See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/250772179

Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de

resonancia magnética. Implicaciones clínicas

Article  in  Radiología · December 2008

DOI: 10.1016/S0033-8338(08)76333-1

CITATIONS READS

0 209

4 authors:

Paloma Ballesteros Elena Pérez-Mayoral

National Distance Education University National Distance Education University
117 PUBLICATIONS   2,136 CITATIONS    61 PUBLICATIONS   1,073 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Marina Benito Sebastián Cerdán

Hospital Nacional de Paraplejicos Institute for Biomedical Research “Alberto Sols“
30 PUBLICATIONS   432 CITATIONS    193 PUBLICATIONS   5,636 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

NMR Contrast Agents View project

Carbonic Anhydrase IX View project

All content following this page was uploaded by Paloma Ballesteros on 15 November 2018.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339)
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
RADIOLOGÍA ACTUALIZACIÓN
Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular
mediante métodos de resonancia magnética.
Implicaciones clínicas
P. Ballesterosa, E. Pérez-Mayorala,b, M. Benitoc y S. Cerdánc
a
Laboratorio de Síntesis Orgánica e Imagen Molecular por Resonancia Magnética.
b
Departamento de Química Inorgánica y Química Técnica. Facultad de Ciencias. UNED. Madrid. España.
c
Laboratorio de Espectroscopía e Imagen por Resonancia Magnética. Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols. CSIC. Madrid. España.
Se revisan los diversos métodos de medida de pH que
utilizan espectroscopía e imagen por resonancia magnética
y su potencial repercusión diagnóstica. La revisión comienza
con una breve descripción de la regulación del pH intra y ex-
tracelular en condiciones fisiológicas y patológicas. Poste-
riormente se presentan los principales procedimientos basa-
dos en espectroscopía de resonancia magnética de 31P ó 1H,
basados en la dependencia del pH de los desplazamientos
químicos del fosfato inorgánico intracelular intrínseco o del
protón H2 del imidazol en indicadores extrínsecos. Final-
mente se describen los procedimientos que utilizan imagen
por resonancia magnética, empleando como herramienta
principal la dependencia del pH de (i) la relajatividad de de-
terminados agentes de contraste paramagnéticos o (ii) de
los procesos de transferencia de magnetización entre molé-
culas diamagnéticas (DIACEST) o paramagnéticas (PARA-
CEST) y el agua libre de los tejidos. Se ilustran brevemente
las potenciales aplicaciones clínicas de estos nuevos proce-
dimientos.
Palabras clave: espectroscopía por resonancia magnética,
imagen por resonancia magnética, imagen molecular, pH.
Introducción
El pH intra- (pHi) y extracelular (pHe) representan en la actuali-
dad dos de las medidas del microentorno celular que contienen
mayor significación diagnóstica y pronóstica en las enfermeda-
des de prevalencia y morbilidad, incluyendo los episodios isqué-
micos, el cáncer y la neurodegeneración. Así, el ya clásico debate
sobre la relevancia de la homeostasis de pH como mecanismo
fundamental de regulación en fisiología y patología ha sido sus-
tituido, más recientemente, por el reconocimiento de la impor-
Correspondencia:
PALOMA BALLESTEROS. Laboratorio de Síntesis Orgánica e Imagen Mole-
cular por Resonancia Magnética. Facultad de Ciencias. UNED. Paseo Senda
del Rey, 9. 28040 Madrid. pballesteros@ccia.uned.es
Recibido: 31-X-07
Aceptado: 3-III-08
Radiología. 2008;50:463-70
05/11/2008 16:47 Página 463
Magnetic resonance imaging and
magnetic resonance spectroscopy
methods for measuring intra-
and extra-cellular pH: clinical
implications
We review the different methods for measuring pH by
magnetic resonance imaging and magnetic resonance spec-
troscopy and discuss their potential diagnostic repercus-
sions. We begin with a brief description of intra- and extra-
cellular pH regulation in physiological and pathological
conditions. Then we present the main 31P or 1H magnetic res-
onance spectroscopy procedures, which are based on the
dependence of the pH on the chemical displacements of the
intrinsic intracellular inorganic phosphate or of the H2 proton
of imidazole in extrinsic indicators. Finally, we describe the
procedures that use magnetic resonance imaging, whose
main tool is the dependence of the pH (i) on the relaxivity of
certain paramagnetic contrast agents, or (ii) on the processes
of magnetic transference between diamagnetic molecules
(DIACEST) or paramagnetic molecules (PARACEST) and the
free water in the tissues. We briefly illustrate the potential
clinical applications of these new procedures.
Key words: magnetic resonance spectroscopy, magnetic re-
sonance imaging, molecular imaging, pH.
tancia que tanto el pH como su regulación tienen en una gran
variedad de procesos biológicos1,2. Como consecuencia, los pro-
cedimientos experimentales empleados en la determinación de
los valores del pHi y pHe han experimentado un gran desarrollo
en los últimos años3. Simultáneamente se ha desplegado toda
una batería de nuevos procedimientos, conocidos como imagen
molecular, que permiten obtener no invasivamente imágenes de
la distribución de biomoléculas específicas y procesos funda-
mentales en Biomedicina4. Más concretamente ha sido posible
obtener imágenes de la distribución de diversas moléculas mar-
cadoras implicadas en el desarrollo de los procesos aterogénicos
y tumorales de la migración celular y de la reparación de lesio-
nes5-7.
Desde esta nueva perspectiva la presente revisión describe bre-
vemente los principales fundamentos de la regulación del pHi y
pHe, así como los principales métodos para medir estas variables
de manera resuelta en el espacio, y sus potenciales implicaciones
diagnósticas. Otras revisiones publicadas recientemente comple-
tan con más detalle algunos aspectos más específicos de la in-
formación presentada en este trabajo3,8.
463
(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339) 05/11/2008 16:47 Página 464
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.

Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas

Lac− H+ DIDS/SITS
Amiloride m.b.

+ Gluc GA3P Pyr Lac

RT ln H e Lac− H+
Vm = 1.000 Na+
F +
H i H+ ATP
Na+
DIDS/SITS
HCO3 - CO2

Mg ATP2− + H 2O
2K+ Cl −
3Na+ HCO3 -
Mg ADP− + Pi2− + H+
c.b.
pHi = 6,7
pHi pHi
Acetazolamida
CA
CO2 CO2 H2 CO3 HCO3− + H+
H2 O
m.b.
H2 CO3
Fig. 1. Regulación de pHi en una célula representativa. El pHi es el resultado del balance entre los proce-
sos que producen y consumen protones en el interior celular. Entre los procesos que producen protones
intracelulares (acidificantes) destacan la hidrólisis del adenosín trifosfato (ATP), la glucólisis y los fenóme-
nos de reducción. Entre los procesos que consumen protones intracelulares (alcalinizantes) cabe mencio-
nar la síntesis de ATP, los fenómenos de oxidación, la extrusión de lactato y protones intracelulares a
través del transportador de monocarboxilatos, el antitransportador Na+/H+ (sensible al amiloride) o el co-
transportador Na+/HCO3–.

de pHe ligeramente más alcalinos (pHe∼ 7,2-7,4 o 10-7,2-7,4),

Fundamentos de la regulación del pH intra y extracelular
Las propiedades generales de la regulación del pHi y pHe en tejidos
normales y patológicos1,2 se expresan normalmente empleando la
notación de Sorensen como pHi= -log [H+]i o pHe= - log [H+]e
donde [H+]i o [H+]e representan la concentración de protones in-
tracelulares o extracelulares libres. El pHi es el resultado del balan-
ce entre los procesos metabólicos que producen y consumen pro-
tones, la capacidad de tamponamiento intracelular y los procesos
de extrusión de protones al exterior celular. Por otro lado, el pHe
es el resultado del balance entre los procesos de producción de
protones derivados del metabolismo intracelular, y la capacidad
de retirar los protones acumulados en el medio extracelular por
las células circundantes y la microvasculatura. En este contexto
los valores de pHi y pHe reflejan el balance de una gran variedad
de procesos biológicos de la mayor relevancia, incluyendo siste-
mas metabólicos, mecanismos de tamponamiento intracelular y
extrusión de H+ u OH– y funcionamiento de la microvasculatura.
Si las concentraciones de protones intra- y extracelulares al-
canzasen el equilibrio con el potencial de membrana, el pHi de-
bería resultar aproximadamente una unidad de pH más ácido
que el pHe. Esto no sucede así, y en la mayor parte de los tejidos
el pHi es tan sólo 0,1-0,2 unidades de pH más ácido que el ex-
tracelular, lo que indica que existen sistemas muy importantes
de extrusión de protones al exterior celular, que mantienen el
gradiente de protones a través de la membrana plasmática aleja-
do del equilibrio termodinámico.
El correcto funcionamiento de estos sistemas produce valores
de pHi próximos a la neutralidad (pHi∼ 7,0 o 10-7 M), y valores
mientras que las perturbaciones patológicas provocan claras al-
teraciones en estos valores, llegando a invertir el gradiente de
pH en los procesos tumorales (pHi > pHe)9. En este contexto, las
medidas de pHi o pHe revelan el funcionamiento adecuado o no
de una gran plétora de sistemas de integración fisiológica, pro-
porcionando un asesoramiento global de la situación fisiológica
o patológica de un tejido o un órgano. Una descripción gráfica
más detallada (fig. 1) de los diversos procesos involucrados en
la regulación del pHi ayudará a comprender mejor su contribu-
ción a la homeostasis de pH y su significación fisiopatológica.
Entre los principales procesos metabólicos que producen o
consumen protones intracelulares cabe destacar las reacciones
red-ox ligadas al estado de oxigenación del tejido y las reaccio-
nes de síntesis y degradación del adenosín trifosfato (ATP), que
reflejan la bioenergética tisular10.
NADH + H+ + ½ O2 ↔ NAD+ + H2O [1]
ATP ↔ ADP+ Pi + H+ [2]
El consumo de oxígeno y la síntesis de ATP durante la respira-
ción tienden a alcalinizar el pHi mientras que los procesos de
formación de NADH e hidrólisis de ATP tienden a acidificarlo.
La capacidad de tamponamiento intracelular recae principal-
mente en la actividad de la anhidrasa carbónica, que cataliza la
hidratación-deshidratación del bicarbonato,
CO2 + H2O ↔ CO3H– + H+ [3]
aunque sin duda colaboran la gran cantidad de proteínas, fos-
folípidos y otros grupos ionizables intracelulares. Estos sistemas
totalizan una capacidad de secuestración de protones superior a
20 mM en el rango de pH fisiológico (6,9-7,0), una magnitud
de acidificación que raramente se excede.

464 Radiología. 2008;50:463-70

(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339) 05/11/2008 16:47 Página 465
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.

Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas

PCr

α-NTP β-NTP
Pi γ-NTP
PME PDE
Músculo normal
pH neutro o ligeramente alcalino
PC, PE
GPC, GPE

Rabdomiosarcoma

Fig. 2. Espectros de 31P RMN de un músculo normal (panel superior) y un rabdomiosarcoma (panel infe-
rior); α, β, γ-NTP: fosfatos α, β y γ de nucleosidotrifosfatos (principalmente adenosín trifosfato).
GPE: glicerolfosforiletanolamina; GPC: glicerolfosforilcolina; PC: fosforilcolina; PCr: fosfocreatina; PDE:
fosfodiésteres; PE: fosforiletanolamina; Pi: fósforo inorgánico; PME: fosfomonoésteres.

La alcalinización intracelular se lleva a cabo mediante dos sis-

temas principales, el intercambiador Na+/H+ (sensible al inhibi-
dor amiloride) que extruye protones intercambiándolos por Na+
extracelular, y el cotransportador Na+/HCO3– (sensible a los de-
rivados de estilbeno SITS), que incorpora bicarbonato externo
junto con Na+. Además, también contribuye apreciablemente a
la alcalinización intracelular, la extrusión de lactato intracelular,
Laci, que se lleva a cabo junto con un protón mediante los
transportadores de monocarboxilatos.
Laci ↔ Lace + H+ [4]
La acidificación intracelular se realiza principalmente me-
diante el intercambiador HCO3–/Cl–, que extruye bicarbonato
intercambiándolo por Cl– extracelular.
En los procesos isquémicos se produce un descenso en el
aporte de oxígeno a los tejidos, lo que ocasiona un incremento
en el metabolismo glucolítico y en la producción de lactato, y
un descenso concomitante en el pHi y pHe. Estas circunstan-
cias se acompañan frecuentemente en la aterotrombosis por
una reducción en la micro- o macrocirculación debida a la
presencia de un trombo, que impide retirar eficazmente los
protones acumulados en el medio extracelular y desencadena
un descenso aún más marcado del pHe. Algo similar ocurre en
los tumores, donde la incrementada capacidad glucolítica de
éstos origina una mayor producción de lactato y H+ al medio
extracelular, que no pueden ser retirados por la caótica organi-
zación de la neovasculatura angiogénica, resultando en un pHe
marcadamente ácido11. Finalmente, la acumulación de proteí-
na β-amiloide en el cerebro de pacientes de Alzheimer también
se ha vinculado a defectos mitocondriales y transiciones de
pH12. En resumen, las alteraciones en los valores de pHi o pHe
desempeñan un papel fundamental en una gran variedad de
procesos patológicos. En las siguientes secciones se describen
brevemente los procedimientos de medida de pH más utiliza-
dos empleando espectroscopía o imagen por resonancia mag-
nética (RM).
Medidas de pHi y pHe mediante espectroscopía
de resonancia magnética
Las primeras medidas del pHi, empleando espectroscopía de RM,
se llevaron a cabo en los años setenta13. Estos autores fueron ca-
paces de determinar el pHi de suspensiones de eritrocitos mi-
diendo, mediante 31P RM, el desplazamiento químico de la reso-
nancia del fosfato inorgánico, un compuesto distribuido en
todos los tejidos biológicos. El método se basaba en la depen-
dencia del pH con el desplazamiento químico de la resonancia
del fosfato inorgánico, debido al diferente apantallamiento del
grupo fosfato en sus diferentes estados de ionización. En gene-
ral, el desplazamiento químico de un núcleo próximo al grupo
ionizable (δ0) varía con el pH de acuerdo con la ecuación de
Henderson-Hasselbalch, expresada en función de los desplaza-
mientos químicos:
δ0-δAH
pH = pKa + log
δA-δ0
donde, δAH es el desplazamiento químico de la forma ácida, δA
el desplazamiento químico de la forma aniónica y pKa se define
como el –log Ka, siendo Ka la constante de acidez del grupo ioni-
zable. El procedimiento descrito resultaba fácil de aplicar, dada
la sencillez en la determinación de los diversos parámetros, ex-
tendiéndose muy rápidamente a los abordajes in vivo en cuanto
se desarrollaron las primeras técnicas de localización con bobi-
nas de superficie14.
La figura 2 muestra uno de los primeros espectros de 31P RM
tomado de un rabdomiosarcoma, comparándolo con el espectro
de un músculo normal15. El espectro del tejido tumoral muestra
un contenido superior de fosfomonoésteres (PME), principal-
mente fosfatidilcolina, un contenido similar de ATP y un valor
de pHi ligeramente más alcalino que el tejido muscular normal.
Esta última observación resultaba paradójica en aquel momento,

Radiología. 2008;50:463-70 465

(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339)
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas
A B Glioma
Contralateral
C D
, Poco después fue posible ampliar estos estudios a la determi-
E F
, ,
, ,
, ,
, , , , , ,
Fig. 3. Mapa de pH extracelular de un glioma C6 implantado en el
cerebro de una rata. (A) Espectro in vivo PRESS del hemisferio
contralateral. Nótese la ausencia de señales de ácido 3-etoxicar-
bonil-2-imidazol-1-ilpropiónico (IEPA) en la región de 8,0 ppm. (B)
Espectro in vivo PRESS del área vascularizada del tumor en el he-
misferio ipsilateral. Nótese la presencia de señales de IEPA. (C)
Imagen potenciada en T1 del cerebro del animal después de una
inyección de Gd(III)DOTA, mostrando el área perfundida del tu-
mor. (D) Mapa de la distribución de IEPA. (E) Curva de titulación
de pH del protón H2 de IEPA. (F) Mapa de pHe del tumor. Nótese
la heterogeneidad del pHe. Reproducida con permiso de García-
Martín ML, et al20.
pues según la hipótesis de Warburg los tumores presentaban un
alto grado de glucólisis anaerobia y su pH debería ser inferior al
de los tejidos normales. Experimentos posteriores permitieron
explicar esta observación, pues al utilizar indicadores de 31P RM
que no traspasaban la membrana plasmática fue posible demos-
trar que era el pHe, no el pHi, lo que resultaba más ácido en los
tumores que en los tejidos normales9. Esta contribución seminal
se completó con el primer diagnóstico de una enfermedad mole-
cular basado en medidas de pH. En efecto, en 1981 se le diag-
nosticó a un paciente la enfermedad de MacArdle (carencia de
fosforilasa b) por la incapacidad de acidificar el pHi de sus mús-
culos flexores del antebrazo durante un ejercicio sostenido16. Es-
tas contribuciones colocan actualmente a la espectroscopía de
31
P RM entre las técnicas que más han contribuido a la com-
prensión de los fundamentos moleculares y celulares de la pato-
logía. Sin embargo, 31P RM presentaba el importante inconve-
niente de su reducida sensibilidad. Esta limitación impedía
llevar a cabo medidas no invasivas de pH en volúmenes reduci-
dos y estudiar así la heterogeneidad de esta variable en situacio-
nes fisiológicas o patológicas.
466
05/11/2008 16:47 Página 466
Para superar este inconveniente, tanto nuestro grupo de inves-
tigación como otros propusieron la utilización de 1H RM para la
determinación del pHi y pHe en condiciones de mayor sensibilidad
y resolución espacial17,18. Sin embargo, los compuestos intracelu-
lares con resonancias de 1H sensibles al pH resultan muy escasos,
y su concentración es muy reducida, encontrándose por debajo
del límite de detección de la 1H RM. Por tanto, el desarrollo de la
1
H RM para medidas de pHi requería del uso de indicadores
extrínsecos sensibles a las variaciones de pHi. Los nuevos indica-
dores de pH para 1H RM que propusimos estaban basados en las
excelentes propiedades de ionización de la molécula de imidazol:
a) proximidad de su pKa al pH fisiológico, y b) las resonancias de
sus protones H-2, H-4 y H-5 aparecen en la región aromática (7-
8 ppm), muy alejadas de la mayor parte de las resonancias endó-
genas del entorno celular, lo que facilita la determinación del pH
en muestras biológicas. Con estas premisas preparamos una nue-
va serie de ácidos imidazolilalcanoicos, que fueron ensayados al
principio como sondas extrínsecas de pH en eritrocitos y cultivos
celulares17, y más tarde en esferoides de células tumorales19.
, nación del pHe en modelos de glioblastoma multiforme, induci-
,
dos mediante la implantación de células C6 en el cerebro de ra-
, tas adultas20. La infusión de IEPA (ácido 3-etoxicarbonil-2-
, imidazol-1-ilpropiónico) en estos animales permitió, por prime-
ra vez, medir el pHe regionalizado de estos tumores empleando
,
, técnicas de imagen espectroscópica21.
La figura 3 resume estos resultados en un glioblastoma repre-
, sentativo, mostrando los espectros in vivo del hemisferio contra-
lateral (fig. 3A) y del glioma (fig. 3B), las imágenes anatómicas
y distribución de la sonda (figs. 3C y 3D), la curva de titulación
de IEPA (fig. 3E) y el primer mapa de pHe obtenido in vivo (fig.
3F). La primera imagen espectroscópica de pHe permitió demos-
trar que la distribución del pHe es heterogénea en las diferentes
zonas del tumor, con una tendencia hacia mayor acidez en las
áreas internas, más próximas a su zona necrótica. Este estudio
permitió, además, obtener simultáneamente los mapas de la dis-
tribución del resto de los metabolitos observables como lactato,
ácido N-acetilaspártico, creatina y colina y establecer las correla-
ciones entre la distribución espacial de estos metabolitos y el pH
extracelular.
En la figura 4 es posible apreciar que el ácido N-acetilaspárti-
co no se encuentra en el tumor, mientras que la colina, la crea-
tina, el lactato y el IEPA se acumulan con diferentes patrones en
la periferia de la lesión donde ocurre el crecimiento. El IEPA y el
lactato presentan una distribución similar, pero no fue posible
demostrar entre ambas variables una correlación estadística-
mente significativa. Esta observación representó en su momento
un hallazgo importante, pues las interpretaciones previas pro-
ponían que el lactato era la principal causa de acidificación ex-
tracelular en tumores. Nuestros resultados mostraron, por pri-
mera vez, que existían causas adicionales a la concentración de
lactato que contribuían a la acidificación extracelular in vivo en
los tumores investigados20.
Más recientemente fue posible obtener imágenes multipa-
ramétricas que revelan la correlación entre el pHe y otras varia-
bles de importancia en la biología tumoral, como la perfusión
del tumor y el contenido de lactato22. En este abordaje se obtie-
nen, de la misma sección del tumor, imágenes de perfusión,
imágenes de pHe y del contenido en lactato (fig. 5). A cada tipo
de imágenes se les asigna una escala de colores y se obtiene una
imagen de fusión que combina la contribución de cada tipo pí-
xel por píxel. De esta manera fue posible detectar las regiones de
un tumor con mayor propensión a la metástasis, como aquellas
que combinan una contribución incrementada de perfusión re-
Radiología. 2008;50:463-70
(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339) 05/11/2008 16:47 Página 467
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.

Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas

Gd-DOTA Gd-DOTA Creatina NAA

Fig. 4. Imágenes potenciadas en T1 de un tumor C6 representativo después de la inyección de Gd(III)DOTA (0,1 mmol/kg) y
mapas de creatina, NAA, ácido 3-etoxicarbonil-2-imidazol-1-ilpropiónico H5, colina y lactato obtenidos mediante imagen
espectroscópica de 1H MRSI. Reproducida con permiso de García-Martín ML, et al20.

ducida, alto lactato y bajo pHe. Este abordaje es extensible a
combinaciones multiparamétricas de otras variables, y repre-
sentó una de las primeras “pruebas de principio” de la aplica-
ción de imagen multiparamétrica a la caracterización de los fun-
damentos fisiopatológicos de la metástasis tumoral.
Por último, la utilización de IEPA no estaba exenta de limitacio-
nes. En particular, requería la administración de dosis muy eleva-
das del compuesto, debido principalmente a su rápida velocidad
de eliminación renal. Para mejorar estas propiedades se sintetizó
más recientemente ISUCA, un derivado del IEPA con propiedades
farmacocinéticas y espectroscópicas más favorables17. Con el mis-
mo propósito se prepararon derivados de polioles con dos anillos
de imidazol magnéticamente equivalentes23.
Medidas de pHe mediante imagen por resonancia magnética
Las medidas de pHi y pHe llevadas a cabo mediante espectros-
copía de RM in vivo, mostradas en las secciones anteriores, no
permiten alcanzar la misma resolución espacial que se obtiene

8,0

A B 5,8 C
Fig. 5. Determinación de la capacidad metastásica de un tumor de mama MDA-MB.231 implantado en el flanco de un ratón hembra. (A) sec-
ción histológica teñida con hematoxilina-eosina. (B) Mapa de pH. (C) Imagen multiparamétrica que contiene la superposición de imágenes de
vascularización (rojo), permerabilidad (verde) y pH extracelular (azul). Las zonas con más capacidad metastásica aparecen de color púrpura.
Reproducida con permiso de Bhujwalla ZM, et al22.

Radiología. 2008;50:463-70 467

(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339)
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas
empleando los métodos clásicos de imagen por RM (IRM). Con
objeto de mejorar la resolución espacial de las medidas de pHe in
vivo se han puesto en funcionamiento nuevos métodos de medi-
da basados en la dependencia del pH de los tiempos de relaja-
ción o relajatividades de nuevas series de agentes de contraste
paramagnéticos, sensibles a pH. En este sentido, los complejos
de Gd(III) que presentan su relajatividad r1 o r2 (velocidad de re-
lajación en T1 o T2 por unidad de concentración) dependiente
del pH, en la región fisiológica, resultan de un interés especial.
Con ellos se pueden distinguir fácilmente, y con una elevada re-
solución, los tejidos tumorales (pH = 6,6-6,9) de los tejidos ve-
cinos sanos (pH = 7,2). En estos casos la protonación de un
átomo donador de electrones (O o N) compite con la captación
de una molécula de agua por el Gd(III), afectando de esta ma-
nera la relajatividad del complejo24,25. Se han desarrollado ligan-
dos cuyos complejos paramagnéticos presentan un relajatividad
suficientemente variable entre pH 3 y 8.
Los estudios con Gd(DOTAM-MP) revelan que el átomo de
Gd(III) está unido a los 4 átomos de oxígeno de los grupos ami-
da y a los 4 de nitrógeno del anillo de cicleno, completando así
la primera esfera de coordinación con una molécula de agua. Es-
ta situación permite que los grupos fosfonato queden libres y
sean los responsables de los cambios de relajatividad con el pH,
actuando sobre la segunda esfera de coordinación del comple-
jo26,27. Se entiende como primera esfera de coordinación aquellas
moléculas de agua directamente unidas al centro metálico com-
pletando su índice de coordinación. La segunda esfera de coordi-
nación está constituida por las moléculas de agua enlazadas me-
diante puentes de hidrógeno a las moléculas de agua de la
primera esfera de coordinación, o a determinados grupos fun-
cionales como carboxilato o fosfonato, presentes en el ligando
orgánico.
Tomando como base estos resultados se han diseñado otros
derivados que se comportan como agentes de contraste inteli-
gentes, que actúan también al nivel de la segunda esfera de co-
ordinación del lantánido. En este sentido, la combinación de
agentes de contraste dependientes o independientes de pH se ha
utilizado recientemente en la obtención de imágenes de pH en
patologías renales28,29 y en la obtención de imágenes de pH extra-
celular de gliomas30.
Una aproximación diferente es la que evita la interacción de
las moléculas de agua con el centro paramagnético mediante la
interposición de bicarbonato en el complejo Gd(DO3A-Ala)31.
En medio ácido (pH < 6) el bicarbonato se protona y es despla-
zado por dos moléculas de agua, lo que produce un aumento
importante en la relajatividad del complejo.
Sin embargo, todos los métodos de medida de pH basados en
relajatividad presentan el inconveniente de que los efectos ob-
servados dependen no sólo del pH, sino de la concentración lo-
cal del complejo utilizado. Para evitar este inconveniente Aimé
et al han propuesto un nuevo procedimiento de medida de pH
que resulta independiente de la concentración del complejo de
Gd(III)32. La validación del método se realizó con un derivado
macromolecular basado en poli-L-ornitina, cuyos grupos amino
terminales están parcialmente funcionarizados con un complejo
de Gd(III).
Otro de los abordajes utiliza la dependencia del pH en los
procesos de transferencia de magnetización entre moléculas io-
nizables y el agua libre o ligada circundante in vivo33,34. Las
moléculas utilizadas en este procedimiento eran inicialmente de
reducido tamaño, y se conocieron como agentes CEST (Chemical
Exchange Saturation Transfer). En este procedimiento la satura-
ción selectiva del grupo ionizable del agente CEST induce una
disminución en la resonancia del agua debido al proceso de in-
468
05/11/2008 16:47 Página 468
tercambio químico, que se evidencia en la imagen de RM como
un contraste negativo. Más tarde, el grupo de van Zijl estudió el
aumento en la especificidad y eficacia del intercambio emplean-
do macromoléculas con un gran número de sitios de intercam-
bio de desplazamiento químico similar, como la poli-L-lisina, el
ácido poliuridílico y algunos dendrímeros35,36.
Para que un compuesto sea considerado como agente CEST, el
protón intercambiable debe tener un desplazamiento químico
(ΔδA) superior a 2 ppm con respecto a la resonancia del agua.
Esto evita la saturación directa del agua al aplicar el pulso de
presaturación. La especificidad del efecto del agente CEST viene
determinada por la relación Δδ/kAC>1, donde kAC es la constante
de velocidad del intercambio del compuesto CEST entre ambas
poblaciones de protones, dependiente también de la temperatu-
ra y del entorno iónico del medio. El principal inconveniente de
los procedimientos CEST es que, debido al rápido intercambio
del agua entre el interior y el exterior celular, estos agentes no
permiten distinguir entre el pHi y el pHe.
A pesar de la elegancia del abordaje CEST los compuestos uti-
lizados presentan dos limitaciones importantes que han impedi-
do hasta ahora su desarrollo posterior. En primer lugar, el efecto
de transferencia de magnetización (TM) observado depende no
sólo del pH del entorno, sino también de la concentración local
del agente. Esto hace muy difícil distinguir en una imagen de
RM, como en el caso de la relajatividad, el verdadero origen del
contraste observado. Para evitar este inconveniente Balaban et al
propusieron la utilización de agentes CEST con dos o más sitios
de intercambio, de manera que la relación entre los intercam-
bios de ambos sitios resultase independiente de la concentración
del agente34.
Zhou et al han utilizado la metodología CEST entre los proto-
nes amídicos de proteínas y péptidos intracelulares y el agua pa-
ra obtener la imagen de pH en un proceso isquémico de cerebro
de rata36. En el modelo la señal medible en la imagen de RM se
recoge de los protones del agua libre del tejido. Al aplicar la sa-
turación sobre los protones unidos a la biomacromolécula (BM)
se produce un intercambio de magnetización entre ambas pobla-
ciones. Como consecuencia, la magnetización sobre la pobla-
ción de agua libre se ve afectada disminuyendo su señal, que
ahora contiene sólo aquellos protones que no han intercambia-
do su magnetización. Casi simultáneamente, Aimé y Sherry in-
vestigaron una nueva generación de agentes CEST paramagnéti-
cos (PARACEST), donde la frecuencia de los sitios de
intercambio estaba más alejada en desplazamiento químico
(aproximadamente 50 ppm) con respecto a la resonancia del
agua24,25,31,32. Esta situación permite observar directamente el
agua ligada a la molécula, y la transferencia de esta magnetiza-
ción a la señal del agua del disolvente.
Conclusiones y potenciales implicaciones clínicas
En resumen, hemos presentado los diversos abordajes que per-
miten obtener medidas del pHi y pHe con énfasis en los procedi-
mientos no invasivos de espectroscopía e imagen por resonancia
magnética. En general, los métodos de medida de pH mediante
espectroscopía resultan más robustos y proporcionan medidas
de pHi y pHe más precisas. Sin embargo, en las condiciones ac-
tuales, la resolución espacial de la espectroscopía por RM es
considerablemente inferior a la que proporcionan los métodos
de imagen por RM, ya sea de relajatividad o transferencia de
magnetización. La evolución posterior de estos últimos podría
Radiología. 2008;50:463-70
(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339)
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas
estar limitada por la incertidumbre en las medidas de pH que
proporcionan y la interferencia de otros procesos que afectan in-
herentemente al contraste IRM, como el movimiento rotacional
o traslacional de las moléculas de agua y su sensibilidad a facto-
res ambientales como la temperatura, la viscosidad y la tortuosi-
dad inherente a las estructuras biológicas investigadas.
Por último, las medidas de pH han permitido distinguir clara-
mente zonas de progresión tumoral o episodios isquémicos, así
como proporcionar estimaciones de la capacidad metastásica en
modelos de tumores. Estas importantes capacidades les confie-
ren un futuro prometedor en el diagnóstico y pronóstico de las
enfermedades con mayor prevalencia y repercusión social, como
la aterotrombosis, los episodios isquémicos y el cáncer. Sin em-
bargo, en la mayor parte de los casos, los resultados se encuen-
tran aún en fase de investigación preclínica, por lo que se re-
quieren todavía esfuerzos suplementarios para lograr su futura
implantación clínica. Finalmente, es posible que la información
que proporcionan las medidas de pHi y pHe en imagen o espec-
troscopía por RM se pueda complementar con la imagen de
marcadores de angiogénesis, neurodegeneración, etc., de manera
multiparamétrica, consiguiendo así definir más precisamente
todos los componentes fisiopatológicos de la enfermedad. En es-
te sentido trabajan nuestros laboratorios actualmente.
Agradecimientos
Este trabajo se ha financiado en parte con los proyectos
SAF2001-2245, SAF2004-03197 del Ministerio de Educación y Cien-
cia y FISss PI051530 del Instituto de Salud Carlos III a SC, SAF2003-
01810 y CTQ2006-06505/BQU del Ministerio de Educación y
Ciencia a PB y CM-S-BIO/0170/2006 de la Comunidad de Ma-
drid a SC y PB.
Bibliografía
1. Roos A, Boron WF. Intracellular pH. Physiol Rev. 1981;61:296-434.
2. Busa WB, Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular pH. Am J
Physiol. 1984;246:R409-38.
3. Khramtsov VV. Biological Imaging and spectroscopy of pH. Curr Org
Chem. 2005;9:909-23.
4. Weissleder R, Mahmood U. Molecular imaging. Radiology. 2001;219:316-
33.
5. Sosnovik DE, Weissleder R. Emerging concepts in molecular MRI. Curr
Opin Biotechnol. 2007;18:4-10.
6. Montet X, Montet-Abou K, Reynolds F, Weissleder R, Josephson L. Nano-
particle imaging of integrins on tumor cells. Neoplasia. 2006;8:214-22.
7. Nahrendorf M, Jaffer FA, Kelly KA, Sosnovik DE, Aikawa E, Libby P, et al.
Noninvasive vascular cell adhesion molecule-1 imaging identifies inflamma-
tory activation of cells in atherosclerosis. Circulation. 2006;114:1504-11.
8. Gillies RJ, Raghunand N, García-Martín ML, Gatenby RA. pH imaging. A
review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng
Med Biol Mag. 2004;23:57-64.
9. Gillies RJ, Morse DL. In vivo magnetic resonance spectroscopy in cancer.
Ann Rev Biomed Eng. 2005;7:287-326.
10. Moldes M, Cruz F, García-Martín M, García-Espinosa MA, Álvarez J,
Cerdán S. Effects of heavy water on hepatic intracellular pH and phospha-
tidylcholine turnover. A 31P NMR study. Cell Mol Biol. 1997;43:731-40.
11. Griffiths JR, McSheehy PM, Robinson SP, Troy H, Chung YL, Leek RD, et
al. Metabolic changes detected by in vivo magnetic resonance studies of
Radiología. 2008;50:463-70
05/11/2008 16:47 Página 469
HEPA-1 wild-type tumors and tumors deficient in hypoxia-inducible fac-
tor-1beta (HIF-1beta): evidence of an anabolic role for the HIF-1 path-
way. Cancer Res. 2002;62:688-95.
12. Chen YR, Huang HB, Chyan CL, Shiao MS, Lin TH, Chen YC. The effect
of Aβ conformation on the metal affinity and aggregation mechanism
studied by circular dichroism spectroscopy. J Biochem. 2006;139:733-40.
13. Moon RB, Richards JH. Determination of intracellular pH by 31P magne-
tic resonance. J Biol Chem. 1973;248:7276-8.
14. Ackerman JJ, Grove TH, Wong GG, Gadian DG, Radda GK. Mapping of
metabolites in whole animals by 31P NMR using surface coils. Nature.
1980;283:167-70.
15. Griffiths JR, Stevens AN, Iles RA, Gordon RE, Shaw D. 31P-NMR investi-
gation of solid tumours in the living rat. Biosci Rep. 1981;1:319-25.
16. Ross BD, Radda GK, Gadian DG, Rocker G, Esiri M, Falconer-Smith J.
Examination of a case of suspected McArdle’s syndrome by 31P nuclear
magnetic resonance. N Engl J Med. 1981;304:1338-42.
17. Gil S, Zaderenzo P, Cruz F, Cerdán S, Ballesteros P. Imidazol-1-ylalkanoic
acids as extrinsic 1H NMR probes for the determination of intracellular
pH, extracellular pH and cell volume. Bioorg Med Chem. 1994;2:305-14.
18. Gasparovic CV, Barba I, Born J, Barto S, Arús C, Mann P. A study of imi-
dazole based nuclear magnetic resonance probes of cellular pH. Anal Bio-
chem. 1998; 261:64-72.
19. Álvarez-Pérez J, Ballesteros P, Cerdán S. Microscopic images of intrasphe-
roidal pH by 1H magnetic resonance chemical shift imaging of pH sensiti-
ve indicators. Magn Reson Mater Phy. 2005;18:293-301.
20. García-Martín ML, Herigault G, Remy C, Farion R, Ballesteros P, Coles JA,
et al. Mapping extracellular pH in rat brain gliomas in vivo by 1H magne-
tic resonance spectroscopic imaging: comparison with maps of metaboli-
tes. Cancer Res. 2001;61:6524-31.
21. Van Sluis R, Bhujwalla ZM, Raghunand N, Ballesteros P, Álvarez J, Cerdán
S, et al. In vivo imaging of extracellular pH using 1H MRSI. Magn Reson
Med. 1999;41:743-50.
22. Bhujwalla ZM, Artemov D, Ballesteros P, Cerdán S, Gillies RJ, Solaiyappan
M. Combined vascular and extracellular pH imaging of solid tumors.
NMR Biomed. 2002;15:114-9.
23. Soler-Padrós J, Pérez-Mayoral E, Domínguez L, López-Larrubia P, Soriano
E, Marco-Contelles JL, et al. A novel generation of pH Indicators for pro-
ton magnetic resonance spectroscopic imaging. J Med Chem. 2007;50:
4539-42.
24. Zhang S, Merrit M, Woessner DE, Lenkinsky R, Sherry AD. PARACEST
agents: modulating MRI contrast via water proton exchange. Acc Chem
Res. 2003;36:783-90.
25. Zhang S, Wu K, Sherry AD. Gd3+ complexes with slowly exchanging
bound-water molecules may offer advantages in the design of responsive
MR agents. Invest Radiol. 2001;36:82-6.
26. Woods M, Zhang S, von Howard E, Sherry AD. pH sensitive modulation
of the second hydration sphere in lanthanide(III)tetraamide-DOTA com-
plexes: a novel approach to smart contrast media. Chem Eur J. 2003;9:
4634-40.
27. Woods M, Woessner DE, Sherry AD. Paramagnetic lanthanide complexes
as PARACEST agents for medical imaging. Chem Soc Rev. 2006;35:500-
11.
28. Raghunand N, Zhang S, Sherry AD, Gillies RJ. In vivo magnetic resonance
imaging of tissue pH using a novel pH-sensitive contrast agent, GdDOTA-
4AmP. Acad Radiol. 2002;9:S481-3.
29. Raghunand N, Howison C, Sherry AD, Zhang S, Gillies RJ. Renal and sys-
temic pH imaging by contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 2003;49:
249-57.
30. García-Martín ML, Martínez GV, Raghunand N, Sherry AD, Zhang S, Gi-
llies RJ. High resolution pH(e) imaging of rat glioma using pH-dependent
relaxivity. Magn Reson Med. 2006;55:309-15.
31. Aime S, Barge A, Botta M, Howard JAK, Kataky R, Lowe MP, et al. Depen-
dence of the relaxivity and luminiscence of gadolinium and europium
amino acid complexes on hydrogen carbonate and pH. Chem Commun.
1999;10:47-8.
32. Aime S, Castelli DD, Terreno E. Novel pH-reporter MRI contrast agents.
Angew Chem Int Ed. 2002;41:4334-6.
33. Ward KM, Balaban RS. Determination of pH using water protons and
chemical exchange dependent saturation transfer (CEST). Magn Reson
Med. 2000;44:799-802.
469
(463-470) Actualización-Espectroscopía e imagen...:01 Actualizacion 887 (333-339)
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 15/02/2010. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Ballesteros P et al. Espectroscopía e imagen del pH intra y extracelular mediante métodos de resonancia magnética. Implicaciones clínicas
34. Ward KM, Aletras AH, Balaban RS. A new class of contrast agents for MRI
based on proton chemical exchange dependent saturation transfer
(CEST). J Magn Res. 2000;79-87.
35. Goffeney N, Bulte JW, Duyn J, Bryant LH Jr, van Zijl PC. Sensitive NMR
detection of cationic-polymer-based gene delivery systems using satura-
tion transfer via proton exchange. J Am Chem Soc. 2001;123:8628-9.
36. Zhou J, Payen JF, Wilson DA, Traystman RJ, van Zijl PC. Using the amide
proton signals of intracellular proteins and peptides to detect pH effects
in MRI. Nature Med. 2003;9:1085-90.
Declaración de conflicto de intereses.
Declaramos no tener ningún conflicto de intereses.
AUTOEVALUACIÓN
1. Los procedimientos de imagen molecular son:
a) Técnicas invasivas que permiten obtener imágenes de bio-
moléculas.
b) Técnicas invasivas que permiten obtener imágenes de
moléculas implicadas en procesos tumorales.
c) Técnicas no invasivas que permiten obtener imágenes de
distribución de biomoléculas específicas implicadas en procesos
patológicos.
d) Técnicas no invasivas que permiten obtener imágenes de
moléculas marcadoras sólo de reparación de lesiones.
e) Ninguna de las anteriores.
2. El pH intracelular (pHi) es el resultado de:
a) El balance entre los procesos metabólicos que producen y
consumen protones.
b) La capacidad de tamponamiento intracelular y los procesos
de extrusión de protones.
c) Los procesos de extrusión de protones al exterior celular.
d) Los procesos que consumen protones.
e) a) y b) a la vez.
3. En los procesos tumorales el pH celular se caracteriza por:
a) El pH intracelular (pHi) y el pH extracelular (pHe) son
iguales y muy próximos a la neutralidad.
b) El gradiente de pH se ha invertido y el pHe es más ácido
que el pHi.
c) El pHe es ligeramente alcalino.
d) El pHe es superior al pHi.
e) El pH no se puede utilizar para identificar procesos tumo-
rales.
4. Las alteraciones en los valores de pH intracelular o pH ex-
tracelular desempeñan un papel fundamental en los siguientes
procesos:
a) En la digestión.
b) En la vigilia y en el sueño.
c) Solamente en la actividad de la anhidrasa carbónica.
d) En la degradación del ATP.
e) En las reacciones red-ox y en la síntesis y degradación del ATP.
470 Radiología. 2008;50:463-70
View publication stats
05/11/2008 16:47 Página 470
5. Las técnicas no invasivas utilizadas en la actualidad para
medir el pH intracelular y el pH extracelular son:
a) Microelectrodos.
b) Distribución de ácidos y bases débiles radiactivos.
c) Espectrofluorimetría con sondas fluorescentes.
d) Espectroscopia e imagen por resonancia magnética.
e) Tomografía por emisión de positrones.
6. Los primeros mapas de pH extracelular descritos in vivo se
han realizado con resonancia magnética utilizando:
a) Técnicas espectroscópicas de protón.
b) Técnicas espectroscópicas de protón con un derivado de
imidazol sensible a cambios de pH.
c) Técnicas de resonancia de 31P.
d) Técnicas espectroscópicas de protón utilizando histidina
intrínseca.
e) Combinando c) y d).
7. Los indicadores para la medida del pH intracelular y pH ex-
tracelular por imagen espectrocópica deben contener las si-
guientes propiedades:
a) Proximidad de su pKa al pH fisiológico.
b) Ser fácilmente ionizables.
c) El grupo indicador debe resonar en zonas alejadas de las re-
sonancias endógenas del sistema biológico.
d) Carecer de toxicidad y ser fácilmente eliminado.
e) Todas las anteriores.
8. La determinación regionalizada del pH extracelular en mo-
delos de glioblastoma multiforme con infusión de ácido 3-etoxi-
carbonil-2-imidazol-1-ilpropiónico (IEPA) permitió demostrar:
a) Que en el tumor no se pueden distinguir diferentes zonas
de acidez.
b) Que la distribución del pH extracelular es homogénea en
las diferentes zonas del tumor.
c) Que no se puede observar la distribución de lactato y N-
acetilaspártico.
d) Que se pueden establecer correlaciones entre la distribu-
ción espacial del pH extracelular y los metabolitos observables.
e) Que no se puede realizar la imagen anatómica.
9. La mejora de la resolución de las imágenes in vivo de pH
extracelular se ha realizado mediante:
a) La utilización de un espectrómetro de más alto campo.
b) El mantenimiento del animal en ayunas.
c) El empleo de imagen por resonancia magnética con com-
plejos de gadolinio(III) dependientes de pH.
d) La combinación de b) y c).
e) La utilización de un buen programa de tratamiento de ima-
gen.
10. Los métodos de imagen basados en transferencia de mag-
netización requieren las siguientes condiciones:
a) Empleo de agentes CEST (Chemical Exchange Saturation
Transfer).
b) Estado de vigilia del animal de experimentación.
c) Empleo de agentes PARACEST (agentes CEST paramagnéti-
cos).
d) a) y/o c).
e) Ninguna de las anteriores.