TP 8 BACTERIOFAGOS

Los bacteriófagos son los virus que van a infectar exclusivamente a los organismos procariotas
estudiar los bacteriofagos tiene diversas importancias cómo es la influencia en el ciclo de la
materia orgánica entre los océanos son herramientas potenciales para el tratamiento de bacterias
patógenas resistentes a antibióticos y el impacto de la evolución del genoma bacteriano son
vectores importantes en la transferencia horizontal del ADN entre cepas bacterianas
Hay distintos tipos de fagos por un lado los fagos virulentos o liticos qué son aquellos que van a
infectar y lisar a la célula hospedadora
Y los fagos temperados o lisogenicos que son que son aquellos que van a insertar su genoma en el
cromosoma de la célula hospedadora pero no van a producir su lisis
Nosotros vamos a tener la bacteria del virus va insertar su ADN pueden pasar dos cosas los fagos
lisogenicos van a insertar este ADN dentro del cromosoma de la bacteria y van a cumplir su ciclo
lisogénico o sea que cuando se reproduce la célula bacteriana se va a reproducir con el gen o con
el ADN del virus dentro del fago dentro de su cromosoma esto va a ocurrir hasta que en algún
momento por algún factor que estimulen la lisis va a liberarse el ADN del fago y se va a reproducir
dentro de la célula y va a entrar en el ciclo lítico iba a cumplir el ciclo de un virus lítico
Si el fago sigue el ciclo lítico se reproduce va utilizar toda la maquinaria de la bacteria para
reproducirse para producir las proteínas y la cubierta se va a formar nuevamente muchos fagos
hijos y lisar la célula generando nuevos fagos
TITULACIÓN DEL FAGO para la titulación del fago lo que nosotros lo hacemos para saber cuál es
nuestra carga viral
Vamos a partir de una suspensión de fagos que están lisados y vamos a realizar diluciones
sucesivas nosotros queremos saber qué concentración tenemos en esta suspensión de
bacteriofagos entonces vamos a hacer diluciones sucesivas 1 en 10 y vamos a tener 10 menos 1
hasta 10 a la menos 6 vamos a tener por un lado las placas con el medio de cultivo Agar y vamos a
tener un tubo con Agar blando este es un Agar que tiene una concentración de Agar menor qué va
a estar fundido a 45 grados una vez que nosotros lo fundimos lo dejamos en un baño 45° para que
se mantenga fundido sin solidificar y que no tengan una temperatura alta que vaya a matar a
nuestra bacteria en este caso vamos a trabajar con un cultivo de Basillio que esté en fase
exponencial entonces a nuestro tubo con el Agar blando fundido le vamos a agregar 100
microlitros del microorganismo y 100 microlitros de las diluciones vamos a tener distintos tubos
para cada una de las diluciones vamos a homogenizar en un vortex y vamos a volcar sobre la placa
vamos a tener la placa con el medio cultivo y arriba este Agar blando qué va a tener nuestro
microorganismo y la distintas diluciones del fago le vamos a dejar secar que se funda el Agar
nutritivo y lo vamos a llevar estufa a 32 grados durante 16 horas
Vamos a tener distintas placas dónde vamos a ver lo que se llama placa del lisis o placas caba en
dónde vamos a ver pequeños puntitos transparentes esos puntos corresponden son los que vamos
a contar como placas de lisis en este caso cálculo del título viral unidades formadora de placa de
lisis por mililitro
Título viral el número de placa de lisis ósea el cuántos puntos nosotros contamos sobre el
volumen de inoculo por la dilución
Se promedia los valores
DETERMINA EL EFECTO DE UN BACTERIÓFAGO LÍTICO Y LISOGÉNICO SOBRE EL CRECIMIENTO DE
E COLI se hace una curva de crecimiento también midiendo DO y unidades formadoras de colonias
por mililitro
Vamos a tener un cultivo de E coli con la misma concentración qué vamos a sembrar en dos tubos
que tienen medio de cultivo y por otro lado vamos a tener un tubo que tiene una E coli que ya
tiene inserto un fago lisogénico qué es un cromosoma va a tener insertado el gen de un fago
lisogénico y vamos a inocular con esto nuestro tubo 2 entonces vamos a tener un tubo control
dónde vamos a tener el medio de cultivo donde vamos a tener E coli y en el tubo 2 donde vamos a
tener qué vamos a inocular con nuestra E coli con el fago lisogenico y el tubo 3 qué vamos
inocular lo con la E coli
Vamos a hacer lo mismo que hicimos anteriormente vamos a tomar DO y muestra para hacer
diluciones sucesivas y para calcular unidades formadoras de colonias por mililitro al tiempo 0 a los
30 minutos a los 60 lo que vamos a hacer es lo siguiente medimos DO, tomamos muestra para
hacer las diluciones sucesivas y vamos agregar al tubo control lo vamos a dejar así nomás al tubo 3
vamos a agregar nuestro fago lítico que ya lo titulamos en el ensayo anterior y al TUBO 2 le vamos
agregar mitomicina C y cloruro de calcio se agrega para estimular que ingrese a fase lítica,
volvemos a incubar a los 90 minutos 120 minutos tomamos DO y muestra para hacer la unidad de
formadora de colonias por mililitro hacemos las diluciones sucesivas y plaqueamos
Por un lado tenemos el CONTROL en verde vemos que aumenta en el tiempo 2 está terminando la
fase exponencial y pasando la fase estacionaria y el negro vemos las unidades formadoras de
colonias por mililitro
En el TUBO DOS teníamos que al tiempo 2 q era a los 60 minutos le agregamos la mitomicina c es
todo lo que hace estimular que el Fago ingresé a su a su ciclo lítico entonces vemos que al entrar
en su fase lítica libera el cromosoma reproducirse y va a lisar a las células por eso que se ve una
disminución tanto en DO como la unidades formadoras de colonias por mililitro
TUBO TRES tengo E coli y lo que hicimos es agregar el fago litico a los 60 minutos se observa una
disminución tanto en DO como en la unidad formadora de colonias debido a que el fago infectó
esas células se reprodujo y género lisis de la célula