ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

PROYECTO DE FITOQUÍMICA

TEMA:

Estudio fitoquímico de Cinchona pubescens

1. DATOS GENERALES:

NOMBRE:

 JANNETH ARMIJOS 2769

 INGRID CHIMBORAZO 2793

 DOMENICA PALACIOS 2783

 MELISSA RAMÍREZ 2895

 BELEN SANTIAGO 2854

NIVEL: Quinto “A”

DOCENTE: Lic. Karen acosta. Msc.

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

2017/Julio/26 2017/Agosto/01

1
 RIOBAMBA, 2017

DEDICATORIA

La concepción de este proyecto está dedicada los

docentes, pilares fundamentales en nuestra formación
académica. Sin ellos, jamás hubiésemos podido
conseguir los conocimientos que día a día se siguen
fortaleciendo.

De igual manera dedicamos este trabajo a cada uno de

nuestros padres, su tenacidad y lucha insaciable han
hecho de ellos el gran ejemplo a seguir.

A todos ellos este proyecto, ya que sin ellos, no

hubiese podido ser.

2
Primero y antes que nada, damos gracias a Dios, por
estar con nosotros en cada paso que damos, por
fortalecer nuestros corazones y por haber puesto en
nuestro camino a aquellas personas que han sido
soporte y compañía durante todo el periodo de
estudio.
A la Lic. Karen Acosta. Msc, por el tiempo y entrega
total para el desarrollo del mismo, con su aporte
diario para una buena obtención de resultados, por
toda su paciencia para con nosotros también a la
B.Q.F Yolanda Buenaño conjuntamente con la Srta.
Cristina Salazar por la ayuda brindada, a todos
quienes conforman los laboratorios aledaños al de
Recursos Naturales por la disponibilidad para el
momento del desarrollo de las pruebas, y obtención
de reactivos.

A todos ellos ¡muchas gracias!

Janneth, Ingrid, Doménica, Melissa y Belén

AGRADECIMIENTO

3
4
RESUMEN

El objetivo de esta investigación fue evaluar el control de calidad de Cinchona

pubescens usando diferentes tipos de análisis, ya sea organolépticos,

macromorfológicos y fisicoquímicos. En este estudio se efectuó el control de calidad de

5
la droga cruda, previo al análisis. Se realizó un tamizaje fitoquímico para la obtención

de extractos etéreo, etanólico y acuoso, en los se llevaron a cabo diferentes ensayos

cualitativos, en donde evidenció la presencia de alcaloides, grasa, catequinas,

compuestos fenólicos y flavonoides mediante los ensayos específicos para cada

metabolito estudiado. El análisis fisicoquímico se ejecutó con el fin de conocer

características físicas y químicas las mismas que abarcan: densidad relativa, pH, sólidos

totales, análisis capilar. Para la extracción de alcaloides, se utilizó éter di etílico y

cloroformo formando dos fases y mediante cromatografía en capa fina, UV, IR, se

identificó metabolitos presentes en Cinchona pubescens.

Palabras Clave: <EXTRACTO ACUOSA>, <CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

[TLC]>, <ALCALOIDES>, <FLAVONOIDES >, <TAMIZAJE FITOQUIMCO >,

<UV> , <IR >, <FASE CLOROFORMICA >, <CORTEZA [Cinchona pubescens] >

6
7
INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales han sido utilizadas desde épocas primitivas en el

tratamiento de enfermedades, ya que la mayoría de éstas, presentan efectos

fisiológicos múltiples, debido a la presencia de más de un metabolito secundario

con actividad farmacológica.

La importancia de Cinchona pubescens desde la antigüedad ha sido debido a su

uso medicinal gracias a los alcaloides que posee lo que ayuda a un buen tratamiento

de la malaria antes mencionada. (Cifuentes, 2013)

Actualmente, la corteza de quina se usa en el tratamiento de la malaria,

hemorroides, calambres en los pies, anestésico analgésico, antiséptico, astringente,

febrífugo.

El “árbol de la quina” ó “cascarilla” ha sido una especie representativa de nuestra

riqueza natural vegetal. Las clases de árboles de quina según su contenido en

alcaloides se clasifican en Quina amarilla o C. calisaya; Quina roja o C. succirubra

actualmente C. Pubescens Vahl; Quina gris o C. officinalis L existentes en el país.

La Cinchona pubescens se distribuye en ambas vertientes de la Cordillera de los

Andes, desde Colombia, Ecuador, Perú, hasta Bolivia; se localizan en altitudes

comprendidas entre los 1.000 y los 3.000 metros snm, y principalmente en zonas

muy lluviosas, de intensa humedad y temperatura media constante. (Cifuentes,

2013)
OBJETIVOS.

Objetivo General.

 Realizar un estudio fitoquímico de Cinchona pubescens mediante métodos de

caracterización, extracción, purificación e identificación de metabolitos

secundarios.

Objetivos Específicos.

 Determinar mediante ensayos físico-químicos el porcentaje de humedad por el

método de secado en estufa de aire caliente presente en la droga vegetal de la

planta Cinchona pubescens.

 Realizar la determinación de cenizas totales solubles en agua e insolubles en

HCl mediante el método de incineración en la mufla que se encuentran

presentes en la droga vegetal de la planta Cinchona pubescens.

 Diferenciar el porcentaje de humedad obtenido de las cenizas solubles en agua

con respecto al porcentaje obtenido de las cenizas insolubles en HCl que están

en la droga vegetal Cinchona pubescens.

 Analizar los extractos acuoso, etéreo y alcohólico de Cinchona pubescens.

 Analizar los métodos y ensayos fisicoquímicos a realizarse para la obtención de

alcaloides de Cinchona pubescens y verificar con fuentes confiables si los

resultados obtenidos en las diferentes prácticas de los extractos etéreo, acuoso y

alcohólico se asemejan entre sí.

 Identificar cualitativamente los metabolitos presentes en Cinchona pubescens

aplicando métodos cromatográficos y espectrofotométricos

1
 CAPITULO I

1. MARCO TEÓRICO

1.1 Nombre científico

 Cinchona pubescens

1.2 Nombre común

 Quina roja, quina o cascarilla

Familia Rubiaceae

:
Género Cinchona
Especie: C.pubescens
Clase: Magnoliopsida

1.3 Descripción botánica

1.3.1 La corteza externa es de color marrón oscuro, ligeramente fisurada y

desprende pequeñas placas en forma irregular.

1.3.2 Las hojas varían en forma desde casi orbiculares o lanceoladas;

algunas son pubescentes; otras son lisas. Todas tienen una vena media bien

desarrollada con venas laterales más o menos prominentes. Son simples,

2
 opuestas y recusadas, de forma elíptico-ovalada; hojas de 8 a27 cm de largo

y 7 a18 cm de ancho.

1.3.3 Las flores se encuentran en panículas terminales de 20 a 25 cm de

longitud, son hermafroditas, actinomorfas; la corola es blanca-roja. Los

frutos son cápsulas de color marrón oscuro, de forma elipsoide, dehiscente.

Las semillas son fusiformes, redondeada por un ala membranosa, son de 7-

10 mm de largo, 2-3 mm de ancho y son ligeras para su 3 tamaño, puesto

que un gramo puede contener más o menos 9,000. El desarrollo,

particularmente en los primeros años, es rápido: los árboles de 6 a 8 años de

edad pueden alcanzar 12 m de altura.

1.3.4 Las ramas principales parten del tronco a una altura de más o menos

6 m, puesto que las ramas bajas son desechadas continuamente. (Cifuentes,

2014)

1.4 Distribución geográfica

Es una especie forestal de gran valor medicinal, comercial y ecológica se encuentra

distribuido desde Costa Rica hasta Bolivia es un árbol originario de los Andes

(principalmente Colombia, Perú, Bolivia, Ecuador, Guatemala).

En el Perú, se distribuyen a lo largo de los bosques montanos nublados desde el

extremo norte, en el Departamento de Cajamarca, hasta la frontera sur en Puno

exactamente se encuentra en ambas vertientes de la Cordillera de los Andes, en los

departamentos de Piura, Cajamarca, Amazonas, Lambayeque, Huánuco, Paseo,

3
Junín, Cusco y Puno, entre los 400 a 3,200 msnm. (Percy, 1989), además las

poblaciones del árbol de Cinchona pubescens crecen en el bosque Puyu Sacha

donde es un importante árbol nativo donde es su hábitat natural. (Puyu, 2010)

Ha sido introducida en otras partes de Centroamérica y México, las Antillas, las

Galápagos (Figura 1) , Hawai (Figura 2) y las regiones tropicales de África y

Asia. En Colombia presente en las tres cordilleras, entre 1300 y 3000 m.

[ CITATION Fab10 \l 12298 ]

Grupos de islas de Galápagos: Santa Cruz.

11,000 ha en Santa Cruz.

Preferencias de zona de altitud en Galápagos: Zona húmeda.

Distribución nativa: Distribución natural es de Costa Rica a Bolivia a una altura

entre 300 y 3300 m. (Gráfico 1)

Figura 1: Cinchona en Galápagos

4
 Figura 2: Distribución en Hawái

1.4.1 Hábitat

Originaria de los bosques neotropicales, prefiere sitios de tierras altas húmedas y

cálidas. Tolerante a la sombra y se puede tolerar un amplio rango de condiciones

ecológicas, incluyendo la sequía. (Dolma, 2014)

Actualmente se cultivan en diversos países con clima tropical de Asia (Java, India),

Sudamérica y África.

A menudo crece en quebradas escarpadas de difícil acceso y en hábitats

perturbados en su área de distribución natural en el Ecuador, así como en Hawái y

las Islas Galápagos. Los suelos en Ecuador son de origen volcánico y rica en

materia orgánica, nitrógeno y fósforo, cálido y ligeramente ácido. (Dolma, 2014)

5
1.5 Usos tradicionales

1.5.1 Maceración: Se deja macerar 20 – 30 g de corteza de quino en un litro de

agua durante una hora y se administra una taza de cada una de las tres comidas

diarias. (Cossio,sf)

Infusión: con media cucharadita de café de corteza de quina machacada o

pulverizada por cada taza de agua; se toma una taza antes de cada comida, sin

sobrepasar las cuatro tazas al día.

Uso Externo Compresas: con una decocción de 30-40g de corteza por litro de

agua. Hervir durante diez minutos. Con el líquido resultante, se empapan

compresas que se colocan sobre la piel o el cuero cabelludo, unos diez minutos, tres

veces al día. (Flores,sf) Gargarismos y enjuagues bucales con esta misma

decocción.

1.6 Estudios fitoquímicos

El estudio fitoquímico de las plantas permite aislar e identificar los principios

activos de plantas con actividad biológica. En estudios realizados a la Cinchona

pubescens se ha logrado identificar que contiene alcaloides, amino grupos, taninos,

grupos fenólicos, terpenos, quinonas, catequinas, saponinas y flavonoides.

Este estudio se realizó en la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo en el

laboratorio de Productos Naturales.

Para determinar la presencia de alcaloides de la quina se utilizó métodos a partir de

la preparación del extracto etanólico por maceración y fraccionamiento en

6
 subextractos clorofórmico, butanólico y clorofórmico basificado, mediante

cromatografías en capa fina, se tamizó fitoquímicamente dando flavonoides y

alcaloides.

Existen otros alcaloides de la quina que contiene un grupo OH en lugar del grupo

metoxi como la cupreína; epiquinina, también se han detectado los flavonoides (+)-

catequina, kaempferol, apigenina, y glicósidos así como marcador quercetina,

triterpenos: ácidos monoglicosidos amargos, como ácido quinóvico (ácido3β-

hidroxiurs-droxibenzoico), también contiene taninos catéquicos (3-5) y saponinas,

resina, trazas de aceite esenciales.

Figura 3: Estructuras de Cinchona pubescens

Desarrollo de formulaciones de fito – cosméticas antioxidantes empleando como

sustancia activa el extracto seco de Cinchona pubescens Vahl, RUBIACEAE

(Cascarilla)

7
En el análisis se logró obtener un 2% de flavonoides y mediante cromatografía de

capa fina se separó los flavonoides y se obtuvo apigenina, quiercetina, koempferol,

dihidroflavona y compuestos fenólicos no identificados, aunque por su coloración

amarilla en el espectro se sabe que son antioxidantes. (Barukcic y Sola, 2015)

1.7 Estudios de actividad biológica / farmacológica

Se ha estudiado la polimerización de hematina a β-hematina (pigmento

hemacarínico o palúdico) en soluciones de acetato ácido mediante espectroscopía

infrarroja. Se encontró que la reacción se producía espontáneamente entre 6 y

65ºC, en acetato 0,1-4,5 M y pH 4,2-5,0. Se descubrió que los fármacos

antipalúdicos quinina, cloroquina y amodiaquina bloqueaban la formación

espontánea de β-hematina, mientras que la 9-epiquinina y la 8-hidroxiquinolina

inactivas antipalúdicos no tenían efecto sobre la reacción, al igual que la

primaquina, un fármaco activo sólo Contra las etapas exo-eritrocíticas de la

infección. Se argumenta que los agentes antimaláricos intra-eritrocíticos activos

actúan uniéndose a la hematina, bloqueando la formación de β-hematina y dejando

hematina tóxica en las vacuolas alimentarias del parásito. [CITATION Tim12 \l 12298 ]

Dos científicos, Pelletier y Caventou, aislaron un alcaloide de quinolina en la

corteza que proporcionó el más alto efecto antipalúdico y lo nombró Quinina. Una

vez descubierto, se desarrollaron métodos para extraer la quinina de la corteza

natural para venderla como antimalárico droga.

La quinidina que es uno de los componentes de la Cinchona pubescens según

estudios se puede utilizar para tratar la malaria (Wagner1981).

8
Los primeros tratamientos contra el paludismo se basaron en las cualidades

febrífugas de la corteza del árbol de la quina (Cinchona sp.) utilizada desde 1638.

El aislamiento por Pelletier y Caventou en 1820 de los alcaloides de la quina,

quinina y cinconina y posteriormente de sus derivados, permitió eliminar al hombe

enfermo como fuente infectiva. En los años cuarenta del siglo XX comenzó la

utilización de los insecticidas, DDT y Lindano que suponía luchar contra la malaria

de forma barata y generalizada. En España los conocimientos sobre el paludismo se

dieron a conocer por el Dr. Jan Macdonald, médico de la Compañía Minera de

Riotinto en 1900, por los doctores Huertas y Mendoza en Cáceres en 1901 y por el

Dr. Pittaluga en Cataluña, Valencia, Islas Baleares y Madrid en 1902. Pittaluga

estudió la distribución y extensión del paludismo en España y lo relacionó con

temperatura y humedad elevada, encharcamientos locales, aglomeraciones

humanas y condiciones sanitarias desfavorables.[ CITATION Fer11 \l 12298 ]

Según estudios adicionales se encuentra además de esto que ayuda a problemas de

arritmias cardíacas, y para tratar la fibrosis muscular.

La quina es digestiva, colagoga y aperitiva, se usa para falta de apetito.

Además es astringente.

Actúa contra arritmias cardíacas.

Es antiséptica y febrífuga, para fiebre y gripe.

La quinina mata los patógenos de la malaria.

En uso externo sirve contra la alopecia. [ CITATION Cap14 \l 12298 ]

9
 CAPÍTULO II

2. MARCO METODOLÓGICO.

2.1. Lugar de la investigación.

Esta investigación se realizó en los laboratorios de Recursos naturales y Análisis

Instrumental de la Escuela de Bioquímica y Farmacia de la Facultad de Ciencias de la

Escuela Superior Politécnica de Chimborazo.

2.2. Recolección del material vegetal.

Para la presente investigación se utilizó la corteza de Cinchona pubescens, mismas que

fueron adquiridas en el Mercado “La Condamine” perteneciente al cantón Riobamba,

provincia de Chimborazo.

2.3. Identificación del material vegetal.

Para la identificación de la planta se tomó como referencia la corteza , la especie

vegetal no fue identificada por un especialista en el tema, pero las personas que venden

este droga vegetal son los que logran distinguir una especie de otra, aunque las

diferentes especies de Cinchona presentan similares características, se decidió utilizar

la corteza de Cinchona pubescens.

10
2.4. Materiales, equipos y reactivos.

Para la presente investigación se usaron los siguientes materiales, equipos y reactivos;

detallados a continuación:

2.4.1. Material Vegetal.

Se utilizó la corteza de Cinchona pubescens, previamente esta fue secada durante un

corto tiempo en la estufa de secado, debido a su bajo porcentaje de contenido de agua y

así continuar con la molienda del material vegetal seco y obtener pequeñas partículas

con el objetivo de aumentar la superficie de contacto de la droga con los solventes

utilizados.

2.4.2. Materiales de laboratorio utilizados.

Tabla 1: Descripción de los materiales de laboratorio utilizados para el estudio

fitoquímico de Cinchona pubescens

CONTROL DE CALIDAD DE MATERIA PRIMA

 Cápsulas de porcelana
 Piseta
 Reverbero
 Crisoles de porcelana
 Pinzas para cápsulas
TAMIZAJE FITOQUÍMICO
 Frascos ámbar de 250 Ml
 Embudos simples
 Trípodes
 Vasos de precipitación de 250Ml
 Tubos de ensayo
 Gradilla
11
  Pipeta 10Ml
 Pipeta de 5Ml
 Pipeta de 1Ml
OBTENCIÓN DEL EXTRACTO
 Tubos de ensayo
 Embudo de separación
 Kitasato de 250 Ml
 Embudo Buchner
 Probeta 50Ml
 Probeta 100Ml
 Pipeta 10 Ml
 Pipeta 5Ml
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
 Cuba cromatográfica
 Capilares
 Pipeta 5Ml
 Vasos de precipitación 50Ml
 Vaso de precipitación de 5 ml
 Vidrio reloj
ESPECTROSCOPÍA UV
 Tubos de ensayo de 10Ml
 Frascos ámbar 50Ml
 Pipetas 10 Ml
 Jeringas 10Ml
 Jeringa 5Ml
 Micropipeta automática de 1000Ul
 Micropipeta automática de 100Ul
INFRARROJO (IR)
 Pipetas Pasteur
CUANTIFICACIÓN (ESPECTRO UV)
 Vasos de 50Ml
 Balones aforados de 10Ml
 Balones aforados de 50Ml
 Probeta de 50Ml
 Micropipeta automática de 1000Ul
 Micropipeta automática de 100Ul
 Tubos de vidrio de 10Ml
 Puntas azules de 1000Ul
 Puntas amarillas de 100Ul

2.4.3. Equipos.

Tabla 2: Equipos utilizados en la investigación de Cinchona pubescens

ANÁLISIS EQUIPOS

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 Molino
Sonicador
Estufa
Mufla
Control de calidad materia Desecador
Balanza analítica
prima y

Tamizaje Fitoquímico
Rotavapor
Obtención del extracto Congelador
Liofilizador
Control de calidad del extracto Refractómetro
pH-metro
Cromatografía en capa fina Cámara UV
Espectrofotómetro
Espectroscopia UV
Balanza analítica
Infrarrojo (IR) Espectrofotómetro infrarrojo

2.4.4. Reactivos.

Tabla 3 Descripción de los reactivos utilizados para estudio fitoquímico de Solanum

tuberosum.

ANÁLISIS REACTIVOS
Tamizaje fitoquímico  Reactivo de Dragendorff

 Reactivo de Mayer

 Reactivo de Wagner

 Reactivo de Baljet

 Reactivo de Lieberman Buchard

 Reactivo para Catequinas

 Reactivo para resinas

 Reactivo de Fehling

 Reactivo de FeCl3

 Reactivo de Borntrager

 Reactivo de Shinoda

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  Reactivo de Antocianidinas

 Cloruro férrico

 Magnesio metálico

 Cloruro de sodio (polvo)

 Etanol 70%

Obtención del extracto  Agua destilada

 Éter
 Placa de Silicagel

 Agua destilada
Cromatografía en capa fina
 Cloroformo: metano (80:20)
(TLC)
 Acetato de Etilo: ac fórmico: ac

acético: agua (100:11:11:26)

 Agua destilada
Espectroscopía UV
 Metanol 98%

2.5. Técnicas y métodos.

2.5.1. Control de calidad de drogas vegetales - Análisis organoléptico y

macromorfológico

2.5.1.1. Información de la especie:

Se debe identificar el nombre común y científico de Cinchona pubescens, del mismo

modo si es planta endémica o aclimatada, familia botánica, usos tradicionales y demás

aspectos que se consideren importantes

2.5.1.2 Características organolépticas:

 Color:

Observación de las partes aéreas y subterráneas.

14
  Olor:

Se trituró en diferentes partes la corteza y se apercibió el aroma

 Sabor:

Se realizó cortes en la corteza de la planta para saborearlo rápidamente.

2.5.1.3. Características botánicas Macromorfológicas:

 Órganos aéreos

Tallo: Se observó el tallo la corteza de la droga vegetal, donde se determinó el tamaño

aproximado, color, forma, superficie.

2.5.2. Determinación de los parámetros de control de calidad de droga cruda.

2.5.3. Determinación de cenizas totales

Procedimiento:

Previo la realización del análisis se tara los crisoles, se pesa en la balanza analítica de 2-

3 gramos de la droga pulverizada y tamizada. En un reverbero calentar el crisol con la

muestra hasta llegar a la calcinación, luego de ello trasladar el crisol a la mufla (700-

750ªC) durante 2 horas. Trascurridas las 2 horas apagar la mufla y esperar hasta que la

temperatura este por lo menos hasta 200ªC, entonces pasar al desecador al crisol hasta

que se enfríe. Una vez que el crisol esta frio, pesar en la balanza.

Cálculos:

g de residuio fijo
%Cenizas= x 100
muestra

G de residuo fijo: (crisol + residuo) - (peso del crisol vacío) [CITATION Abi13 \l 3082 ].

15
2.5.3.1. Determinación de cenizas solubles en agua:

Procedimiento

A las cenizas totales, añadir 15 ml de agua destilada y calentarla hasta ebullición por 5

min, el crisol debe estar tapado. Filtrar la solución y pasar al crisol anterior el filtro con

el residuo y calcinar. Una vez calcinado llevar a la mufla (700-750ºC) por 2 horas,

trascurrido esto pasar al desecador al crisol hasta que enfríe, pesar y repetir el proceso

hasta el peso constante [ CITATION Sot11 \l 3082 ]

Cálculos:

M 2−Ma
%CH 2O= ×100
M 1−M

%CH2O= Porcentaje de cenizas solubles en agua

M2= Masa de cenizas totales + crisol en gramos

Ma= masa en gramos de cenizas insolubles en agua

M1= masa de muestra inicial en gramos

M= masa de crisol vacío

2.5.3.2. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico

Procedimiento:

16
A las cenizas insolubles en agua, disolverlas en 2-3 ml de HCl al 10% y tapar el crisol.

Calentar la solución a baño de agua por 10 min, después enjuagar la tapa con 5 ml de

agua caliente y verter en el mismo crisol. Filtrar la solución obtenida y el residuo lavar

con ácido nítrico (a este se añade 1-2 gotas de nitrato de plata 0,1M), hasta que esté

libre de cloruros, secar en estufa a 105ºC. Una vez realizado esto, colocar en el crisol y

meter en la mufla por 2 horas a 700-750ºC. Sacar y meter en desecador hasta su

enfriamiento y pesar, repetir el proceso hasta peso constante. [ CITATION Sot11 \l 3082 ]

Cálculos:

M 2−M
B= ×100
M 1−M

B= Porcentaje de cenizas insolubles en acido

M = masa del crisol con la porción de ensayos en gramos

M2= masa del crisol con la ceniza en gramos

2.5.3.3 Determinación de Humedad

Procedimiento:

Se debe tarar con anticipación las capsulas, pesar por diferencia en balanza analítica 2

gramos de muestra y llevar a la estufa a 105ºC por 3 horas. Una vez pasadas las 3 horas,

enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Volver a meter en la estufa y

repetir el proceso hasta peso constante.

Cálculos:

M 2−M 1
%H = ×100
M 2−M

17
%H= Porcentaje de humedad

M2= Masa de capsula con muestra original en gramos

M1= Masa de capsula con muestra desecada en gramos

M= Masa de capsula vacía

2. 5.4 Tamizaje fitoquímico.

Las pruebas de “screening” o tamizaje fitoquímico permiten identificar los metabolitos

primarios y secundarios que posee la droga vegetal mediante reacciones de coloración o

precipitación y que son de interés fitoquímico.

Las pruebas de tamizaje fitoquímico se caracterizan por ser sencillas, rápidas y muy

selectivas para la determinación de clases o grupos de compuestos químicos que

contiene la droga vegetal, utilizando un mínimo de recursos instrumentales de

laboratorio. Después de haber determinado los parámetros de calidad de la droga cruda

se procedió a realizar los extractos para realizar el tamizaje fitoquímico de la planta.

Procedimiento:

Las partes aéreas de la planta seca (tallos, hojas y flores), se sometieron a extracciones

sucesivas con solventes de diferente polaridad como se muestra en el esquema a

continuación basado en Las Normas Ramales de drogas crudas, extractos y tinturas

(Miranda, 2006).

18
Obtenidos cada uno de los extractos se procedió a realizar las diferentes reacciones de

identificación de metabolitos secundarios siguiéndose los esquemas basados en Las

Normas Ramales de drogas crudas, extractos y tinturas (Miranda, 2006).

La metodología de los ensayos descritos anteriormente para la realización del tamizaje

fitoquímico de los diferentes extractos se detallan a continuación y se basan en las

Normas Ramales de drogas crudas, extractos y tinturas (Miranda, 2006).

2.5.4.1. Ensayo de Sudán.

Detecta la presencia de compuestos grasos, para la realización de este ensayo se

tomaron 5 mL del extracto y se le añadió 1 mL de colorante de Sudán III o Sudán IV.

Se calentó en un baño de agua hasta evaporar el solvente. El ensayo se considera

positivo si aparecen gotas o una película coloreada de color rojo en el líquido o en las

paredes del tubo de ensayo (Miranda, 2006).

2.5.4.2. Ensayo de Dragendorff.

Este ensayo detecta la presencia de alcaloides, para la realización del ensayo se tomó

una a una alícuota del extracto, se evaporó el solvente y el residuo se disolvió en 1 mL

de ácido clorhídrico al 1% en agua. En el caso del extracto acuoso, se añadió una gota

de ácido clorhídrico concentrado. A la solución acuosa ácida se agregó 3 gotas del

reactivo de Dragendorff. El ensayo se considera positivo cuando existe opalescencia

(+), turbidez definida (++) y precipitado (+++) (Miranda, 2006).

2.5.4.3. Ensayo de Mayer.

19
Este ensayo al igual que el descrito anteriormente detecta la presencia de alcaloides,

para lo cual se procedió de la misma forma descrita anteriormente hasta obtener la

solución ácida. Posteriormente, se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo,

se agitó y se filtró; finalmente, se agregaron 3 gotas del reactivo de Mayer. El ensayo

se considera positivo cuando existe opalescencia (+), turbidez definida (++) y

precipitado (+++) (Miranda, 2006).

2.5.4.4. Ensayo de Wagner.

Este ensayo también detecta la presencia de alcaloides, para la realización de este

ensayo se procedió de la misma forma que los ensayos descritos anteriormente hasta

obtener la solución ácida; posteriormente, se añadió 3 gotas del reactivo. El ensayo se

considera positivo cuando existe opalescencia (+), turbidez definida (++) y precipitado

(+++) (Miranda, 2006).

2.5.4.5. Ensayo de Baljet.

Este ensayo detecta la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico,

especialmente coumarinas. Para la realización de este ensayo se tomó una alícuota del

extracto, se evaporó el solvente en un baño de agua caliente y se redisolvió el residuo

en 1 mL de alcohol etílico; posteriormente, se añadió 1 mL de reactivo. Se considera

este ensayo positivo cuando aparece una coloración rojiza (++) o un precipitado rojo (+

++) (Miranda, 2006).

20
2.5.4.6. Ensayo de Liebermann-Burchard.

Este ensayo detecta la presencia de compuestos triterpenos y/o esteroides, ya que

ambos poseen un núcleo de androstano, insaturado en el anillo B en la posición 5 y 6.

Para la realización de este ensayo se tomó una alícuota del extracto, se evaporó el

solvente en un baño de agua caliente y el residuo se redisolvió en 1 mL de cloroformo;

posteriormente, se adicionó 1 mL de anhídrido acético y se mezcló; finalmente, por las

paredes del tubo de dejaron resbalar 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar.

Se considera este ensayo positivo cuando existe un cambio rápido de coloración como

se detalla a continuación:

 Rosado - Azul (muy rápido).

 Verde intenso - visible (aunque rápido).

 Verde oscuro – negro - final de la reacción (Miranda, 2006).

2.5.4.7. Ensayo de resinas.

Para este ensayo se tomó a una alícuota del extracto etanólico y se adicionaron 10 mL

de agua destilada. El ensayo se considera positivo cuando se observa la aparición de

precipitado (Miranda, 2006).

2.5.4.8. Ensayo de la espuma.

Este ensayo detecta la existencia de saponinas tanto esteroidales como triterpénicas.

Para realizar este ensayó se tomaron 2 mL del extracto etanólico y se diluyó con 5

21
veces su volumen en agua, se mezcló y se agitó durante 10 minutos. El ensayo se

considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de

altura y persiste por un tiempo mínimo de 2 minutos (Miranda, 2006).

2.5.4.9. Ensayo del cloruro férrico.

Este ensayo permite reconocer la existencia de compuestos fenólicos y taninos

específicamente en el extracto alcohólico y principalmente taninos en el extracto

acuoso. Para la realización de este ensayo se tomó una alícuota del extracto y se

adicionó acetato de sodio para neutralizarlo y posteriormente se añadió 3 gotas de una

solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Se considera este

ensayo positivo cuando existe un cambio de coloración como se detalla a continuación:

 Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.

 Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.

 Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos (Miranda,

2006).

2.5.4.10. Ensayo de Shinoda.

Este ensayo permite detectar la existencia de flavonoides en el extracto. Para realizar

este ensayo se diluyó una alícuota del extracto alcohólico o acuoso en 1 mL de ácido

clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.

22
Se esperó 5 minutos a que finalice la reacción y finalmente se adicionó alcohol amílico,

se mezcló y se dejó reposar hasta que las fases se separen. El ensayo es positivo cuando

el alcohol amílico se colorea amarillo, naranja, carmelita o rojo (Miranda, 2006).

2.5.4.11. Ensayo de Catequinas.

Para realizar este ensayo se tomó una gota del extracto alcohólico con un capilar y se

aplicó sobre papel filtro; seguidamente, se adicionó una gota de solución de carbonato

de sodio sobre la mancha del extracto en el papel filtro. El ensayo se considera positivo

cuando al observarse el papel filtro en una cámara UV parece una mancha verde

carmelita. (Miranda, 2006).

2.5.4.12. Ensayo de Borntrager.

Este ensayo detecta la presencia de quinonas en los extractos vegetales. Para realizar

este ensayo se tomó una alícuota del extracto y se evaporó hasta sequedad en un baño

de agua, el residuo se redisolvió con 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1 mL de

hidróxido de sodio al 5% en agua. Se mezcló y se agitó, se dejó en reposo hasta la

separación de las fases. El ensayo se considera positivo cuando la fase superior, es

decir; la fase acuosa alcalina toma una coloración rosada (++) o roja (+++) (Miranda,

2006).

2.5.4.13. Ensayo de Fehling.

23
Este ensayo permite reconocer la existencia de azucares reductores en el extracto. Para

realizar este ensayo se evaporó el solvente, en caso de que este no se encuentra en agua,

y se redisolvió el residuo en 2 mL de agua; posteriormente, se adicionó 2 mL de

reactivo y se calentó en un baño de agua durante 10 minutos la mezcla. El ensayo es

considerado positivo si la solución se colorea de rojo o aparece un precipitado rojo

(Miranda, 2006).

2.5.5. Análisis fisicoquímicos

2.5.5.1 Determinación de los requisitos organolépticos

Determinación de olor: Se toma una tira de papel secante de

aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de largo y se introduce un

extremo en la muestra de ensayo. Se huele y se determina si corresponde

con la característica del producto.

Determinación del color: Se toma un tubo de ensayo bien limpio y seco

y se llena hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observa

el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en

capas. Se anota los resultados.

2.5.5.2 Determinación de la densidad relativa

Se pesa el picnómetro vacío y seco a 2 ºC y se llena con la porción de ensayo,

mantenerlo a temperatura de 25 ºC (± 1 ºC) durante 15 min., y ajustar el líquido

al nivel empleado, si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso y secar

exteriormente el picnómetro.

Se pesa cuidadosamente el picnómetro con la porción de ensayo y se repite la

operación con el agua destilada a 25 ºC, después de limpio el picnómetro.

24
Expresión de los resultados:

La densidad relativa a 25 ºC se calcula por la siguiente fórmula:

M -M
D25 = M1 - M
2

Dónde:

M1: peso del picnómetro con la muestra (g)

M2: peso del picnómetro con el agua (g)

M: peso el picnómetro vacío (g).

2.5.5.3 Determinación del índice de refracción

Se coloca sobre el prisma de medición una gota de agua destilada, utilizando

para ello una varilla de vidrio , se ajusta el equipo seleccionando la zona del

espectro visible que aparece en la línea límite del campo visual, moviendo el

compensador cromático y colocando la intersección del retículo sobre la línea

límite de los campos claro y oscuro.

Después de haber realizado el ajuste del refractómetro, se coloca una gota

de la muestra de ensayo sobre el prisma de medición, se cierra y se enfoca

la luz por medio del espejo, de modo tal que la misma incida sobre la

apertura de entrada del prisma de medición y se proceda de la misma forma

que con el agua.

Expresión de los resultados

Se hacen tres lecturas y se calcula el promedio de las mismas. Dos o más

lecturas no deben diferir en más de 0.002.

25
Si las determinaciones no se efectúan a la temperatura de referencia se

emplea la fórmula siguiente:

Nd25 =Ndt + 0.00044 (t-25)

Dónde:

Nd25 = Índice de refracción a 25 °C

Ndt = valor leído en la escala del aparato a la temperatura t.

t = valor de la temperatura a que se realiza la medición (°C)

0.00044 =factor de corrección por grado Celcior.

Los valores se aproximan hasta las milésimas.

2.5.5.4 Determinación del pH

La medición de pH se lleva a cabo por medio de un instrumento medidor

de pH, ya sea digital o analógico.

Los resultados se tomaran utilizando tres cifras decimales.

2.5.5.5 Determinación de los sólidos totales

5,0 mL del material vejetal se llevan a una cápsula previamente tarada a

105 ºC, se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté aparentemente

seco. Se pasa entonces hacia una estufa y se deja hasta peso constante

(aproximadamente 3 h). Se retira la cápsula de la estufa y se coloca en una

desecadora hasta que alcance la temperatura ambiente.

Para obtener la masa constante entre una pesada y otra se mantendrá un

tiempo de secado de 60 minutos.

26
Expresión de los resultados.

La cantidad de sólidos totales, expresado en %, R, se calcula por la siguiente

fórmula:

Pr - P
St = x 100
V

Dónde:

Pr= masa de la cápsula más el residuo (g)

P= masa de la cápsula vacía (g)

V= volumen de la porción de ensayo.

100=factor matemático para el cálculo.

Observación: En caso de aceites esenciales se denomina como residuo de

evaporación (R).

2.5.5.6 Análisis capilar

Se vierten 20 mL de la muestra o de la disolución de la muestra cuando la

monografía lo indique en un beaker de 100 mL, colóquelo en la cámara

protectora. Coloque una banda de papel de filtro verticalmente de manera que

su extremidad inferior esté sumergida dentro de la muestra, pero sin tocar el

fondo ni las paredes del recipiente.

Cierre la cámara y deje transcurrir 2 horas, al cabo de este tiempo se retirará

el papel y se deja secar. Una vez seco se procederá a su inspección visual y

caracterización.

27
Examen e interpretación de la imagen

Para el análisis e interpretación de la imagen se tienen en cuenta los aspectos

siguientes:

 Color.

 Altura.

 Descripción de las diferentes partes.

 Cambios de coloración con vapores de amoníaco.

 Examen bajo la luz ultravioleta.

Color: El color de la imagen se define en su conjunto inicialmente como:

 Vivamente coloreada.

 Poco coloreada.

 Muy poco coloreada.

En dependencia de la tonalidad que predomine en toda la imagen y

posteriormente se detallan los colores característicos de cada una de las 4

zonas si son fácilmente detectables

28
 Fig. 1: Esquema del análisis capilar.

Altura: La altura de una imagen capilar se determina midiendo con una

regla graduada en cm, del borde inferior del papel a la franja, siendo

esta inversamente proporcional al grado alcohólico de la muestra. La altura

promedio de una imagen capilar es de 8 cm aproximadamente, de ahí que

se pueden clasificar las imágenes en:

Altas: De 8,0 cm en adelante.

Medianas: Entre 5,0-8,0 cm.

Pequeñas: Menos de 5,0 cm.

En el análisis de la imagen es posible distinguir 4 zonas:

 Franja: Límite superior de ascensión del líquido.

 Sub-franja: Región generalmente poco coloreada, comprendida entre la

franja y la zona superior de la banda.

 Banda: Zona generalmente pigmentada debido a la presencia de

sustancias coloreadas.

 Sub-banda: Situada debajo de la banda hasta el límite de inmersión

29
 Fig. 2: Partes de la imagen capilar

Descripción de las diferentes partes:

Una de las zonas de mayor interés es la franja, que ésta puede ser o

no traslucida, lo que denotará la presencia de resinas o aceites

esenciales y grasas.

En la franja también debe describirse la forma que ésta adopta, dentro de

ella:

 Lineal.

 Festonada

 Dentada (regular o irregular).

 Profundamente dentada.

30
 Fig. 3: Formas de la franja.

En la sub-banda debe considerarse el color y la longitud de la misma. La

banda debe observarse a trasluz, ya que puede ser translúcida. En algunas

imágenes como en la de la tintura de ajo, colombo, condurango ó aloe, no se

aprecia la banda, mientras que en otras aparecen bandas dobles como la

grindelia.

La sub-banda que comprende toda la parte de la imagen situada debajo de la

banda, es quizá la menos importante, aunque debe considerarse su color.

Posibles cambios por alcalinidad.-La alcalinización consiste en exponer la

imagen capilar a los vapores de amoníaco, para observar los posibles

cambios de coloración. Es recomendable realizar la alcalinización de la

imagen capilar inmediatamente después de su análisis para garantizar que la

misma aún esté húmeda. El efecto de la alcalinización es temporal ya que

debe desaparecer al retirar la tira de papel de los vapores amoniacales.

Las imágenes pueden variar su coloración desde el amarillo hasta el violeta, por

la acción de estos vapores y en otros casos puede no cambiar, es por ello que

resulta de gran interés para la caracterización de la imagen.

31
Examen bajo la luz UV a 366 nm.-Resulta de gran interés para la

caracterización de algunas muestras, ya que en ellas aparecen materiales

fluorescentes que se detectan fácilmente exponiendo la tira de papel con la

imagen capilar bajo los rayos de la luz UV. Así tenemos por ejemplo los

extractos de quina que exhiben una fluorescencia azul

Contrariamente con el ensayo de alcalinidad en este caso debe dejarse secar

bien la tira de papel después de corrido el análisis, antes de observarla bajo la

luz.

Factores que influyen en el análisis capilar

 Factores extrínsecos:

a) Calidad del papel de filtro.

b) Temperatura en que se desarrolla el análisis.

c) Tiempo

 Factores intrínsecos:

a) Tiempo de fabricación de la tintura.

1.a) Calidad del papel de filtro: El soporte del análisis capilar, o sea, el papel

de filtro, juega un rol importante en el aspecto de la imagen obtenida,

ya que el mismo puede variar la altura de la imagen, el aspecto de la franja,

etc. Debe por tanto tenerse en cuenta la clase de papel y el sentido de la

fibra del papel al cortar las tiras.

32
1.b) y c) Temperatura y tiempo de corrimiento: Se ha comprobado que a bajas

temperaturas la altura se reduce, mientras que a temperaturas mayores de ºC

tiende a subir de 1 a 2 cm por encima de lo normal.

De igual forma, para corrimiento de más de 2 horas la imagen obtenida es

más oscura y la franja tiende a tomar borde irregularmente dentado. Por lo

que los mejores resultados se obtendrán para 2 horas y a temperaturas de 25

ºC (± 1).

2.a) Tiempo de fabricación de la tintura:

 La altura de la imagen disminuye con relación a la normal para

muestras de más tiempo de fabricación.

 El color de imagen disminuye en intensidad en muestras con

mayor tiempo de fabricación.

 Influye también en el aspecto de la franja y la banda.

2.6 Análisis de alcaloides

2.6.1 Extracción y purificación de alcaloides

1. Realizar dos maceraciones:

A) 3 g de material vegetal seco y molido con 50 ml de metanol, con la ayuda del

uso del sonicador durante 15 minutos o dejar reposar 48h.

B) 5 g de material vegetal seco y molido con 100 ml de metanol, con la ayuda del

uso del sonicador durante 15 minutos o dejar reposar 48h.

33
 Una vez obtenidos los macerados, se filtran.

2. El filtrado se concentra con la ayuda del rotavapor hasta obtener un extracto

sólido.

3. Al extracto sólido se añade 25 ml de H2SO4 2%. (Para preparar: 25 gotas de ácido

sulfúrico concentrado en 25 ml de agua destilada). Solubilizar todo el extracto

sólido, si es necesario utilizar sonicador.

4. Al extracto acuoso ácido se añade 15 ml de éter etílico (*3 veces) para eliminar

todos aquellos componentes apolares que no son de interés (ceras, mucílagos,

grasas, etc). Recoger la fase con alcaloides (fase acuosa ácida) y eliminar la

etérea.

5. La fase acuosa obtenida se basifica con NH3 10% de manera que obtengamos un

pH aproximado de 9-10. Se añade 15 ml de acetato de etilo (3 veces), de manera

que nos quedamos con la fase orgánica y se elimina la fase acuosa básica. A la

fase orgánica se le añade sulfato de sodio anhidro para eliminar restos acuosos. Se

filtra y así se obtiene el extracto purificado de alcaloides. Observar el extracto al

UV para detectar fluorescencia.

6. El extracto es concentrado a presión reducida en el rotavapor.

Con el extracto de alcaloides obtenido a partir de 3g planta + 50 ml de metanol:

2.6.2 Volumetría ácido-base

1. Añadir al balón con extracto de alcaloides 20 ml de ácido acético glacial y

solubilizar correctamente, si es necesario usar temperatura o sonicador.

2. Añadir 2 gotas de indicador cristal violeta hasta obtener coloración violácea.

3. Preparar la bureta con 10 ml de ácido perclórico y colocarla en las pinzas.

34
 4. Ir añadiendo ácido lentamente al extracto violáceo hasta conseguir un cambio de

violáceo a azulado y finalmente a verdoso. En el momento conseguido el color

verde se anota el volumen de ácido perclórico.

Con el extracto de alcaloides obtenido a partir de 5g planta + 100 ml de metanol:

2.6.3 Pruebas rápidas de identificación

Con una pequeña cantidad de extracto se llevan a cabo los ensayos de Dragendorff,

Wagner y Mayer, para la identificación de alcaloides.

2.6.4. Análisis en cromatografía en capa fina

Con una pequeña cantidad de extracto se llevan a cabo la cromatografía en capa fina,

utilizando como fase estacionaria sílica gel y como fase móvil cloroformo y metanol en

proporción (80:20) Como revelador se puede utilizar ácido sulfúrico al 50%

2.6.5 Análisis por Espectrometría UV e IR

El extracto purificado de alcaloides es analizado por UV e IR.

CAPÍTULO III

2. MARCO DE RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE

RESULTADOS.

Después de haber realizado los diferentes ensayos y análisis al material vegetal se

obtuvieron los siguientes resultados.

3.1. Estudio macromorfológico y organoléptico de Cinchona pubescens

35
 Tabla 4: Resultados del estudio macromorfológico y organoléptico de Cinchona

pubescens

INFORMACIÓN DE LA PLANTA

Nombre científico: Cinchona pubescens

Uso tradicional o reconocido: enfermedades graves, la malaria o paludismo y la fiebre

Nombre vulgar o vernáculo: cascarilla o quina, árbol de la fiebre

Planta endémica o aclimatada: Loja y Cuenca Originaria del Ecuador

Familia botánica: Rubiáceas Género: Cinchona

ÓRGANOS SUBTERRÁNEOS

Parámetro Resultado

Tamaño: Proporcional a la planta

Color. Marrón oscuro

Olor. Desagradable porque esta planta es amarga

Forma y consistencia: Irregulares y una consistencia de flexibilidad

El suelo para que se desarrolle son aquellos de origen

volcánico intemperizado Estos suelos son profundos,

Condición: desmoronables, fértiles y bien drenados, con una espesa

cubierta de materia orgánica y una elevada capacidad

retentiva de humedad. Necesitan un clima cálido y lluvioso

Caracteres de la Todas tienen una vena media bien desarrollada con venas

superficie: laterales más o menos prominentes.

Las raíces crecen perpendicularmente al árbol, se presume

Otras particularidades.
que las medias son proporcionales a dicha planta.

CORTEZA Y LEÑOS

Parámetro Resultado
Forma de la pieza: Tiene una forma irregular de un color marrón oscuro

36
Superficie externa: Es de color marrón oscuro, ligeramente fisurada y

desprende pequeñas placas en forma irregular

Superficie interna: Es lisa de un color marrón más oscuro con bordes

longitudinales (Vazques,2013)
HOJAS (Armijos, 2016)
Parámetro Resultado

Forma: Su forma es desde casi orbiculares o lanceoladas; algunas

son pubescentes; otras son lisas.

Textura: Parecido al papel
Superficie: Lisa con fibras superficiales
Color: Verde
Olor: No agradable porque la planta es amarga al saborear.
Dimensiones: De 8 a 27 cm de largo y 7 a 18 cm de ancho
Condición: Húmedas para que se dé la fotosíntesis
Son simples, opuestas y recusadas, de forma elíptico-
Peculiaridades:
ovalada; con grandes nervios terminadas en punta.

FLORES (Tapia, 2013)

Parámetro Resultado

Estado de desarrollo: En panículas terminales de 20 a 25 cm de longitud

Color: Rojizo claro o blanco son llamativas estando en

consistencia con verde al resto del árbol.

Olor: Almizcle
Peculiaridades: Son hermafroditas, actinomorfas; la corola es blanca-roja.
FRUTOS (Romero, 2015)

Parámetro Resultado

Pericarpio: Delgado de consistencia leñosa dura

Dehiscencia: Dehiscente
Forma: Ovoide alargada
Dimensiones: 16 - 29 x 4.5 - 9.4 mm de ancho.
Color: Café a marrón oscuro con presencia de diminutos tricomas

color blanco.
Olor: Almizcle
Marcas peculiares: Cápsula septicida seca
SEMILLAS (Romero, 2015)
Parámetro Resultado

Forma fusiforme de testa blanda con superficie

Caracteres físicos:
membranosa, cada fruto contiene 3 a 4 semillas

37
Color: Café marrón
Olor: Almizcle
Peculiaridades: Presentan un largo promedio de 5.01 (± DE 0.60) x 2.46 (±

DE 0.33) mm de ancho y grosor máximo de 1 mm.

Al comparar los resultados obtenidos con datos bibliográficos se puede decir que las

especies de Cinchona pubescens presentan misma descripción tanto macromorfológica

como organoléptica, sin embargo algunas características como tamaño del fruto, el

color de las flores y el color del pericarpio del fruto son diferentes debido a la gran

variedad de especies dispersas alrededor del Mundo.

3.2. Control de calidad drogas vegetales - análisis fisicoquímicos: humedad y

cenizas.

3.2.1. Determinación de contenido de humedad cenizas totales, solubles en agua e

insolubles en ácido,

Tabla 5: Resultados obtenidos de las cenizas totales, solubles en agua e insolubles

en HCl y contenido de humedad de Cinchona pubescens

Parámetro Cinchona pubescens %

Contenido de humedad 74
Cenizas totales 27.94
Cenizas solubles en agua 44
Cenizas insolubles en ácido clorhídrico 77

 Cálculos de cenizas totales en C1

38
 M2 - M
C= x 100
M1 - M

111.2307−110.6660
c= x 100
112.6870−110.6660

c=27.9416

 Cálculos de cenizas totales en C2

172.2571−171.9315
C= x 100
173.9758−171.9315

c=16.1644

 Cenizas solubles en Agua

M2 - Ma
Ca = x 100
M1 - M

c=0.44 *100 = 44%

 Cenizas Insolubles en ácido clorhídrico

M2 - M
B= x 100
M1 - M

c=77

 Humedad

39
 M2 - M1
Hg = x 100
M2 - M

255.6570−254.1537
Hg= x 100
55.6570−253.6286

Hg=0,7411∗100

Hg=74 %

Cápsula 1
Cápsula 253.6285
Cápsula+ muestra 255.6570
Cápsula+ cenizas 254.1537

% de humedad

%
Primer peso 51.12
Segundo peso 51.11

La corteza de la quina tiene un valor de humedad de 74% que comparado con

bibliografía está muy relacionado ya que ahí tiene un valor de 70%.

En el valor de cenizas totales el valor es un poco alto por lo que se podría decir que el

material vegetal no tuvo una limpieza correcta.

El % de humedad fue de 44%, es un valor alto, pero es comprensible ya que la muestra

es un vegetal y los vegetales presentan altos porcentajes de humedad.

40
3.3. Tamizaje fitoquímico.

Tabla 6: Tamizaje fitoquímico de la droga vegetal seca de la corteza de

Cinchona pubescens

ENSAYO METABOLIT EXTRACTO EXTRACTO EXTRACT

O QUE ETÉREO ALCAHÓLICO O ACUOSO

IDENTIFICA

Sudan Aceites y grasas (+) --------- ---------

Baljet Cumarinas (-) (-) ---------

Dragendorff Alcaloides (-) (+) (+++)

Mayer Alcaloides (-) (+++) (++)

Wagner Alcaloides (-) ---------- (+++)

Liberman- Triterpernos y/o (+) (-) --------

Burchard esteroides

Catequinas Catequinas --------- (+) --------

Resinas Resinas --------- (+) ---------

Fehling Azucares --------- (+) (+)

reductores

Tricloruro Compuestos --------- (+) (-)

férrico fenólicos y
taninos del tipo
taninos
pirocatecólicos

41
 Espuma Saponinas -------- (+) (-)

Bontranger Quinonas -------- (+) --------

Shinoda Flavonoides -------- (+) (+)

Antocianidin Antocianos -------- (+) --------

Mucílagos Mucílagos -------- -------- --------

Principios Principios -------- -------- (+)

amargos amargos

Principios Principios -------- -------- --------

astringentes astringentes

Los resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico de la corteza de Cinchona

pubescens se muestran en la tabla de los ensayos para extracto etéreo se encontró solo

compuestos grasos, debido a un resultado positivo para el ensayo de Sudán dando como

resultado en los demás ensayos negativo. En el extracto alcohólico se detectó la

presencia de catequinas, azucares reductores, lactonas, taninos del tipo pirocatecólicos,

saponinas, quinonas y alcaloides; reflejado por los resultados obtenidos en los ensayos

de Catequinas, Fehling, Baljet, Espuma, Cl3Fe, Bontrager, Dragendorff y Mayer

respectivamente; mientras que en los demás ensayos que obtuvieron resultados

negativos.

Por su parte, en el extracto acuoso se encontró la presencia de Azucares reductores,

flavonoides, alcaloides en los ensayos Fehling, Shinoda, Dragendorff, Mayer, Wagner

42
respectivamente, se determinó la ausencia de fenoles-taninos y saponinas los cuales se

realizaron gracias al Ensayo de Cl3Fe y Ensayo de espuma.

Los resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico se relacionan con el estudio

realizado por Cifuentes C (2014, pp. 67)., en el cual se caracterizan metabolitos

secundarios que posee la corteza de Cinchona pubescens; hallados en su mayoría,

alcaloides; también existe una presencia considerable de flavonoides, triterpenos y/o

esteroides, sesquiterpenos, saponinas, compuestos fenólicos y/o taninos en una

proporción representativa vista en el vegetal.

3.4 Análisis fisicoquímico

3.4.1 Determinación de requisitos organolépticos

Tabla 7: Requisitos organolépticos

Extracto Etéreo Extracto Alcohólico Extracto Acuoso

El olor en este Característico de la Característico de la

extracto es fuertemente Quina con un ligero Quina

Olor
a Éter. olor alcohol.

Color Marón Rojizo Marrón Oscuro Marrón Claro

Transparencia (+) (+) (+)

Presencia De (-) (-) (-)

Partículas

Formación De (-) (-) (-)

43
 Capas

3.4.2 Determinación de la densidad relativa

Tabla 8: Densidad relativa de Cinchona pubescens

Extracto Peso Peso Peso Densidad

picnómetro picnómetro picnómetro relativa (g/L)

vacío (g) con agua (g) con muestra

(g)
Etéreo 16,1013 26,4837 26,0002 0,9534
Alcohólico 16,1013 26,4837 26,1524 0,9680
Acuoso 16,1013 26,4837 26,4719 0,9989

3.4.3 Determinación del índice de refracción

Tabla 9: Índice de refracción de Cinchona pubescens

Muestra Extracto Etéreo Extracto Alcohólico Extracto Acuoso

(Mg) (Mg) (Mg)

Planta seca 1,3665 1.3552 1.355

3.4.4 Determinación del pH

Tabla 10: pH de Cinchona pubescens

Extracto Etéreo Extracto Alcohólico Extracto Etéreo

MUESTRA 6.32 5.24 6.05

3.4.5 Determinación de sólidos totales

Tabla 11: Sólidos totales de Cinchona pubescens

44
 MUESTRA EXTRACTO EXTRACTO EXTRACTO

ETÉREO (g) ALCOHÓLICO (g) ACUOSO(g)

PLANTA SECA 3.64 6.22 5.04

Las pruebas fueron aplicadas a los tres extractos estos son Acuoso, Alcohólico y Etéreo

de la corteza de quina roja que fue obtenido e inmediatamente se realizaron los ensayos.

Mediante los requisitos organolépticos se obtuvo el olor y el color característico de la

Quina según [ CITATION GUI52 \l 12298 ].

También se estableció la densidad relativa del extracto alcohólico superior al agua

obtenida al realizarse una comparación entre la densidad del agua. El índice de

refracción de 1.355 que es menor al agua.

El pH es del extracto acuoso fue 5.24 es ligeramente acida, mientras que el pH

alcohólico fue de 6.32 casi neutro, esto tiene similitud a estudios anteriormente

realizados (Cifuentes 2014)

La densidad relativa nos muestra que en el extracto acuoso la densidad es mayor a

comparación de los otros extractos.

En el extracto alcohólico la determinación de sólidos totales es mayor a comparación de

los otros extractos y en el extracto etéreo es menor lo que quiere decir que son

insolubles en alcohol.

3.4.6 Análisis capilar

3.5 ANALISIS DE FLAVONOIDES

3.5.1 CROMATOGRAFIA CAPA FINA DE FLAVONOIDES

S1: Apigenina

S2: Quercetina,
45
S3: Kaempferol

S4: Catequinas.
 Identification by TLC of flavonoids present in the dry extract of C. pubescens

(Noriega, et – al, 2015)

Los resultados obtenidos en cromatografía de capa fina para flavonoides fueron

obtenidos de una revisión bibliográfica porque no se consiguió realizar la misma. La

fase estacionaria utilizada para el análisis es Merk gel de sílice 60 TLC placa, con F

254 fluorescentes indicadores y la fase móvil utilizada fue acetato de etilo, ácido

fórmico, ácido acético y agua (100: 11: 11: 27 v / v). Los resultados muestran el

aislamiento de 4 flavonoides S1: Apeginina, S2: Quercetina, S3: Kaempferol y S4:

Catequinas. (Noriega, et – al, 2015)

3.5.2 ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPÍA INFRARROJO DE FLAVONOIDES

Espectro IR de flavonoides de Cinchona pubescens

46
 Espectro infrarrojo del producto extraído de los frutos verdes de Genipa americana L.

en pastilla de KBr. T = tensión, D = deformación ó flexión. Familia Rubiaceae.

(Rivas, 2014)

Debido a que no se encontró en bibliografía análisis infrarrojos de flavonoides de

Cinchona se realizó una comparación con el espectro Infrarrojo de la misma familia de

la quina (Rubiaceae).

En la figura del espectro infrarrojo flavonoides aislado se puede observar una banda a

3252,36 cm-1 característica de la tensión del grupo O-H, la tensión que se encuentra a

47
1635,34 cm-1 corresponden a vibraciones de esqueleto por tensión C-C de aromáticos.

La banda ubicada en 1086,69 cm-1 características de la tensión del enlace C-O. (Conley,

1979)

3.6 ANÁLISIS DE ALCALOIDES

3.6.1 VOLUMETRÍA ÁCIDO-BASE

0,01 mEq HClO 4 294.43 mg

cantidad de base=2 ml x x =5,8886 mg
1 ml 1 mEq

5,8886 mg
% de alcaloides= x 100=0,196 %
3000 mg

La volumetría de alcaloides se calculó determinando la cantidad de base; que consiste

en multiplicar el volumen utilizado para titular la muestra (2 ml) por la concentración

de ácido perclórico y por el peso molecular del alcaloide cinconidina en gramos. El

resultado obtenido es la cantidad de base que tiene la muestra.

Finalmente para calcular el porcentaje de alcaloides presentes en Cinchona pubescens

se divide la cantidad de base que tiene la muestra para la cantidad inicial de la planta en

mg (3000 mg) para, al resultado obtenido se multiplica por 100. En este caso el

porcentaje de alcaloides fue de 0,196 %.

3.6.2 PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE ALCALOIDES

Tabla 12: Pruebas rápidas para alcaloides

ENSAYO METABOLITO RESULTADO OBSERVACIONES

SECUNDARIO
Dragendorff Alcaloides + Positivo: color

naranja
Wagner Alcaloides + Positivo: color

marrón
Mayer Alcaloides + Positivo: color blanco

48
Los resultados obtenidos en las pruebas rápidas para la identificación de alcaloides de

Cinchona pubescens indican que en el extracto metanólico se encontró una poca

cantidad de alcaloides para los ensayos Dragendorff, Wagner y Mayer ya que estos

fueron positivos, que se presume se trata de Cinconidina.

3.6.3 ANÁLISIS EN CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ALCALOIDES

Tabla 13: Cromatografía de capa fina para Cinchona pubescens

PLACAS N° 1 Placa silicagelGF254

Muestras: extracto

Solvente recorrido: Cloroformo:

Dietilamina (90:10)

Revelado: 10% etanol H2SO4

Rfa = 0,524

Rfb = 0,742

Rfc = 0,926

PLACAS N° 2 Placa silicagelGF254

Muestras: T1 (quinina), T2 (cinconidina),

T3 (quinidina), T4 (cinconina)

Solvente recorrido: Cloroformo:

Dietilamina (90:10)

Cromatografía en capa fina para Revelado: 10% etanol H2SO4

alcaloides de la corteza de Cinchona de

acuerdo a la bibliografía de (Wagner y

49
Bladt, 1996)

En las placas N° 1 se puede observar la presencia de tres manchas, dos de ellas de

color azul y una mancha de color amarillo que corresponden a alcaloides. Se calculó

los Rf de cada mancha y haciendo una comparación con bibliografía se podría decir que

en el RFa pertenece a la cinconidina. (Wagner y Bladt, 1996). Aunque la quina

contiene más de 20 alcaloides distintos, entre los que destacan los dos pares de

isómeros quinina-quinidina y cinconina- cinconidina. (Cifuentes, 2013)

3.6.4 ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPÍA INFRARROJO DE ALCALOIDES

Espectro IR de alcaloides de Cinchona pubescens

50
Debido a que no se encontró en bibliografía análisis infrarrojos de alcaloides de

Cinchona se realizó una comparación con el espectro Infrarrojo de la misma familia de

la quina (Rubiaceae).

En la figura del espectro infrarrojo de alcaloides se puede observar una banda a

3317,93 cm-1 característica de la tensión del grupo N – H ya que la cinconina en su

estructura presenta dicho enlace, la tensión que se encuentra a 2942 cm-1 corresponden a

vibraciones de esqueleto por tensión C-H. La banda ubicada en 1024,98cm -1

características de la tensión del enlace C-C.

En el espectro IR de la Uncaria guianensis perteneciente a la familia Rubiaceae se

observan bandas en: 3392 cm-1 (tensión N-H); 1738 y 1698 cm-1 (tensión C=O); 1162

cm-1 (tensión C-O) y 1619 cm-1 (tensión C=C). (Prieto, et –al, 2011)

2. CONCLUSIONES

 Tras realizar el secado en la estufa de la droga vegetal de la planta Cinchona

pubescens para determinar el porcentaje de humedad, se obtuvo un valor de

74% el cual está elevado con respecto al valor referencial.

 Luego de realizar el método de secado en estufa de aire caliente para determinar

el porcentaje de cenizas totales, solubles en agua e insolubles en HCl, se obtuvo

los siguientes resultados, dos porcentajes de cenizas totales: 27.94% y 16.16%;

En cuanto a la determinación de cenizas solubles en agua se obtuvo un

porcentaje de 44% y el porcentaje de cenizas insolubles en HCl fue de 77%,

concluyéndose además que ninguna ceniza obtenida se encuentra dentro de los

porcentajes aceptables, debido quizás a que Cinchona pubescens por lo general

contiene tierra.

51
 Se analizaron los extractos etéreo, alcohólico y acuoso donde en éste últimos se

identificaron en mayor cantidad los metabolitos secundarios presentes en la

corteza de Cinchona pubescens, hallándose en gran cantidad alcaloides,

seguidos de flavonoides, azucares reductores, y principios amargos. Los cuales

ayudan a que este vegetal sea utilizado para tratar alteraciones del ritmo

cardíaco, por su capacidad de disminuir la excitabilidad y velocidad del impulso

nervioso y contracción del músculo cardíaco.

 Los métodos físicos químicos como determinación de requisitos

organolépticos, determinación de densidad relativa, determinación de índice de

refractómetria, determinación de pH, determinación de solitos totales y

análisis capilar fueron comparados con bibliografía de fuentes confiables,

obteniendo como resultado que la determinación de pH en el estado acuosos

fue mayor por la concentración de hidrogeno que se encuentra tanto en la

muestra como en el solvente utilizado. En la densidad relativa también se

obtuvo que el extracto acuoso es mayor por la masa total del agua y de la

muestra de Cinchona pubescens. Comparando los resultados obtenidos en las

diferentes prácticas y con fuentes confiables los valores obtenidos fueron

sumamente altos.

 La determinación de metabolitos se la realizó mediante métodos

cromatográficos y espectrométricos IR para alcaloides y flavonoides. En

cromatografía para alcaloides se logró identificar la presencia de uno de los

principales metabolitos que se encuentra en la corteza de la quina que es la

cinconidina. En la cromatografía en capa fina de flavonoides se identificó la

presencia Apeginina, Quercetina, Kaempferol y Catequinas, principales

flavonoides que componen Cinchona pubescens.

52
3. RECOMENDACIONES

 Enfriar tanto cápsulas como crisoles hasta temperatura ambiente en el desecador

para evitar la ganancia de humedad.

 En el calcinado si existen trazas de carbón, disolverlas con H2O2 concentrado y

luego evaporarlo para obtener en mayor tiempo las cenizas.

 Tener cuidado al momento de colocar ácidos como ácido sulfúrico, ya que son

tóxicos

 Al colocar los reactivos debemos hacerlo en una Sorbona

 Para la cuantificación de flavonoides, se recomienda el uso de extractos más

concentrados debido a que esta especie posee niveles bajos de este tipo de

compuestos.

4. BIBLIOGRAFÍA

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Madrid: Ed. Iberoamericana. pp. 56-59.

 Noriega, P; et – al. Cosmetic Antioxidant Potential of Extracts from Species of

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genipina a partir del fruto del caruto (Genipa americana L.). (Tesis de

pregrado). Universidad de los Andes. Mérida.

53
 Conley R. Espectroscopia Infrarroja. 1ª ed. Madrid: Editorial Alhambra, S.A.,

págs. 90-213 (1979).

 Wagner, H y Bladt S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography

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 Prieto, J, et – al. Phytochemical study of Uncaria guianensis leaves and

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 Cifuentes, C. (2014). Estudio de la composición química de tónico amargo de

la corteza de Quina Roja (Cinchona pubescens). (Tesis de pregrado). Escuela

Superior Politécnica de Chimborazo

 Ávila, P (2012) Métodos de extracción de extracto acuoso, alcohólico y etéreo.

(Tesis de grado). Universidad de Cuenca.

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 Fernández, R (2011). Dialnet. Recuperado de

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malaria de quinolina inhiben la formación espontánea de β-hematina

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http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/001457939400921X

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antioxidantes empleando como sustancia activa el extracto seco de Cinchona

pubescens Vahl, RUBIACEAE (Cascarilla). Recuperado de

http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/9377/1/UPS-QT07030.pdf.

55
ANEXO 1. Determinación del contenido de humedad de la droga cruda de Cinchona

pubescens

ANEXO 2. Determinación de Cenizas totales de la droga cruda

56
ANEXO 3. Determinación de cenizas solubles en agua e insolubles en ácido

clorhídrico.

ANEXO 4: Ensayos del tamizaje fitoquímico realizados a los diferentes extractos

de la corteza de Cinchona pubescens.

ENSAYOS DEL TAMIJAZE FITOQUÍMICO PARA EXTRACTO ETÉREO

Ensayo Metabolito Resultado

secundario
Sudan Aceites y grasas Positivo

Baljet Lactonas y Negativo

Cumarinas

57
Drangendorff Alcaloides Negativo

Mayer Alcaloides Negativo

Wagner Alcaloides Negativo

Libermann – Bucharl Triterpenos- Verde intenso visible, final de reacción

Esteroides rápido verde oscuro negro

ENSAYOS DEL TAMIJAZE FITOQUÍMICO PARA EXTRACTO

ALCOHÓLICO
Ensayo Metabolito Resultado

secundario

58
Ensayo de Catequinas Positivo

Catequinas

Ensayo de Resinas Resinas Negativo

Ensayo de Fehling Az. Reductores Positivo

Ensayo de Baljet Lactonas Positivo

Ensayo de Triterpenos- Negativo

Libermann-Bucharl Esteroides

Ensayo de Cl3Fe Fenoles y Taninos Verde intenso: taninos del tipo

pirocatecólicos

59
Ensayo de Espuma Saponinas Positivo

Ensayo de Bontrager Quinonas Positivo

Ensayo de Shinoda Flavonoides Negativo

Ensayo de Alcaloides Positivo

Dragendorff

Ensayo de Mayer Alcaloides (+++) Precipitado coposo

Antocianidinas Antocianidas Negativo

60
ENSAYOS DEL TAMIJAZE FITOQUÍMICO PARA EXTRACTO ACUOSO
Ensayo Metabolito Resultado

secundario
Ensayo de Fehling Az. Reductores Positivo

Ensayo de Cl3Fe Fenoles y Taninos Negativo

Ensayo de Espuma Saponinas Negativo

Ensayo de Shinoda Flavonoides Positivo

Ensayo de Alcaloides (+++) precipitado

Dragendorff

Ensayo de Mayer Alcaloides (++) turbidez definida

Ensayo de Wagner Alcaloides (+++) precipitado coposo

61
Principios amargos Principios amargos Positivo

ANEXO 5: Análisis fisicoquimicos de Cinchona pubescens

Determinación del índice

de refracción
Determinación de los
Determinación del pH
requisitos organolépticos

62
Determinación de solidos Análisis capilar Interpretación de la

totales muestra

Examen bajo la luz UV Resultado del UV Determinación de la

densidad relativa

63