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COLORACION I TP

El AUXOCROMO permite la disociación electrolítica es lo que va a permitir entonces que el colorante se fije a los
tejidos a las células es decir que va a permitir entonces que esa sustancia pueda colorear.
La estructura del colorante que tiene que ser capaz de teñir o colorear y de unirse a las estructuras celulares es decir
de permanecer unido a las estructuras celulares aún cuando se los trata por ejemplo con agentes químicos ácidos o
básicos.
La estructura que van a constituir el colorante son el CROMOFORO que cuando se une al anillo bencenico le va a
permitir comunicar la propiedad de color formando el CROMOGENO, esta estructura que presenta con un todavía no
puede unirse o fijarse a la célula sino recién a través de los auxocromos qué son los que se van a disociar y que a
través de su cargas positivas o negativas van a permitir la unión a las estructuras celulares
CLASIFICACIÓN de las coloraciones de acuerdo al número de colorante se pueden clasificar
 en simples se actúa un solo colorante y en esta coloración se va a poder obtener información sobre la forma
la disposición y el tamaño relativo de las células
 Coloración doble o compuesta si yo utilizo 2 colorantes para obtener un efecto neto de contraste por
ejemplo la coloración de Gram
Con respecto a la finalidad las coloraciones pueden clasificarse como
 especializadas o selectiva cuando ponen de manifiesto alguna estructura característica de la célula por
ejemplo espora flagelo cápsula
 Coloración diferencial es aquella que permite una clasificación taxonómica, por ejemplo la coloración de
Gram que divide a las bacterias Gram positivo y Gram negativo
Respecto a la técnica aplicada la coloración pueden ser
 Directa si yo directamente colocó en contacto la estructura celular con el colorante que es el caso de una
coloración simple
 Coloración indirecta si yo utilizo un intermediario para la fijación del colorante para unirla a la estructura
celular como es el caso de los mordientes qué son sustancias químicas que van van a permitir esa fijación esa
unión
 Progresiva se utilizamos soluciones diluidas del colorante osea realizamos el extendido lo fijamos y
colocamos soluciones que van incrementando la concentración del colorante.
 Regresiva cuándo utilizamos una solución concentrada del colorante y a la vez utilizamos un diferenciador
puede ser agua, solución de alcohol acetona o una solución de alcohol ácido.
La coloración de Gram es indirecta porque utilizó el mordiente que es la solución de Lugol y a regresiva porque
utilizó un diferenciador que la mezcla de alcohol acetona
La coloración simple podemos obtener como ya dije la información con respecto a la forma tamaño disposición
Vamos a tener diferentes formas como los cocos que son redonditos bacilos que son alargados, vibrios que tienen la
forma de coma, espirilos todas estas células pueden estar solas o pueden tener otro tipo de disposición como por
ejemplo en cadena con el caso de los estreptococos, los bacilos también pueden formar cadenas.
 En el caso de la coloración de Gram que es una coloración doble hacia desarrollada en el año 1800 es muy
utilizada para comenzar la identificación de una bacteria esta coloración permite la clasificación taxonómica de
las Gram positiva y Gram negativa. Además da información sobre la forma y el tamaño y la disposición de las
bacterias
 En caso de las bacterias gram positivas se van a ver bacteria de color violeta debido a que su en su interior se
retiene el complejo del cristal violeta yodo
 En el caso de las Gran negativas las bacterias se van a ver de color roja o rosadas debido a que van a colorear
se con el colorante de contraste que la safranina o la fucsina
La coloración de Gram CLASIFICACION: es doble utilizan cristal violeta o el violeta de genciana colorante primario y la
safranina o FUCSINA que el colorante secundaria, es diferencial ya que permite la clasificación taxonómica de las
Gram, en Gram positivo y Gram negativo, regresiva utiliza un diferenciador que es una mezcla de alcohol acetona e
indirecta utiliza un mordiente que la mezcla de yodo yoduro de potasio
Coloración Gram lo primero que se realiza la fijación del extendido ese extendido se cubre con el primer colorante
qué es el cristal violeta el cristal violeta ingresa a todas las células tanto gram positiva como una negativa si se deja
actual este primer colorante y luego lavo con agua y paro la coloración en esta etapa y lo veo al microscopio voy a
ver tanto las gram positivas como las negativas de color violeta.
Si seguimos la coloración el siguiente paso es la adición del mordiente que lo que va a permitir en la fijación de este
primer colorante se deja actuar el lugol y luego se realiza la diferenciación qué es la etapa crítica de la coloración de
gram debido a que un exceso o si se hace una diferenciación con menos tiempo para que para que pueda actuar el
diferenciador o con menos cantidad de diferenciador se obtiene resultados que no van a ser los correctos. Se agrega
diferencia o se lo dejó actuar se lava con abundante agua si la diferenciación ha sido realizada de manera correcta
entonces la bacteria Gram positiva todavía retiene el complejo cristal violeta yodo y se ven al microscopio de color
violeta por el contrario las bacterias Gram negativas no retienen el complejo cristal violeta yodo entonces se
decoloran si las veo al microscopio
Una diferenciación incorrecta nos llevan a resultados que no son los adecuados si en este paso yo hago un exceso de
diferenciación permito que ese diferenciador actúe mucho tiempo más del tiempo que debe actuar la bacteria Gram
positivas también van a decolorarse entonces cuando agregamos el colorante de contraste se ve de color rosado y
ese no sería el resultado adecuado, por el contrario si la diferenciación no es suficiente si por ejemplo no dejamos
actuar el tiempo adecuado el diferenciador entonces las bacterias Gram negativas no van a llegar a decolorarse es
decir que van a retener el complejo cristal violeta y yodo la vamos a ver de color violeta
Luego de la diferenciación sobre el colorante de contraste qué es la safranina las gran negativas se tiñen y vamos a
ver las bacterias Gram positivas de color violeta y la gran negativa de color rosado
¿Qué es lo que hace que las bacterias Gram positivas pueden retener el complejo cristal violeta y la Gram negativas
no diseñan con el colorante de contraste?
El fundamento de esta técnica de esta y en la ultra estructura de su pared celular. La pared celular de las Gram
positivas está en 90% constituido por el peptidoglicano entonces tienen una gruesa pared de peptidoglicano a
diferencia de laS GRAM negativa cuya pared celular está formada por por una membrana externa que tiene los
lipopolisacaridos esa membrana lipídica y por una delgada capa de peptidoglicano qué es un 20% de la pared celular
entonces cuándo se realiza la coloración de gram y se realiza la diferenciación esa mezcla de alcohol acetona en la
gruesa pared de la gran positiva se deshidrate cerrando los poros de esa manera el complejo cristal violeta queda
retenido dentro de la célula y la podemos observar entonces de color violeta en el caso de la gram negativa la mezcla
de alcohol y acetona para disolver la capa lipídica exponiendo la delgada capa del peptidoglicano que al ser tan
delgada no va a poder impedir que el diferenciador ingrese a la célula y luego extraiga el complejo cristal violeta
yodo entonces las bacterias Gram negativas se decoloran en el paso de diferenciación y luego van a colorearse con el
colorante de contraste qué es la safranina o la fucsina
La observación microscópica de las coloraciones
En el caso nuestro se utiliza el MICROSCOPIO ÓPTICO que permite la observación de células intactas tejidos hongos y
bacterias el límite de resolución es de 0,2 micrómetros es decir que esa es la mínima distancia que tienen que tener
dos puntos para que el microscopio pueda reconocerlo como diferente en este caso para hacer la observación de
células, se utilizan los objetivos 100X de inmersión se realiza la observación con objetivos tiempos usando aceite de
inmersión con célula eucariota se pueden utilizar los objetivos de 40x 10x todo depende del tamaño de la estructura
que nosotros queremos observar
A través del MICROSCOPIO ELECTRÓNICO se puede observar la ultraestructura de la celula la organelas los detalles
morfológicos de la superficie celular
A través qué el MICROSCOPIO FLUORESCENCIA se pueden realizar estudios de localización e interacción Se pueden
observar las concentraciones de iones y procesos intra y extracelulares como endocitosis y exocitosis se requiere de
una marca de fluorescencia para poder realizar entonces la observación
EN EL LABORATORIO LO PRIMERO QUE HAY QUE HACER ES LIMPIAR Y DESENGRASAR LOS PORTAOBJETOS se hace
con algodón embebido en alcohol siempre vamos a realizar las coloraciones utilizando cultivos frescos que estén
activos
El EXAMEN EN FRESCO se basa en colocar la muestra entre un porta y un cubreobjeto y se observa en microscopio
Si el microorganismo creció en medio sólido primero en el porta objeto debe de colocar un medio acuoso como por
ejemplo solución fisiológica se colocan gotitas y en condiciones de asepsia tomó una ansada del cultivo activo lo voy
a resuspender en la solución fisiológica o en el agua destilada voy a diisgregar bien la muestra y luego colocó el
cubreobjeto no se fija la muestra y voy a realizar la observación primero de utilizar el objetivo 40x para enfocar y
luego a 100x con el aceite de inmersión
Si la persona esté familiarizado con este tipo de técnica para poder reconocer la forma el tamaño y la disposición de
la célula
En este tipo de examen se ve que la célula tiene muy poco contraste entonces se dificulta la observación se puede
observar las células microbianas en este caso sería bacilo, estreptococo qué sería la cadenita de cocos, diplococo
dos Cocos Unidos
Este examen en fresco además de darnos información sobre el tamaño la forma y la disposición de las células nos da
información sobre sobre si las células tienen movilidad cómo es la muestra no se fija el porta objeto las células
quedan libres en el medio acuoso si las células tienen movilidad cuando nosotros enfoquemos un campo las células
pueden salir de ese campo desplazarse puede ser que dar volteretas sobre sí misma es decir que tiene un
movimiento muy diferente al movimiento browniano de partículas en un ambiente acuoso esto quiere decir que
aquellas células que no tienen movilidad se va a ver que se mueve pero se ve que se mueven muy despacio y eso es
porque las células no están fijadas y está en un ambiente acuoso entonces aquellas células que tengan movilidad se
va a ver que se desplazan en el campo
PASOS PARA LA COLORACIÓN
Para la preparación del extendido el objetivo de obtener una película delgada y homogénea que pueda ser
observada al microscopio en condiciones de asepsia voy a tomar ansada de la muestra si el cultivo se ha desarrollado
en un medio líquido directamente voy a tomar 2 o 3 onzas de ese cultivo lo voy a extender voy a hacer el extendido y
voy a dejar secar espontáneamente
Luego realizó la fijación del preparado cuyos objetivos son es matar las bacterias, también es permeabilizar la
membrana para que el colorante ingresa a la célula y fijar al vidrio la estructura celular por precipitación de proteínas
si fijamos evitamos que las celulas sean barriga cuando se realizan los lavados
Hay diferentes técnicas de fijación el calor, inmersión, alcohol éter
Una vez que está fijado se puede realizar la coloración propiamente dicha
En el caso de LA COLORACIÓN SIMPLE Se supone que partimos de un cultivo activo de bacillus este cultivo está
desarrollado en medio líquido entonces en condiciones de asepsia se colocan dos o tres ansadas de este cultivo se
realiza el extendido se fija y directamente vamos a cubrir con el colorante primario que puede ser por ejemplo azul
de metileno dejamos actuar un tiempo adecuado y luego la vamos con agua qué es el diferenciador después de ser
teñido lo vamos a dejar secar y se realizan la observación al microscopio primero realizamos la observación con el
objetivo de 40 X y sin aceite de inmersión y luego 100X con aceite de inmersión
SE PUEDE UTILIZAR simple el azul de metileno violeta de genciana fucsina básica rojo neutro etcétera directa y
regresiva
En el caso de un hongo unicelular como la levadura se realiza exactamente lo mismo en este caso el microorganismo
se desarrolló en un medio sólido hay que colocar gotas de solución fisiológica en el porta objeto y en condiciones de
asepsia colocar una ansada del cultivo se realiza el extendido lo fijamos por calor y luego agregamos el colorante el
azul de metileno diferenciamos y observamos al microscopio las células tienen forma como de limón son células más
grandes son células eucariotas se la pueda observar sin problema en el con el objetivo de 40x
LA COLORACIÓN GRAM EN ADEMÁS DE DIFERENTE HABLA FORMA TAMAÑO DISPOSICIÓN NOS PERMITE LA
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ESTA COLORACIÓN ES DOBLE DIFERENCIAL INDIRECTA Y REGRESIVA
Partimos de un cultivo activo de lactobacillus sp (sp sin especificar la especie) desarrollado en un medio líquido en
condiciones de asepsia se toman dos o tres ansadas se realiza nuestro extendido se fija un calor colocamos el
colorante primario qué es el cristal violeta dejamos actuar el tiempo adecuado lavamos eliminamos el exceso
colocamos el mordiente que es la solución de lugol dejamos actuar el tiempo adecuado y luego realizamos la
diferenciación se realiza gota a gota y luego detenemos la diferenciación con abundante agua luego colocar el
colorante de contraste que es la safranina se la deja actuar un tiempo adecuado se lava y se deja secar y se observa
en el microscopio de nuevo primero enfocamos al 40 x y después con el objetivo de 100x el de inmersión con aceite
de inmersión el imagen se observan lactobacilos gram positivo de color violeta oscuro
Si se realiza la técnica de gram con el un cultivo de E. coli qué es gram negativa se realizan los mismos pasos se
observan bacilos de color rosado ya que son gran negativo

TP COLORACIONES ESPECIALES II
 Se tiñen estructuras especiales de la célula
Salvo esta coloración la COLORACIÓN DE BACILOS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES que lo que va hacer es
colorear las micobacterium estas son bacterias que tienen una pared celular distinta a las que observamos
en las Gram; la membrana celular es igual al resto de las bacterias la diferencia está en la pared celular este
peptidoglicano va a estar unido a arabinogalactano qué son polímeros de arabinosa y galactosa a lípidos,
ácidos micolicos y glucolipidos
Los ácidos micólicos van a jugar un papel muy importante en lo que es la resistencia a los ácidos
Esta estructura de la pared celular es lo que le va a dar la característica de ácido alcohol resistente
Por eso es que importante la integridad de la célula y es importante que en el proceso de coloración no se
destruya está célula
Los colorantes de Gram qué utilizamos en esta coloración no pueden atravesar esta pared celular por lo
tanto no la van a tener a las células
REACTIVOS
Aquí se utiliza una mezcla de fucsina con fenol y en calor para que puede ingresar a esta célula, se utilizan
fucsina fenicada diferenciadora ácido clorhídrico concentrado con alcohol etílico y un colorante secundario
qué es el azul de metileno
Esta coloración es una coloración doble diferencial, indirecta y regresiva
Es doble porque utilizamos dos colorantes es diferencial permite realizar una diferencia taxonómica;
íbamos a poder decir si estamos en presencia de una micobacterium o no, indirecta por qué utilizamos el
fenol que actúa como mordiente y regresiva porque utilizamos con colorantes concentrados y el
diferenciador
Esta coloración se basa en mayor coeficiente de solubilidad del fenol en lípidos que en agua o en alcohol
eso le va a permitir actuar al fenol como mordiente y le va a permitir que atraviese la pared celular
Y la resistencia al complejo lipopolisacarido peptidoglicano a la penetración del decolorante cuando
nosotros agregamos el diferenciador éste no va a poder entrar a la célula y decolorar.
La técnica de kinjou una modificación de la técnica de ziehl-neelsen donde se aumenta la concentración de
fucsina El 4% y de fenol al 8%
ESPOROS
Son celulas diferenciadas muy resistentes a agentes físicos y químicos, sólo algunos géneros son capaces
de formar esporas y son un mecanismo de resistencia de las células a distintas condiciones físicas y
químicas
Está formado por un núcleo y distintas cubiertas qué van a cubrir principalmente, el núcleo va a tener el
material genético muy protegido para poder después volver a formar una célula vegetativa
Hacer una estructura muy resistente también va a ser muy resistente al ingreso de los colorantes muchas
veces nosotros las endosporas la vamos a poder ver en el microscopio sin necesidad de coloración no
siempre se pueden ver por eso es necesario una coloración
En el microscopio Se observa que dentro de la misma célula vegetativa tenemos espacios en blancos o
también se pueden ver como masa oscuras eso depende de la célula. Las esporas pueden estar en distintas
partes de la célula puede estar en la parte terminal, Sub terminal o central
REACTIVOS para la técnica de coloración de esporos colorante primario solución acuosa de verde
malaquita y colorante secundarios fucsina básica
EL FUNDAMENTO de esta técnica es que el verde de malaquita combinado con el calor va a poder ingresar
dentro de la esporo el verde malaquita tiñe todo luego lo lavamos con agua que actúa como diferenciador
va a correr el colorante de la célula no del esporo y luego cuando se colorea con fucsina básica va a quedar
coloreada la célula.
En base a esto está coloración va hacer doble selectiva diferencial y regresiva. Doble porque usamos dos
colorante selectiva porque nos permite ver una estructura celular en particular y diferencial hay una
diferenciación taxonómica al permitirnos ver la ubicación nos permite eso realizar una clasificación
taxonómica directa porque no utilizó mordiente directamente utilizó el colorante más el calor y regresiva
porque utilizó el agua como diferenciador
LOS FLAGELOS
Permiten a las bacterias desplazarse y son apéndices largos y delgados de una forma helicoidal tienen
proteínas flagelina si tiene uno solo van a ser monotricos si tiene dos flagelos uno en cada polo anfitricos si
peritrico citan en todo el cuerpo y lofotricos hay varios flagelos en un extremo esto nos permite realizar
una diferenciación taxonómica
La coloración de flagelos es una impregnación no es una coloración, se utilizan los colorantes para que se
produzca como una precipitación lo que hace que el flagelo se engrose y se lo pueda visualizar
REACTIVOS el fijador de rouse formado por ácido acético formol y agua destilada; mordiente tanino y agua
destilada impregnador nitrato de plata, agua destilada y amoniaco
COLORACIÓN DE CÁPSULA que no es una coloración qué se utilizaba la tinta china que lo que va hacer la
cápsula es desplazar las partículas de carbono coloidal de la tinta china y vamos a observar esta tienda
china como una halo blanco alrededor de la célula
Cápsula y murciélagos son polímeros que se forman alrededor de la celula y la diferencia entre ambos está
en la disposición de estos alrededor de la célula
La cápsula va hacer una sola capa con integridad estructural firmemente adherido a la pared celular
El mucilago es el material extracelular que difunde al medio formando acumulaciones dispersas y amorfas
separadas de célula
A ambos se le llama como matriz e extracelular
COLORACIÓN BACILOS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE
Se parte del micobacterrum tuberculosis qué provoca la tuberculosis y nos permite saber si un paciente
tiene tuberculosis.
Entonces muchas veces esta coloración se realiza directamente con una muestra del paciente, esputo
Trabajamos con una muestra pura cómo es una muestra muy patógena lo que se va a ser primero en
activar las células luego al cultivo puro que lo tenemos en un tubo en bisel se le agrega fenol y se lo lleva el
autoclave nos queda una mezcla medio solidificada se toma una muestra la colocamos en el portaobjeto la
dejamos secar y la fijamos con calor esta parte la realiza el docente.
 Luego que tenemos la muestra fijada en una bandeja se colocan dos varillas de vidrio y sobre esta se va
a colocar el portaobjeto luego colocamos la fucsina fenicada mucha cantidad para que cubra todo el
fijado y que quede una buena capa de colorante bastante colorante incluso más de lo que utilizamos
para las coloraciones de Gram ya que nosotros vamos a calentar y es importante que el colorante no
hierva no se seque
Al hisopo lo vamos embeber en alcohol y luego vamos a encender con esto hisopo vamos a calentar
nuestro portaobjeto entre 3 a 5 minutos lo que vamos hacer nosotros es alejar y acercar el isópodo del
portaobjeto y se va a observar que se emiten vapores blancos
Apagamos el hisopo dejamos que se enfríe el portaobjetos y lavamos con agua. Luego agregamos el
diferenciador la mezcla de mezclar ácido clorhídrico con alcohol volvemos a lavar y agregamos el azul de
metileno que nuestro segundo colorante esperamos 30 segundos lavamos dejamos secar y vamos a
observar al microscopio se puede agregar cubreobjetos y se usa el aceite de inmersión primero vamos a
40x para poder enfocar y después vemos a 100x para ver más clara la imagen
Observación en microscopio se va a ver pequeño bastones de color rosado es una células muy chica se ven
los botones rojos sobre un fondo azul; cuando se utiliza una muestra pura no se observa ningún fondo azul
porque el fondo azul corresponde a otras células epiteliales que van a estar en nuestra muestra de esputo.
COLORACIÓN DE ESPORAS
N0 todos los microorganismos producen esporas los bacilos son uno de los géneros que producen esporos
en este caso vamos a trabajar con un bacillus subtilis. Lo vamos a tener en un medio líquido vamos a tomar
con un ansa una muestra y la vamos a colocar sobre el porta objeto; siempre los porta objetos deben estar
limpio y seco lo debemos limpiarlos con algodón con alcohol; cómo vamos a trabajar con un
microorganismo vamos a trabajar siempre cerca del mechero la toma la muestra siempre se realiza cerca
del mechero se esteriliza de ansa acercamos el tubo la flameamos el ansa sacamos la tapa flameamos
tomamos muestra lo colocamos en el portaobjetos; después no es necesario trabajar en esterilidad
siempre la toma de la muestra se realiza cerca del mechero
Lo dejamos secar luego lo fijamos con calor fijar con calor no es poner el portaobjetos bajo el fuego y
dejarlo sino que es acercarlo y alejarlo de la llama del mechero no es necesario que el porta objeto esté
caliente solamente es pasar dos o tres veces por la llama
Lo colocamos el portaobjeto en una bandeja con dos varillas de vidrio y ahí colocamos el portaobjeto y le
colocamos el colorante verde de malaquita colocar mucha cantidad el colorante para evitar que se seque,
luego embebemos un hisopo con alcohol prendemos y lo colocamos debajo del Porta objeto durante 10
minutos hasta la emisión de vapores blancos se acerca y se aleja el hisopo es muy importante que el
colorante no hierva ni se seque.
Luego lavamos con agua, agregamos la fucsina básica lavamos dejamos secar colocamos el cubreobjeto y el
aceite de inmersión y observamos microscopio
Microscopio: Se observa en la célula vegetativa de color rosado y el esporo de color verde
En el caso del bacilo linchar forma se observa una espora terminal y en el caso del bacillus subtilis la
espora de subterminal
IMPREGNACIÓN ARGENTICA OBSERVACIÓN DE FLAGELOS MÉTODO DE FONTANA TRIBONDEAU
Aquí vamos a utilizar un cultivo sólido de treponema sp, vamos a colocar una gota de agua sobre él Porta
objeto luego diseminamos la muestra en el porta objeto lo dejamos secar lo fijamos con calor y luego en
una bandeja que tiene las dos varillas de vidrio colocamos el portaobjeto y de ahí colocamos primero el
tanino después se embebemos el hisopo en alcohol y lo encendemos y lo colocamos debajo el porta objeto
durante 30 segundos hasta la emisión de vapores evitar que hierva y que se seque el colorante
Debo lavar con agua destilada es importante que sea agua destilada porque sino los cloruros que están
presentes en el agua pueden precipitar con el nitrato de plata que vamos a agregar después necesitamos
que no precipiten porque si no vamos a poder ver los flagelos
Luego se agrega nitrato de plata amoniacado luego embebemos el hisopo en alcohol lo encendemos
volvemos a calentar hasta la emisión de vapores durante un minuto
Lavamos con agua destilada dejamos secar colocamos el cubreobjeto aceite de inmersión y lo observamos
el microscopio
MICROSCOPIO: Espiroquetas que tienen forma de resorte o espiral, que tienen flagelos en los dos polos
uno en cada extremo
Precipitar la plata engrosa al flagelo y así lo podemos ver
VISUALIZACIÓN DE CÁPSULAS MÉTODO DE BURRI
Vamos a colocar en el portaobjetos una gota de tinta china después vamos a tomar una muestra de
lactobacilos casei que se encuentra en un medio bisel siempre la toma de la muestra la hacemos cerca al
mechero diseminamos la muestra en la tinta china sin esperar a que se seque colocamos el cubreobjetos y
el aceite de inmersión y observamos al microscopio
Se observa que la tinta china no tiñe a la célula, sino que vemos el contraste alrededor Se observa el aló
transparente y la tinta china dispersas la tinta china

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