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TODO ANALÍTICA ELENA RESUMIDO

1º Fundamentos de Química y Análisis Químico

Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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TEMA 17: ESPECTROMETRÍA DE LUMINISCENCIA MOLECULAR

FENÓMENOS LUMINISCENTES
Se mide la radiación que emite una molécula después de que haya absorbido radiación, es decir, la molécula
absorbe la radiación: parte de esa la deja pasar (absorción LLB) y al excitarse la molécula y volver al estado
fundamental emite radiación

Hay dos fenómenos fotoluminiscentes: Fluorescencia y Fosforescencia.

-Fundamento de la fotoluminiscencia

-Estado singulete: espines e- apareados.

-Estado triplete: espines e- desapareados.

-Los tránsitos electrónico solo se producen

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del estado singulete fundamental al singulete
excitado. No se puede pasar directamente al
estado triplete.

-Diagrama de Jablonski

Tengo una molécula en estado fundamental, llega una radiación de una energía adecuada provocando que los
e- pasen a un estado excitado superior, pueden pasar al estado singulete S2 o S1 y ya en estos, pueden llegar al
estado vibracional fundamental V0 o a cualquiera de los estados vibracionales excitados.

Una molécula emite fluorescencia

1. Debe estar en el estado singulete S1

2. Debe estar en un estado vibracional fundamental S1 V0
3. Tiene que pasar al estado singulete fundamental S0

Si el e- esta en estado singulete S2 estado vibracional V3  tendrá que ir al estado vibracional fundamental dentro
del singulete S2 emitiendo energía en forma de calor (relajación vibracional). A continuación, tendrá que pasar
a un estado singulete S1, cuando pasa de singulete S2 a S1 se produce la conversión interna. Una vez pasa al
estado singulete S1 se encuentra en un estado vibracional excitado por lo que se va a producir otra relajación
vibracional haciendo que el e- llegue al estado vibracional fundamental y desde ahí vuelve al estado singulete
fundamental S0 emitiendo fluorescencia.

*Fosforescencia: el e- pasa de un estado singulete a un estado triplete y luego vuelve al estado fundamental
emitiendo fosforescencia.

-Ley de Kavanagh

La radiación en forma de fluorescencia que emite una molécula es proporcional a la concentración, sin embargo,
se cumple hasta cierta concentración.
0.05
Para hallar la concentración máxima: cmáx =
𝑒𝑏

Por eso se trabaja con disoluciones diluidas.

 Desviaciones de la Ley de Kavanagh

*Autoatenuación: cuando la disolución está muy concentrada y tenemos moléculas excitadas en vez de volver al
estado fundamental emitiendo radiación chocan entre ellas y se pierde la energía.

*Autoabsorción: la radiación en forma de fluorescencia que emiten algunas moléculas sea absorbida por las
moléculas vecinas.
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VARIABLES QUE AFECTAN A LA FOTOLUMINISCENCIA

1. Factores experimentales
 I0: intensidad de radiación procedente de la fuente de radiación
 Épsilon del compuesto luminiscente a la longitud de onda de excitación seleccionada
 b = espesor de la cubeta
 c = concentración del compuesto luminiscentes
 K´ = características instrumentales (ej.Sensibilidad del detector)
2. Factores específicos de la sustancia fluorescente o fosforescente

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 Características de la molécula: estructura, sustituyentes, rigidez
 Factores ambientales: Tº, disolvente, pH, oxígeno disuelto.
3. Presencia de amortiguadores

Un agente amortiguador (Q) es aquel que es capaz de inhibir o disminuir la fluorescencia que emite una molécula
que en teoría es fluorescente. Existen dos mecanismos por los que estos agentes pueden actuar

 Amortiguación dinámica o colisional: esta sustancia choca contra la molécula fluorescente provocando
que esta deje de emitir fluorescencia. Molécula excitada
 Amortiguación estática: formación de un complejo (F-Q) entre el amortiguador (Q) y el fluoróforo (F) en
estado fundamental, el complejo no será fluorescente. La estabilidad de mi complejo viene dado por la
ecuación de Stern-Volmer: si tengo una disolución de una sustancia fluorescente, a medida que añado
amortiguador la fluorescencia que emite la disolución irá disminuyendo
𝐹0
 = 1 + 𝐾[𝑄 ]
𝐹
 F0 = señal de fluorescencia en ausencia de amortiguador
 F = señal de fluorescencia en presencia de amortiguador
 K = cte de amortiguación
 Q = concentración de amortiguador
4. Factores ambientales
 Temperatura
Al aumentar la temperatura, la eficacia cuántica de los procesos fotoluminiscentes disminuye porque hay
más choques entre las moléculas y se favorece la desactivación por conversión externa. Además, el aumento
de la temperatura disminuye la viscosidad del disolvente que también aumenta la probabilidad de conversión
externa.
 Disolvente
Al aumentar la viscosidad del disolvente se favorecen ambos procesos fotoluminiscentes.
 Efecto del pH
En compuestos con carácter ácido-base, la longitud de onda de emisión y la señal fotoluminiscente pueden
ser diferentes para la forma ionizada y la forma no ionizada. La proporción de ambas formas depende del pH
 Efecto del oxígeno disuelto
La presencia de oxígeno disuelto disminuye la emisión fluorescente debido a que por sus propiedades
paramagnéticas se favorece el cruce entre sistemas con posterior conversión externa.

EQUIPO INSTRUMENTAL DE LA FLUORESCENCIA

1. La fuente de radiación y el detector forman un ángulo de 90º para evitar la detección de la REM transmitida
(no absorbida) de la muestra junto con la emisión REM fluorescente. (PPDE)
Tengo la cubeta con la muestra fluorescente, les llega una radiación de la fuente de radiación, la muestra
absorberá parte de esa radiación (LLB) y la que no absorbe la transmite. La molécula al absorber la radiación
se ha excitado y al volver al estado fundamental emiten radiación. Si pongo el detector justo enfrente de la
fuente de radiación le llegaría al detector la radiación que transmite la muestra y la que emite, pero al
detector yo quiero que le llegue solo lo que se emite en forma de fluorescencia, por lo que pongo el detector
formando 90º con la fuente de radiación ya que la radiación que transmite la muestra va en línea recta.
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2. Fuente REM
Suministra las REMs para la excitación de la molécula. Es importante que sean lámparas de alta intensidad
ya que uno de los factores que influyen en la señal de fluorescencia es la intensidad de la REM incidente, I 0.
Las lámparas de arco de xénon y de vapor de mercurio son las más utilizadas.
3. Selectores de REM
Los equipos disponen de dos selectores. El primer selector aísla la REM adecuada para provocar la excitación
de la muestra problema (selector primario) y el segundo elector aísla la REM de fluorescencia emitida por la
muestra problema (selector secundario).
4. Cubeta portamuestras
Se fabrican de vidrio o de cuarzo según sea la zona del espectro de la REM de excitación (visible o
ultravioleta). Las cubetas tendrán todas sus caras transparentes, debido a la disposición generalmente en
ángulo de 90º entre la fuente de radiación y el detector.

5. Detector
Generalmente se utilizan fotomultiplicadores, por su alta sensibilidad.

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ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN

Tengo que hacer dos espectros porque hay que saber a qué longitud de onda excitar a la muestra y a qué longitud
de onda emite la muestra.

Los espectros serán imágenes especulares, pero se diferencian en que la longitud de onda de excitación es menor
a la de emisión.

La energía de excitación es mayor que la de emisión  la energía es inversa a la longitud de onda (Ec Plank) por
lo que la longitud de onda de excitación será menor que la de emisión, por eso en el espectro la longitud de onda
de excitación es menor que la de emisión.

COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES CON LOS ABSORCIOMÉTRICOS

(a) Límite de detección: Son a menudo tres órdenes de magnitud más pequeños que los encontrados en
espectroscopia de absorción. Los límites de detección pueden llegar a ser del orden de pig/L.

(b) Intervalo lineal: Amplio, significativamente mayor que en la espectroscopia de absorción.

(c) Selectividad: Los métodos fotoluminiscentes son más selectivos que los métodos absorciométricos. En los
métodos de fluorescencia y de fosforescencia, tanto la longitud de onda de excitación, como la de emisión,
pueden seleccionarse para minimizar interferencias, mientras que en espectrometría de absorción, sólo se
selecciona la longitud de onda de absorción.

(d)Versatilidad: los métodos basados en las medidas de fluorescencia y fosforescencia son menos versátiles que
los basados en las medidas de absorción de REM, debido al número relativamente limitado de compuestos
químicos que presentan fluorescencia apreciable. (e)Precisión y sencillez: Con la espectrometría de absorción
molecular se obtienen resultados más reproducibles debido a que las medidas de absorción se alteran poco por
factores experimentales tales como temperatura u oxígeno atmosférico. Los espectrofotómetros de absorción
ultravioletavisible son más robustos y sencillos de manejar.

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