BBA - Base molecular de la enfermedad.

NUEVAS PERSPECTIVAS PARA EL TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE ACOMPAÑAMIENTO EN LA

ACIDURIA METILMALÓNICA TIPO cblB
Palabras clave: Chaperonas farmacológicas MMA cblB tipo ATR MMAB Mutaciones desestabilizadoras
RESUMEN
La aciduria metilmalónica tipo cblB (MMA cblB) es causada por el deterioro de ATP: cob (I) alamin adenosyltransferase (ATR), la enzima responsable de la
síntesis de adenosilcobalamina (AdoCbl) a partir de cob (I) alamin.
No hay un tratamiento definitivo disponible para pacientes con esta afección y, por lo tanto, existen nuevas estrategias terapéuticas muy necesario
Recientemente, describimos una prueba de concepto sobre el uso de chaperonas farmacológicas como tratamiento. Este trabajo describe el efecto de dos
posibles chaperonas farmacológicas: el compuesto V (N - {[(4- clorofenil) carbamotioil] amino} -2-fenilacetamida) y compuesto VI (4- (4- (4-fluorofenil) -5-
metilo 1H-pirazol-3-il) benceno-1,3-diol) - en seis mutantes ATR, incluido el más común, p.Arg186Trp. El análisis funcional integral identificó mutaciones
desestabilizadoras (p.Arg186Gln, p.Arg190Cys, p.Arg190His, p.Arg191Gln y p.Glu193Lys) y oligomerización (p.Arg186Trp y p.Arg191Gln). En un modelo
celular que sobreexpresa las mutaciones desestabilizadoras / oligomerizantes, los compuestos V y VI tuvieron un efecto positivo sobre la estabilidad y la
actividad de todas las variantes de ATR. Cuando se proporciona en combinación con hidroxocobalamina, se obtiene un efecto más positivo que con los
compuestos solos, incluso en mutaciones previamente descritas como B12 que no responden. Además, se recuperó un perfil de oligomerización normal
después del tratamiento del mutante p.Arg186Trp con ambos compuestos. Estos resultados prometedores confirman el tipo cblB de MMA como un trastorno
conformacional y, por lo tanto, las caperonas farmacológicas son nuevas en combinación terapéutica o combinada con hidroxocobalamina para muchos
pacientes con cblB MMA.
Abreviaturas: AdoCbl, adenosilcobalamina; ATR, ATP: cob (I) alamin adenosyltransferase; DSF, fluorimetría diferencial de barrido; HGMD, base de
datos de mutaciones genéticas humanas; HTS, cribado de alto rendimiento; iPSCs, células madre pluripotentes inducidas; MMA, aciduria metilmalónica;
MUT, metilmalonil-CoA mutasa; OHCbl, hidroxocobalamina; DOLORES, compuestos de interferencia de ensayo pan; PC, chaperonas farmacológicas;
PR, reguladores de proteostasis; SMARTS, Smiles Arbitrary Target Speci fi cations
INTRODUCCIÓN
La aciduria metilmalónica tipo cblB (MMA cblB, MIM * 251110) es causada por el deterioro de la enzima mitocondrial ATP: cob (I) alamin
adenosyltransferase (ATR, EC 2.5.1.17). ATR es una proteína homotrimérica que cataliza la síntesis de adenosilcobalamina (AdoCbl) a partir de cobalamina
(vitamina B12) utilizando ATP para proporcionar el grupo adenosilo. El AdoCbl producido actúa como cofactor de la enzima mitocondrial metilmalonil-CoA
mutasa (MUT, EC 5.4.99.2). MUT es responsable de convertir L-metilmalonil-CoA en succinil-CoA, que luego ingresa al ciclo del ácido tricarboxílico [1].
ATR está codificado por el gen MMAB (MIM607568), que consta de nueve exones que codifican una proteína de 250 residuos que se vuelve completamente
funcional después de adoptar una forma homotrimérica [2–4]. Los pacientes afectados pueden presentar una enfermedad grave de inicio temprano
caracterizada por cetoacidosis neonatal, letargo, falta de crecimiento y encefalopatía, o enfermedad más leve de inicio tardío en la que el riesgo de
complicaciones graves, incluido el deterioro neurológico, parece reducido o retrasado con el tiempo. El tratamiento consiste en una restricción dietética basada
 en una baja ingesta de proteínas y suplementos de hidroxocobalamina (OHCbl), N-carbamilglutamato y
carnitina, y también antibióticos para reducir la producción de propionato por las bacterias intestinales.
Ninguno de estos tratamientos, sin embargo, es definitivo; de hecho, solo alrededor del 40% de los pacientes
responder a OHCbl [5]. En los últimos años, el trasplante de hígado o hígado / riñón también se ha convertido
en una opción [6], aunque dichos procedimientos no están exentos de peligro y conllevan problemas graves,
como la necesidad de inmunosupresión. Anteriormente hemos descrito y caracterizado mutantes
desestabilizadores de ATR en los que se retiene cierta actividad residual, así como una serie de posibles
chaperonas farmacológicas (PC), uno de los cuales es capaz de rescatar p.Ile96Thr [7,8]. Dado que más del
50% de las mutaciones reportadas en MMAB son mutaciones sin sentido (HGMD® Professional 2016.3), que
a menudo conducen a proteínas inestables, mal plegadas, PC y / o reguladores de proteostasis (RP) podrían
representar opciones de tratamiento para muchos pacientes. Los PR son compuestos pequeños que aumentan
la capacidad de proteostasis mediante la activación del sistema de control de calidad (QCS), que involucra
tanto a los chaperones moleculares que estimulan el correcto plegamiento como a los sistemas de degradación
de proteínas como el proteasoma dependiente de ubiquitina (Ub) y la degradación independiente de Ub
[9,10]. Las PC son pequeñas moléculas específicas de proteínas que estabilizan el estado nativo y / o
modifican la estructura de la proteína mutante, desplazando el equilibrio hacia el estado plegado [11]. Las PC
pueden ser aglutinantes del sitio activo, que a menudo son inhibitorios, o pueden unirse en otros sitios en su
objetivo enzima, como los sitios alostéricos [12,13]. Aunque se ha postulado que los inhibidores específicos rinden mejores resultados que los estabilizadores
no específicos [11], la próxima generación de PC en desarrollo para diferentes condiciones se basa en compuestos no inhibitorios [14-16]. Además, se ha
demostrado un efecto positivo y sinérgico de la combinación de PR y PC [17,18] en el tratamiento de fenotipos de enfermedades graves. Este trabajo informa
el impacto de mutaciones conocidas en los residuos Arg186, Arg190, Arg191 y Glu193, ubicados en una región importante para la función enzimática, y el
efecto de los compuestos V y VI [8] solo o en combinación con OHCbl. Tanto los modelos procariotas como los eucariotas que expresan las variantes
patogénicas p.Arg186Gln, p.Arg186Trp, p.Arg190Cys, p.Arg190His, p.Arg191Gln y p.Glu193Lys [19] se utilizaron para evaluar la posibilidad de extender el
uso de PC terapéuticos a los pacientes. con estas mutaciones.

2. Resultados
2.1. Caracterización de las mutaciones ATR seleccionadas.
Se examinaron seis mutaciones para determinar si eran desestabilizadoras y, por lo tanto, candidatos para el rescate de las PC. Estos incluyeron la mutación
patógena más común p.Arg186Trp que ocurre en más del 30% de los alelos informados, así como en otros detectados en pacientes de todo el mundo:
p.Arg186Gln, p.Arg190Cys, p.Arg190His, p.Arg191Gln y p. Glu193Lys [19,20] (Fig. S1). Todas las mutaciones se encuentran en residuos invariantes en las
proximidades que son fundamentales para la función adecuada de la proteína [2]. Se examinó el efecto de estas mutaciones en la oligomerización, la
estabilidad y la actividad de ATR. Las proteínas mutantes humanas His6-ATR de tipo salvaje (WT) y p.Arg186Gln, p.Arg186Trp, p.Arg190Cys, p.Arg190His,
p.Arg191Gln y p.Glu193Lys se expresaron en un sistema procariota. La cantidad de proteína obtenida se analizó mediante transferencia Western. Las bacterias
que expresaban el WT y las proteínas mutantes se cultivaron a 37 ° C. Se obtuvieron las fracciones de proteína correspondientes y se cargaron cantidades
iguales de proteína total en un gel SDS-PAGE. La figura 1A muestra que todas las proteínas ATR mutantes, excepto p.Arg191Gln, se producen en cantidades
similares a WT. Después de la expresión de proteínas y la purificación por afinidad, los perfiles de oligomerización de las variantes de ATR se analizaron por
cromatografía de exclusión por tamaño (Tabla 1, Fig. 1B). Las mutaciones p.Arg186Gln, p.Arg190Cys, p.Arg190His y p.Glu193Lys produjeron perfiles de
oligomerización similares a los de WT, con grandes cantidades de proteína trimérica y bajas proporciones de agregados y monómeros. La mutación
p.Arg186Trp se asoció con una reducción en la formación de trímero (31.6% en comparación con 91.2% para WT) y un aumento de monómeros de
aproximadamente 65% en comparación con el WT. El mutante p.Arg191Gln no produjo forma trimérica de la proteína y su perfil de oligomerización solo
mostró agregados (81%) y monómeros (19%) (Fig. 1B). La estabilidad térmica del WT y los ATR mutantes se analizó luego mediante fluorescencia de barrido
diferencial (DSF) usando la forma trimérica de las proteínas purificadas (Tabla 1). Todas las variantes, excepto p.Arg186Trp, mostraron un descenso de la
temperatura de fusión (Tm) de 3.0–6.7 ° C con respecto al WT, lo que indica su inestabilidad intrínseca. La estabilidad de p.Arg186Gln se vio menos afectada,
con un cambio descendente de 3 ° C desde WT Tm, mientras que la Tm del mutante p.Glu193Lys se redujo en 6,7 ° C y, por lo tanto, fue el mutante más
desestabilizado. El mutante p.Arg186Trp mostró un aumento de 2.5 ° C en Tm en comparación con el WT y la mutación p.Arg191Gln no pudo analizarse ya
que no se pudo obtener proteína trimérica. El efecto de estas mutaciones en la actividad ATR se analizó utilizando un modelo celular de la enfermedad. Los
fibroblastos derivados del paciente con mutaciones nulas c.290G> A y c.349-1G> C [7], que no producen proteína ATR inmunorreactiva ni actividad
enzimática ATR detectable, se transdujeron con un lentivirus que expresa los ATR mutantes WTor y enzimático actividad se midió con un ensayo acoplado
[21]. Inicialmente, todos los mutantes mostraron actividad enzimática disminuida en comparación con WT ATR. p.Arg186Trp mostró la mayor actividad
residual (90%), mientras que p.Glu193Lys mostró la cantidad más baja con 20% de actividad residual en comparación con WT. Las otras tres proteínas
mutantes representaron entre el 50 y el 70% de la actividad residual. Es digno de mención que la actividad residual se incrementa por la sobreexpresión de las
mutaciones desestabilizadoras.
2.2. Afinidad de unión y acoplamiento molecular
La afinidad del compuesto VI para WT ATR se midió mediante la estabilización térmica dependiente de la concentración de la enzima usando DSF. La ATR
trimérica purificada se tituló con el compuesto VI (0–100 μM) (Fig. 2A), y el efecto del ligando en la Tm de la ATR se analizó como se describe [22]. Se
calculó el valor AKd de 2.2 ± 0.2 μM, revelando un gran afinidad para un golpe primario. El valor Kd para la unión del compuesto V se calculó anteriormente
como 7,4 ± 0,4 μM [8]. Las estructuras químicas de los compuestos V y VI se representan en la Fig. S2. El acoplamiento molecular para el compuesto V ha
identificado previamente el sitio de unión más probable para este compuesto, ubicado en el extremo C-terminal de cada subunidad en el ATR trimérico
(residuos 228-240) y el bucle 165-175, adyacente al sitio de unión de cobalamina [8]. Para el compuesto VI, el grupo de puntaje superior se ubica en el lado
opuesto de la proteína, donde el compuesto VI se une en la interfaz del trímero, manteniendo estabilidad de la interfaz y oligomerización adecuada (Fig. 2B –
D). Este bolsillo es accesible para solventes y en la posición mejor clasificada, el compuesto establece enlaces potenciales de hidrógeno a las cadenas laterales
de Asp79, Asp80 y Gln81. Las interacciones estéricas y polares complementarias y complementarias del compuesto VI con ATR trimérico explican en gran
medida la alta afinidad de este compuesto de éxito.
Caracterización del efecto de las mutaciones en la estabilidad y conformación de mutantes ATR recombinantes.

Figura 2. La unión de alta densidad del compuesto VI a ATR.A: Efecto de aumentar la concentración de compuestos VI en la estabilidad térmica de ATR
medida por DSF. El valor de 2.2 ± 0.2 μM se estimó de acuerdo con el algoritmo de Cooper y MacAuley-Hecht [22]. B: Descripción general de ATR (PDB ID
2IDX) que muestra la ubicación del sitio de unión propuesto para el compuesto VI, en la base de la disposición helicoidal trimérica, tal como se obtiene del
acoplamiento molecular. Se muestra la pose de puntaje más alto de SwissDock. Cada subunidad se presenta en un color diferente. (C y D) Vista detallada del
sitio de unión propuesto para el compuesto VI (bola y palo). Los residuos Asp79, Asp80 y Gln81, con los cuales el compuesto VI interactúa en la estructura
acoplada, se muestran representados con palos.

Fig. 3. Efecto de los compuestos V, VI y OHCbl sobre la

estabilidad térmica de las proteínas mutantes y WT ATR. Los
datos (dados como cambio de pliegue en ΔTm (° C) de cada
proteína sin ningún tratamiento como referencia) representan la
media ± DE de al menos tres experimentos independientes. ND:
no determinado. ⁎⁎⁎P <0,001.

2.3. Efecto de dos PC posibles sobre la estabilidad térmica del mutante ATR, la actividad de la proteína y el perfil de oligomerización
La estabilización térmica de las proteínas ATR mutantes por los compuestos V y VI (Fig. S2), en comparación con el WT, se realizó mediante DSF (Fig. S3).
No se pudieron realizar análisis para el mutante p.Arg191Gln ya que no se pudo obtener proteína recombinante purificada. En cuanto a WT, las proteínas ATR
mutantes mostraron un aumento de la estabilidad térmica dependiente de la concentración en presencia de una u otra PC, aunque en menor medida para
p.Arg186Gln y p.Arg186Trp en presencia del compuesto V (Fig. S3). Todos los mutantes aparecieron realmente sensibles a 80 μM de cualquiera de las PC y
esta concentración se seleccionó para análisis celulares. Sin embargo, dada su citotoxicidad en los fibroblastos derivados del paciente (Fig. S4), el compuesto
VI también se probó a 5 μM. Los valores específicos de ΔTm (Tm = TmTm, 0, donde Tm, 0 es la Tm sin compuesto) con compuestos V o VI a 80 μM,
compuesto VI a 5 μM u OHCbl a 1 μg / ml se resumen en la Fig. 3. Además, el También se analizaron los efectos de todas estas combinaciones posibles. El
OHCbl por sí solo no aumentó la estabilidad térmica de ninguno de los mutantes estudiados, pero ambas PC analizadas tuvieron un efecto positivo a las
concentraciones utilizadas, aunque en menor medida para los mutantes p.Arg186Gln y p.Arg186Trp. El compuesto VI fue responsable de una mayor
estabilización en estos dos mutantes en comparación con la misma concentración del compuesto V, y aunque también se registró un efecto estabilizador a una
concentración más baja (5 μM), esto fue menos prominente. Por lo tanto, el compuesto VI parece inducir un efecto dependiente de la concentración más
marcado en estos dos mutantes. Como p.Arg186Trp afecta la oligomerización de ATR, se probó el efecto del compuesto V y VI en la trimerización. El
mutante p.Arg186Trp se expresó en presencia de 80 μM de cada compuesto y se examinó el perfil de oligomerización. Antes del tratamiento, las diferentes
formas oligoméricas eluyen en un pico amplio, sin bandas de elución distintas para las formas triméricas y monoméricas de la proteína, probablemente debido
al intercambio rápido entre las diferentes formas inestables. El porcentaje de monómeros y trímeros se estimó de acuerdo con su tiempo de elución esperado
(Fig. 4A). Sin embargo, después del tratamiento con ambos compuestos, dos fracciones se volvieron claramente separables (Fig. 4B); con la proporción de
trimers aumentando para acercarse a los niveles de WT (Fig. 4C). Para evaluar aquí el potencial terapéutico de los compuestos V y VI en la actividad de ATR,
las células que sobreexpresaron los mutantes de ATR se incubaron durante 72 ha 37 ° C en presencia de 80 μM de compuesto V o 5 μM de compuesto VI en
combinación con 1 μg / ml de OHCbl, o OHCbl solo. También se estudió el efecto de la combinación de los tres compuestos (combinación triple). Después de
72 h de tratamiento, se recogieron las células para inmunotransferencia o incubación con propionato de [14C] para cuantificar la absorción de material
radiomarcado, en un ensayo indirecto acoplado de actividad ATR (Fig. 5). Todas las proteínas mutantes mostraron un aumento significativo en la actividad
enzimática después de combinar cualquiera de los compuestos con OHCbl, con el mayor aumento observado para p.Glu193Lys mutante en todas las
combinaciones de tratamiento. Inicialmente, este mutante mostró la menor actividad residual. Mutante p.Arg191Gln mostró el menor aumento en la actividad
residual en todas las combinaciones de tratamiento. El tratamiento con todas las combinaciones (especialmente la combinación triple) produjo un aumento en
la actividad de ATR en todos los mutantes analizados, incluso alcanzando niveles saludables de fibroblastos derivados para p.Arg186Gln y p.Arg186Trp
(datos no mostrados).
2.4. Análisis farmacoquímicos de las PC candidatas.
Las estructuras de los compuestos V y VI se analizaron químicamente usando el SmartsFilter (Tabla 2) y las herramientas bioinformáticas de Molinspiration
(Tablas S1 y S2). El primero es un filtro químico que alerta sobre características químicas indeseables, mientras que el segundo permite determinar las
propiedades fisicoquímicas. El programa SmartsFilter (disponible en línea) utiliza consultas Smiles Arbitrary Target Speci fi cation (SMARTS), el mismo
sistema utilizado por las compañías farmacéuticas para identificar subestructuras de interés. Aunque ninguno de los compuestos pasó todos los filtros, no
pertenecen a la categoría de compuestos de interferencia de análisis de panificación (PAINS) [23], cuyos miembros a menudo muestran un espectro amplio y
no específico de actividad biológica [24]. El compuesto VI falló el filtro ALARM NMR, lo que sugiere que es reactivo a tiol [25], mientras que el compuesto
V falló todos los filtros excepto OPREA y DOLORES, lo que indica que tiene una estructura químicamente más desafiante. Las propiedades moleculares y las
puntuaciones de bioactividad para cada compuesto se determinaron utilizando el programa Molinspiration (disponible en línea). Las tablas S1 y S2 muestran
que ambos compuestos tienen varios átomos en el rango de 20–70, <10 enlaces rotativos y un área de superficie polar de <140 Å2, lo que indica el fármaco
propiedades similares esenciales para una buena biodisponibilidad oral [26,27]. Cuanto más alto es el puntaje de bioactividad, más activo es un compuesto.
Los puntajes superiores a 0.0 describen compuestos que están activos, los puntajes entre −0.5 y 0.0 indican actividad moderada, y los que están por debajo de
−0.5 revelan inactividad. El compuesto VI tenía un perfil activo para la actividad del ligando del receptor nuclear y la actividad inhibidora de la quinasa,
mientras que el compuesto V fue negativo para todas las propiedades probadas.
Fig. 4. Perfil de oligomerización del mutante p.Arg186Trp después del tratamiento con el compuesto VI. Usando un sistema procariota, se expresó
p.Arg186Trp durante 5 h en presencia de 80 μM de VI o compuesto V. Después de esto, se purificó la proteína y se realizó una cromatografía de exclusión
por tamaño para mostrar el perfil de oligomerización antes (A) y después de la incubación (B) con el compuesto VI o (C) V. El porcentaje de agregados,
trímeros y monómeros también se calculó antes (donde el porcentaje de monómeros y trímeros se estimó por desconvolución máxima de acuerdo con el
tiempo de elución esperado para cada forma) y después de la incubación con ambos compuestos (D). NO: no observado.

Fig. 5. Efecto de las dos PC posibles (V y VI) y OHCbl en un modelo de enfermedad celular. Las células se incubaron con 1 μg / mLOHCbl, 80
μMcompoundV, 5μMcompoundVIo el volumen equivalente de DMSO. Los datos (como cambio de pliegue con respecto al tratamiento con DMSO como 1)
representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ⁎P <0.05, ⁎⁎P <0.01, ⁎⁎⁎ P <0.001
3. Discusión
No existe un tratamiento definitivo para el tipo MMA cblB. Aunque se pueden administrar dosis farmacológicas de OHCbl, solo alrededor del 40% de los
pacientes experimentan una respuesta bioquímica positiva [5]. En la era de la medicina de precisión, el desafío es encontrar medicamentos huérfanos para
estos pacientes [31], pero para hacerlo debe establecerse la base molecular del trastorno. Hasta ahora, se han descrito varios trastornos conformacionales, y una
de las terapias más prometedoras se basa en el uso de medicamentos pequeños como PC y PR [11], un área de creciente interés para las compañías
farmacéuticas. El presente trabajo evaluó las mutaciones ATR patógenas seleccionadas como posibles candidatos para el rescate mediante terapias plegables.
El análisis funcional permitió la identificación de mutantes que muestran defectos principalmente en estabilidad (p.Arg186Gln, p.Arg190Cys, p.Arg190His,
p.Arg191Gln y p.Glu193Lys) u oligomerización (p.Arg186Trp y p.Arg191Gln), en función de la cantidad de proteína producida, el perfil de oligomerización
actividad de la ATR producida en un sistema bacteriano y eucariota. La forma trimérica de todas las proteínas ATR mutantes mostró una estabilidad térmica
reducida en comparación con WT, a excepción de p.Arg186Trp, que mostró una mayor estabilidad térmica. En la estructura nativa, Arg186 está alineado con
His183 y Arg190 en el mismo lado del hélice α, y estas interacciones electrostáticas desfavorables no se compensan adecuadamente con residuos ácidos, lo
que explica por qué la sustitución por Trp puede ser favorable a nivel de subunidad y, por lo tanto, explica el aumento en estabilidad conformacional. Por otro
lado, Arg186 se encuentra en las interfaces de las subunidades en el trímero, y se espera que la sustitución por el Trp más voluminoso introduzca choques
estéricos y perturbe la distribución electrostática de la superficie compensatoria en la estructura trimérica. Aunque Arg186 había estado implicado en la unión
de OHCbl, la baja afinidad de p.Arg186Trp para AdoCbl indica que el residuo Arg186 tiene un papel en la transferencia del grupo 5′-desoxiadenosilo de ATP
al cofactor para la generación de AdoCbl [20]. Por lo tanto, p.Arg186Trp perjudica la formación de AdoCbl a pesar de la presencia de OHCbl, lo que podría
justificar la falta de respuesta de esta mutación al tratamiento farmacológico con OHCbl. El efecto adverso de esta mutación parece revertirse tras la unión de
los compuestos V y VI. No se pudo obtener proteína trimérica recombinante para p.Arg191Gln, lo que sugiere que la mutación tiene un impacto muy negativo
sobre la estabilidad de la proteína y la oligomerización. De hecho, se cree que el residuo Arg191 está involucrado en la interfaz del trímero cargado [2], lo que
explica la falta de ATR trimérico. Finalmente, todos los mutantes ATR mostraron una actividad reducida, que oscila entre el 14% (p.Arg186Trp) y el 80%
(p.Glu193Lys) en comparación con WT. El residuo Glu193 es importante para la coordinación fisiológica de Mg2 +, y su alteración podría dificultar la unión
de ATP [2]. Dado que este es un paso crucial para la actividad ATR, podría explicar la reducción drástica en la actividad mostrada por este mutante. Cabe
señalar que la actividad residual en el modelo celular fue mayor que la detectada en los fibroblastos primarios derivados del paciente. Se han informado
resultados similares para las mutaciones desestabilizadoras PMM2-CDG [32].
Blake: este conjunto es de James Blake de Array Biopharma (publicado como script Sybyl contribuido lint_sln.spl, anteriormente incluido con Sybyl) [28]. b
Glaxo: el conjunto Glaxo se compone de un subconjunto de "derivaciones inadecuadas", un subconjunto de "productos naturales inadecuados" y un
subconjunto reactivo. Los subconjuntos opcionales de Glaxo son electrofílicos y nucleófilos [29]. c DOLOROS "Compuestos de interferencia de Pan-Assay":
Desarrollado por Jonathan Baell y Georgina Holloway del Instituto de Investigación Médica Walter and Eliza Hall, Bundoora, Victoria, Australia [23]. d
Oprea: Desarrollado por Tudor Oprea, para la adecuación general de la biblioteca de objetivos múltiples [30]. e NMR de alarma: el conjunto de NMR de
ALARMA se deriva del método de Abbott publicado y los materiales complementarios de ese documento [25].

Todos los mutantes mostraron una mayor estabilidad en presencia de los compuestos V o VI, o ambos, a excepción de p.Arg186Trp, en el que el compuesto V
ejerció poco efecto estabilizador. Ninguno de los mutantes mostró un aumento en la estabilidad térmica en presencia de 1 μg / ml de OHCbl solo, pero su
combinación con el compuesto V, y especialmente el compuesto VI, dio como resultado un aumento significativo en la estabilidad de todos los mutantes. La
titulación con ambos compuestos (0–200 μM) mostró una estabilización térmica para todos los mutantes y WT-ATR, aunque en menor medida para
p.Arg186Gln y p.Arg186TrpinthepresenceofcompoundV. celulares o targets- objetivos. Todos los mutantes ATR mostraron un aumento en la actividad tras el
tratamiento con OHCbl, lo que indica que aunque este compuesto solo no aumentó su estabilidad térmica utilizando la proteína recombinante, sí ejerció
un efecto positivo en estas proteínas ex vivo. Este hallazgo subraya la importancia de someter los compuestos de rescate candidatos a ensayos multisistema. Es
importante tener en cuenta que OHCbl debe modificarse enzimáticamente en el entorno celular, lo que explica la diferencia entre la desnaturalización térmica
y los resultados de la actividad enzimática. La respuesta positiva observada en el sistema celular utilizado no se correlaciona con la falta de respuesta
observada en los fibroblastos derivados del paciente con algunas de las mutaciones estudiadas [33], lo que sugiere que La expresión o el posible rescate de
proteínas mediante el tratamiento farmacológico de las proteínas mutantes permiten el efecto positivo observado de la cobalamina. También es importante
tener en cuenta que el tratamiento con cada compuesto en combinación con OHCbl, y la combinación de ambos compuestos con OHCbl, aumentó la actividad
enzimática de ATR en comparación con la administración de OHCbl solo. Para los mutantes p.Arg186Trp y p.Arg190Cys, el mayor aumento (más del doble)
se obtuvo después del tratamiento con la combinación del compuesto VI + OHCbl, mientras que para los mutantes p.Arg186Gln, p.Arg190His, p.Arg191Gln y
p.Glu193Lys , la combinación de ambos compuestos + OHCbl fue la más efectiva. El mutante p.Glu193Lys mostró una recuperación impresionante de la
actividad enzimática en comparación con todos los otros mutantes, probablemente debido al hecho de que mostró la actividad más baja en ausencia de
compuestos. Los resultados revelan el efecto particularmente positivo del compuesto VI; se observó una dosis de dosis de 5 μM similar a la obtenida para el
compuesto V a 16 veces esa dosis y confirma la mayor afinidad mostrada por este compuesto hacia la proteína ATR, en comparación con el compuesto V. A
pesar de su toxicidad en fibroblastos derivados del paciente, los análisis de toxicidad en células HepaRG ™ (Fig. . S5) no demuestran efectos tóxicos a
concentraciones más altas para este compuesto, lo que enfatiza la necesidad de encontrar buenos modelos de enfermedad para las pruebas de compuestos. Por
lo tanto, después de la optimización de hit-to-lead y la eliminación de o-target, el compuesto VI podría ser la mejor opción como tratamiento de chaperona
para pacientes con mutaciones con pérdida de función. La combinación de los compuestos V y VI no tuvo un efecto significativamente mejorado en la mayoría
de las proteínas mutantes que el vehículo DMSO solo; Sin embargo, esto cambió cuando se combinaron con OHCbl. Dado que los compuestos V y VI parecen
unirse en diferentes sitios de unión, diferentes al sitio activo (según lo predicho por el acoplamiento molecular), no se esperaba interferencia. Esto implica un
papel de OHCbl como adyuvante para el efecto positivo de estos compuestos sobre la estabilidad de ATR o un efecto positivo por la unión simultánea de
ambos compuestos en la interacción de cobalamina. La administración conjunta de OHCbl con PC podría ser una buena estrategia cuando se trata de mutantes
menos sensibles al compuesto V o VI solo, o cuando se enfrenta a mutaciones no sensibles. La combinación de compuestos, como PC y PR, para el
tratamiento de trastornos metabólicos hereditarios, e incluso la combinación de diferentes estrategias, se ha descrito para los trastornos de almacenamiento
lisosómico [34-36], fibrosis quística [37], tipo Niemann-Pick C [38] y fenilcetonuria [39,40], entre otros. El uso de PR podría inducir un entorno protector para
la proteína mutante y potenciar la acción correctiva de las PC, como se describe para otros trastornos [11].
El descubrimiento exitoso de medicamentos requiere que los compuestos candidatos sean efectivos no solo in vitro o in vivo, sino también in vivo, y esto
depende de una buena biodisponibilidad (generalmente oral) y farmacocinética [41]. En los últimos años, el número de "descubrimientos académicos de
medicamentos" ha aumentado, pero la mayoría de los compuestos registrados como posibles PC han fallado por no estar químicamente aptos, cayendo, por
ejemplo, en la clase de categoría DOLORES (Compuestos de Interferencia de Pan-Assay) [42,43]. Para garantizar que los compuestos identificados por el
cribado de alto rendimiento sean buenos candidatos a fármacos, se debe cumplir la "regla de cinco" de Lipinski [44,45]. También se han desarrollado varias
herramientas bioinformáticas para analizar la estructura química de los compuestos identificados. El compuesto VI pasó cinco de los seis filtros, pero se
identificó como ALRM NMR positivo, como consecuencia de su estructura reactiva con tiol. El compuesto V fue marcado por cuatro de los seis fi ltros (Tabla
2). Sin embargo, ninguno cayó en la categoría de DOLORES. Ambos compuestos tienen valores de miLogP de <5, menos de 10 enlaces rotativos y un área de
superficie polar topológica (TPSA) de <140 Å2 (Tabla S1), factores que indican una buena biodisponibilidad oral [26]. Dado que el cerebro se ve afectado en
MMA cblB, es esencial que estas PC puedan cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). Los compuestos con un TPSA de <60–70 Å2 tienden a ser activos del
SNC [27]. Además, si el número de átomos de nitrógeno y oxígeno en una molécula es inferior a cinco, tiene la posibilidad de cruzar el BBB [45]. Ambos
compuestos comparten la última característica, lo que indica que podrían ser activos en el SNC. También es necesario conocer los puntajes de bioactividad
para establecer la "similitud de los fármacos" de los compuestos candidatos. Cuanto mayor sea el puntaje, mayor será la probabilidad de que un compuesto sea
similar a una droga. El compuesto V arrojó puntajes muy bajos, todos por debajo de -0,50, lo que sugiere que es diferente a cualquier fármaco conocido (Tabla
S2).
El avance en la medicina personalizada va de la mano con la evaluación de los fármacos potenciales en modelos de enfermedad apropiados que pueden
recapitular la fisiopatología de la enfermedad. Aunque los fibroblastos derivados del paciente son fáciles de obtener y de obtener, no son los mejores modelos
de enfermedad y pueden influir en los resultados de las pruebas como se observa para la diferencia en la toxicidad del compuesto VI. Sin embargo, los
modelos animales para probar terapias específicas de mutación son algo difíciles de obtener. Por lo tanto, los tipos de células relevantes para la enfermedad,
como los hepatocitos, derivados de células madre pluripotentes inducidas pueden ser un excelente modelo de enfermedad para estudios preclínicos [46]. En
resumen, este trabajo confirma el potencial del uso de terapias estabilizadoras de conformación en el tratamiento de pacientes con MMA cblB. Las dos PC
específicas sin mutaciones descritas, que aumentaron el efecto de OHCbl, deberían evaluarse como compuestos químicos de choque a plomo en otros modelos
celulares ex vivo con miras a su prueba in vivo.
4. Materiales y métodos.
4.1. Producción de WT-ATR y proteínas ATR mutantes.
La expresión del plásmido pDEST17 que codifica ATR humano (NM_001184.3, NP_001175.2) con una etiqueta His6 N-terminal, pero que carece de la
secuencia mitocondrial (Source BioScience, Nottingham, Reino Unido), se utilizó para transformar las células de un solo tiro E. coli BL21StarTMDE3.
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las mutaciones ATR se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis QuikChange
(Stratagene, Cedar Drive, TX, EE. UU.) Y cebadores especialmente diseñados. Todos los plásmidos mutados fueron verificados por secuenciación de ADN.
Para la expresión de proteínas, las bacterias se cultivaron previamente en caldo Luria-Bertani (LB) [47] suplementado con glucosa 40 mM y que contenía
ampicilina 100 μg / ml, durante la noche a 37 ° C. Las bacterias previamente cultivadas se transfirieron luego a un nuevo cultivo de LB que contenía
ampicilina 100 μg / ml, se incubaron a 37 ° C hasta una densidad óptica de 0.6, y se indujeron con IPTG 0.5 mM durante 5 h. Las células se recolectaron por
centrifugación y se analizaron por sonicación después de la suspensión en HEPES 50 mM (pH 7,5), imidazol 10 mM, glicerol al 5%, NaCl 0,5 M, DTT 0,5
mM y 1 × Mini completo, cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Roche Applied Biosciences, Indianapolis, IN, EE. UU.). Los restos celulares
insolubles se eliminaron por centrifugación durante 10 minutos a 5403 ga 4 ° C. Las concentraciones de proteínas se determinaron siguiendo el método de
Bradford
y utilizando el reactivo de ensayo de proteínas BioeRad (BioeRad Laboratories, Munich, Alemania). Este extracto celular crudo soluble se usó para la
purificación de proteínas. La purificación de proteínas se realizó utilizando el sistema ÄKTA Prime (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) a 4 ° C. El
extracto crudo se cargó en una columna de afinidad HisTrap ™ High Performance (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) equilibrada con HEPES 50
mM (pH 7,5), imidazol 20 mM, NaCl 0,5 M, glicerol al 5%, y se eluyó con un gradiente de imidazol. de 20 mM a 1 M. Las fracciones de proteína eluidas se
agruparon y cargaron en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200 HiLoad 16/60 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido).
La fracción de elución correspondiente al ATR trimérico se recogió y se congeló para otros experimentos. La concentración de proteína pura se estimó
midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scienti fi c, Waltham, MA, EE. UU.) Utilizando el coeficiente de extinción
molar teórico estimado a partir de la composición de aminoácidos de His6-ATR (19,160 M − 1 cm− 1) Los porcentajes correspondientes al área de cada pico
(agregados, trímeros y monómeros) se calcularon en función de su tiempo de elución en el cromatograma de exclusión por tamaño utilizando la columna
Superdex 200 HiLoad 16/60 y el software Prime View Evaluation.
4.2. Fluorimetría diferencial de barrido
El DSF [49] evaluó la estabilidad del ATR mutante y de tipo salvaje purificado, controlando la desnaturalización térmica en presencia de la sonda fluorescente
extrínseca SYPRO Orange (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Se dispensaron volúmenes finales de 50 μL que contenían 0,05 mg / ml de ATR puro
(subunidad ATR 1,87 μM) en HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,5 M, glicerol al 5%, DTT 0,5 mM y naranja SYPRO 5 × en pocillos LightCycler480 de 96
pocillos. Placas de PCR (Roche Applied Sciences, Indianápolis, EE. UU.). Luego se cargaron en un Light Cycler 480 (Roche Applied Sciences, Indianápolis,
EE. UU.) Para la desnaturalización térmica. Las curvas de despliegue se registraron de 20 ° C a 85 ° C a una velocidad de exploración de 2 ° C / min. El
aumento en la intensidad de fluorescencia de SYPRO Orange asociada con el despliegue de proteínas (λexcitación = 465 nm; λemisión = 580 nm) se controló
como una medida de desnaturalización térmica. Las temperaturas de fusión del punto medio (Tm) se determinaron como la derivada máxima de las curvas de
fluorescencia utilizando un software interno
La estabilización dependiente de la concentración de ATR 0.05 mg / mL (subunidad ATR 1.87μM) por los compuestos V y VI se investigó usando el mismo
protocolo, pero con preincubación de ATR con 0–200μM de cada compuesto antes de la desnaturalización. El Kd para el compuesto VI se calculó a partir de
la gráfica de los valores de Tm versus la concentración del compuesto (1–100 μM) mediante análisis de regresión utilizando Sigmaplot (Systat Software Inc.,
San José, CA) y la siguiente ecuación [22]:

donde ΔH0 es la entalpía del complejo proteína-ligando en desarrollo, Tm es la temperatura de fusión del punto medio a la concentración de ligando L, Tm, 0
fusión temperatura sin ligando, n es el número de sitios de unión, R es la constante de gas y Kd es la constante de disociación. Se supone que el ligando se une
a la proteína plegada.
4.3. Western blotting
Las muestras se sometieron a electroforesis en geles prefabricados NuPAGE® Bis-Tris al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los marcadores de
proteínas de color ProSieve® (Lonza, Basilea, Suiza) se utilizaron como marcadores de peso molecular. Las proteínas se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia seca iBlot® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante al menos 1 h con
0.1% de PBS-Tween y 5% de leche baja en grasa. La inmunodetección se realizó usando anticuerpo policlonal primario de conejo (11137-1-AP; ProteinTech
Group, Inc., Chicago, IL, ESTADOS UNIDOS). Se utilizó como anticuerpo secundario inmunoglobulina G de cabra-anti conejo conjugada (IgG) -peroxidasa
de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). El sistema de quimioluminiscencia mejorada (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino
Unido) se utilizó para la detección.
4.4. Modelo celular utilizado para evaluar la actividad de ATR en ausencia y presencia de PC potenciales
El ADNc de longitud completa del ATR humano se clonó en el plásmido lentiviral de mamífero pReceiver-Lv158 (EX-T2465-Lv158) que contiene la etiqueta
FLAG antes del sitio de clonación múltiple (GeneCopoeia, Rockville, MD). Las mutaciones ATR (p.Arg186Gln, p.Arg186Trp, p.Arg190Cys, p.Arg190His,
p.Arg191Gln y p.Glu193Lys) se introdujeron por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis QuikChange (Stratagene, USA, Cedar Drive,
TX y Cedar Drive, TX y Cedar Drive, TX, Cedar Drive, EE. UU. imprimaciones especialmente diseñadas. Las construcciones resultantes se transdujeron a
celdas de fibroblastos derivadas por el paciente que mostraban expresión de ATR nula (c. 290 G> A / c. 349–1 G> C). La producción de existencias
lentivirales y la infección por fibroblastos se realizaron como se describe en otra parte [50]. Los fibroblastos infectados con éxito se seleccionaron mediante
tratamiento con geneticina. Se sembraron en placa 5 x 10 ^ {4} células transducidas y se cultivaron a 37ºC durante 24 h en medio MEM suplementado con
glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10%, antibióticos y 250 µg / ml de genética. El medio anterior se descartó y las células se incubaron con 80 μM de
compuesto V, y / o 5 μM de compuesto VI, y / o 1 μg / ml de OHCbl, y 0.2% de DMSO durante 72 h en MEM sin genética. Las células se incubaron a 37 ° C
durante 18 h en presencia de solución salina de Puck que contenía glucosa (0,5 mM), suero de ternera fetal (15%), propionato (1 mM) y 1 μCi / ml de
propionato [14C] , cosechado por tripsinización seguido de centrifugación durante 5 minutos a 15.871 gy utilizado para determinar la actividad de ATR. La
actividad de ATR se midió en un ensayo acoplado mediante la incorporación de propionato [14C] en proteínas precipitables con ácido como se describió
previamente [21]. Después de la centrifugación, el material precipitado con TCA se volvió a suspender en NaOH 0,5 N. La incorporación de propionato [14C]
en precipitado de ácido tricloroacético (TCA) se estimó resuspendiendo las muestras en líquido de centelleo y se realizó la cuantificación de la radiactividad en
un líquido Wallac RackBeta 1219 contador de centelleo (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). Los datos se referían a la cantidad correspondiente de
proteína, que se midió por el método de Lowry.
4.5. Ensayo de viabilidad celular- Los ensayos de viabilidad celular se realizaron utilizando el kit de proliferación celular AQueous One Solution de CellTiter
96® (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.) En placas de 96 pocillos. Los fibroblastos derivados del paciente que muestran una expresión nula de ATR
(c.290 G> A / c.349–1 G> C) se sembraron a una densidad de 15,000 células por pocillo en MEM suplementado con 1% de glutamina, antibióticos y 5% de
FCS para reducir cualquier posible interferencia de fondo. Las células HepaRG ™ (Thermo Fisher Scienti fi co, Grand Island, NY, EE. UU.), Obtuvieron una
densidad alta en William's Emmedium (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) Suplementado con glutamax I (Thermo Fisher Scienti fi c, Grand Island, NY, EE.
UU.), 10% FCS, antibióticos, insulina bovina (5 μg / ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Y sal de sodio de hidrocortisona 21hemisuccinato (50 μM,
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). El medio se reemplazó luego por medio nuevo que contenía una de las dos PC potenciales seleccionadas a diferentes
concentraciones, y las células se incubaron a 37 ° C durante 72 h. Luego, el medio de cultivo se reemplazó nuevamente por medio nuevo que contiene 3- (4,5-
dimetil-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna (MTS ) y las células se incubaron a 37 ° C durante 30 minutos para el
desarrollo del color. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de biocinética EL 340 de microplacas (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE.
UU.). La absorbancia de fondo mostrada en cero celdas / pocillo se restó de los datos finales. Análisis farmacoquímico virtual de los compuestos afectados.
El análisis farmacoquímico de los compuestos se realizó utilizando el programa SmartsFilter (http://pasilla.health.unm.edu/tomcat/ biocomp / smarts fi lter).
Los análisis se realizaron en los modos "normal" y "analizar una molécula". Los conjuntos SMARTS (http: // www.
Daylight.com/dayhtml/doc/theory/theory.smarts.html) utilizados fueron: Glaxo, Blake, ALARM NMR, PAINS y Oprea [23,25,28–30].
4.6. Atraque molecular- Los posibles sitios de unión para el compuesto VI se identificaron utilizando un procedimiento de acoplamiento molecular
automatizado en el programa SwissDock basado en la web [51,52], empleando el parámetro "Preciso" en los parámetros predeterminados, sin ninguna región
de interés definida (acoplamiento ciego).
4.7. Estadística Los datos se informan como la media ± DE. Los análisis estadísticos (ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc Bonferroni) se
realizaron utilizando el software IBM SPSS Statistics v.21 para Windows.
Documento de transparencia El documento de Transparencia asociado con este artículo se puede encontrar en versión en línea.
AgradecimientosLos autores agradecen a Nooshin Bayat, Jon Gil y Pedro Martínez por sus útiles contribuciones.
Fondos- Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Salud Carlos III y (subvención PI13 / 01239) más subvenciones de la Fundación Isabel Gemio y Obra
Social deLaCaixa toBP; theResearchCouncilofNorway [nr.185181 to AM], The KG Jebsen Foundation y NovoSeeds (Novo Nordisk) . AG recibió el apoyo de
una subvención Ramón y Cajal del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Este trabajo fue apoyado también por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional
(PI13 / 01239) |||||||||||||| Declaración de conflicto de intereses - ninguno declarado.|||||||||| Apéndice A. Datos suplementarios