cultivo de control en placa de Petri. En el extracto de
micelio, hubo tres picos de triterpenoides de ergostano en los tiempos de retención de 62, 83 y 93
 minutos (ácidos zhankuic C, B y A). Estos picos aparecieron después de 30 días de fermentación,
pero el contenido fue muy pequeño. El extracto de micelio de la adición de 4 g de piel de pomelo
por cultivo en placa de Petri se presenta en la Parte (C). Los cinco picos de triterpenoides de
ergostano aparecieron en el extracto de micelio después de 30 días de fermentación. Además, en
comparación con el micelio del cultivo de control, los perfiles del análisis por HPLC muestran que
el micelio cultivado con una  adición de 4 g de piel de pomelo contenía más tipos de triterpenoides
y era similar a los basidiomas naturales. En otras palabras, este resultado demuestra que la
adición de cáscara de pomelo podría acelerar de manera efectiva la formación de basidiomas y
mejorar la producción de metabolitos bioactivos.
Descargar: Descargar imagen a tamaño completo
Figura 4 . Cromatogramas de HPLC de los extractos etanólicos de cuerpos fructíferos naturales o
micelios cultivados de Antrodia cinnamomea . (A) Cuerpo de fructificación natural (B) el micelio
del cultivo de control a 25  ° C durante 30 días (C) el micelio del cultivo con  adición de 4 g de piel
de pomelo a 25  ° C durante 30 días.

3.5 . Comparación de los parámetros cinéticos de fermentación

Los parámetros cinéticos de fermentación de todas las fermentaciones en estado sólido se
calcularon y se enumeraron en la Tabla 1 , Tabla 2 para comparación. Los valores de las
concentraciones y las productividades se determinaron dividiendo el peso total del sustrato de 28
 g en una placa de Petri y 30 días como base. De acuerdo con los resultados indicados en la Tabla 1
, algunos tipos de polvo de cáscara obviamente no fueron beneficiosos tanto para el crecimiento
de micelios como para la tasa de producción de biomasa, lo que simultáneamente condujo a la
reducción de la tasa de producción de un producto relacionado con el crecimiento como el
polisacárido intracelular. Por ejemplo, cuando la cáscara de pomelo en polvo en la cantidad de 2 g
por placa, la tasa de producción de biomasa y polisacáridos intracelulares disminuyó de 0,0039  g /
g día y 0,5011  mg / g día del control a 0,0032  g / g día y 0,2725  mg / g día, respectivamente. Sin
embargo, la adición de polvo de cáscara de pomelo podría mejorar efectivamente la tasa de
producción de triterpenoide de 0.0386  mg / g día para el control a 0.1139  mg / g día. También se
observó una tendencia similar en la producción de polifenol total.

Cuadro 1 . Comparación de los parámetros cinéticos de fermentación en los cultivos con las
adiciones de diferentes peeling en polvo.

Pelar tipo Biomasa Triterpenoide (P1) Polifenol total (P2) Polisacáridos

intracelulares (IPS) (P3)

X máx. Q x (g / g P1 máx. Q P1 (mg / P2 máx. Q P2 (mg / P3 máx. (Mg / Q P3 (mg / g

(G / g) día) (Mg / g) g día) (Mg / g) g día) g) día)

Controlar 0,12 0,0039 1,15 0.0386 1.12 0.0375 15.03 0.5011

Pomelo 0,09 0,0032 3,42 0.1139 2,06 0.0686 8.17 0.2725

Limón 0,13 0,0046 2.23 0.0743 2,44 0.0814 14.41 0.4804

naranja 0,09 0,0029 1,97 0.0657 1.09 0.0364 12,74 0.4246

Mandarina 0,12 0,0043 1,80 0.0600 1,21 0.0404 17.30 0.5768

Cuadro 2 . Comparación de los parámetros cinéticos de fermentación en los cultivos con adiciones
de diferente peso de polvo de piel de pomelo.
Peso de la cáscara de Biomasa Triterpenoide (P1) Polifenol total Polisacáridos
pomelo en polvo (P2) intracelulares (IPS)
(P3)

X máx. Q x (g / P1 máx. Q P1 (mg P2 máx. Q P2 (mg P3 máx. Q P3 (mg / g

(G / g) g día) (Mg / g) / g día) (Mg / g) / g día) (Mg / g) día)

Controlar 0,12 0,0039 1,15 0.0386 1.12 0.0375 15.03 0.5011

0,5  g 0,18 0,0061 0,78 0.0261 1,87 0.0625 20,89 0,6964

1  g 0,16 0,0054 2,44 0.0814 3.11 0.1036 13,95 0.4650

2  g 0,09 0,0032 3,42 0.1139 2,06 0.0686 8.17 0.2725

4  g 0,13 0,0043 5,95 0.1986 3,05 0.1014 13.37 0.4457

8  g 0,22 0,0071 4.05 0,1350 3,93 0.1311 21,51 0,7171

Con respecto al efecto de agregar diferentes niveles de polvo de cáscara de pomelo presentado en
la Tabla 2 , es interesante notar que las adiciones de niveles más bajos tuvieron una influencia
positiva en la tasa de producción de biomasa, que fue diferente a la de la  adición de 2 g descrita
anteriormente. . Varios niveles de adición parecían ser beneficiosos para diferentes tipos de
productos. Con base en los resultados indicados en la Tabla 2 , se determinó que un nivel
adecuado para una alta tasa de producción de triterpenoides era de 4  g / placa, con lo cual el
valor podría aumentar de 0.0386  mg / g día para el control a 0.1986 mg / g día y tuvo un aumento
de más de cinco veces. Los resultados obtenidos son útiles en la regulación de la composición del
medio para la producción eficiente de biomasa y metabolitos bioactivos en la fementación en
estado sólido de A. cinnamomea .

4 . Conclusiones
Dado que A. cinnamomea es el hongo medicinal más valioso, la producción de micelios o cuerpos
fructíferos de A. cinnamomea en cultivos sumergidos o con fermentación en estado sólido ha
prosperado en Taiwán en los últimos años. En la actualidad, uno de los principales problemas del
proceso de fermentación en estado sólido es que normalmente toma mucho tiempo formar
cuerpos fructíferos. Para mejorar la eficiencia de la producción, el control de las condiciones
ambientales o la modificación de la composición de los medios sería vital. Sin embargo, se han
publicado muy pocos trabajos de investigación científica sobre la fermentación en estado sólido
de A. cinnamomea y en la actualidad hay poca información disponible [16] , [17] , [18] ,[19] ; esto
puede atribuirse en parte a las dificultades en el análisis cuantitativo del sistema de fermentación
en estado sólido.

Se ha demostrado que la adición de extracto de corteza o astillas de madera de C. kanehirai Hay es

favorable al crecimiento de A. cinnamomea . Sin embargo, C . kanehiraies una especie endémica y
en peligro de extinción en Taiwán. Los recursos forestales naturales de esta madera son limitados.
Por lo tanto, definitivamente vale la pena encontrar un sustituto para las astillas de madera. Entre
muchas fuentes, debido a que son ricas en aceites esenciales, se eligieron las cáscaras de cítricos
como aditivo medio. Mediante el uso de un sistema de fermentación en placa de Petri
simplificado, demostramos que cuando se usaba polvo de cáscara de cítricos en la fermentación
en estado sólido, obviamente se acortaba el período de tiempo para la formación de basidiomas;
además, algunos metabolitos bioactivos podrían producirse inductivamente en una etapa
anterior. Basado en la experiencia obtenida del uso de extracto de corteza o astillas de madera de
C. kanehiraiHay, estas funciones pueden estar asociadas con la presencia de aceites esenciales. Sin
embargo, aún se desconoce cómo los aceites esenciales de las cáscaras de los cítricos afectan el
metabolismo. Dado que muchos de estos aceites esenciales pertenecen a una familia de
compuestos conocidos como terpenos y terpenoides, algunos compuestos puros categorizados en
terpenos serán elegidos como un aditivo para comprender los mecanismos reales en el siguiente
estudio.

Reconocimiento
Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Ciencias de la República de China por el
apoyo financiero ( NSC 99-2221-E-029-020 ).

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