UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

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ANÁLISIS GENÉTICO
MOLECULAR

INTEGRANTES
ARANA NOMBERA HAROLD ALESSANDRO
ASTONIAS VASQUEZ MARÍA NELLY
CRUZ IBAÑEZ KAROLL GERALDINE
DIAZ MANAY BETSY ORIANA
TORRES JIMENEZ MEDALI

DOCENTE

- DR. GILBERTO, GONZALES BERNAL

30 de abril de 2018
 INTRODUCCIÓN

El análisis genético es una prueba muy compleja que se

realiza en un laboratorio especializado en el análisis del
genoma. Dicho estudio sirve para identificar la causa
genética (la mutación) de una determinada enfermedad en un
paciente. En algunos casos, las mutaciones pueden ser tan
grandes que se pueden detectar observando los
cromosomas al microscopio. A ese tipo de análisis se le
llama cariotipo, o estudio citogenético. Sin embargo,
normalmente, las mutaciones son cambios tan pequeños que
afectan a una única base química del ADN (una letra del
genoma).

Para detectar estas mutaciones tan pequeñas, es necesario

utilizar técnicas sofisticadas de análisis del ADN. Estas
técnicas, mucho más complejas, se denominan estudios
moleculares, y normalmente se realizan mediante la
secuenciación de una pequeña parte del genoma del
paciente.

En el siguiente informe daremos a conocer las diferentes

técnicas o métodos utilizados para extraer el ADN de las
células y lo procesos necesarios para que este pueda ser
estudiado.
 OBJETIVO:

- Conocer los diversos métodos que existen para la extracción de ADN y

compararlos para determinar cuáles de ellos tienes mejores resultados.
- Informarnos acerca de las enzimas de restricción y cómo es que estas
actúan cortando el ADN en sitios específicos.
- Conocer la utilidad de los polimorfismos genéticos.
- Saber que métodos existen para identificar los polimorfismos del ADN
genéticos.
- Conocer en que consiste la amplificación de ADN.
- Conceptualizar que estudia la medicina forense y apartir de qué datos esta
rama puede obtener la información necesaria para poder determinar
diferentes características de alguien a través de su ADN.
EXTRACCIÓN DE ADN:
La extracción de ADN se realiza para
obtener las moléculas aisladas con alto
grado de pureza y poderlas utilizar en
investigación científica, en medicina o
para la ciencia forense.

La mayor parte de los métodos que existen para extraer el ADN consisten en
lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para luego separar las moléculas de
ADN del resto de los constituyentes de la célula.

A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en

cuenta varios factores:

- La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.

- El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.
- La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.
- El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado.
- Uso que se le va a dar al ADN extraído.

Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de

muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales,
tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros.

MÉTODO DE SALTING-OUT:

A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros

contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que
hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.
En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para
regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las
enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se
utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en
concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El
precipitado formado se separa por centrifugacón y luego se puede extraer el ADN
de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación.

Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en
muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en posteriores
aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes orgánicos.

LISIS POR RUPTURA MECÁNICA Y EXTRACCIÓN CON DISOLVENTES

ORGÁNICOS

Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay
que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se
intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero
no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado para
extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse con
un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de
células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las
proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por
lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. Este método
se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos
rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que
hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los
factores que aseguran una buena separación. Las desventajas de este método
son el uso de disolventes orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden
quedar como trazas en la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en
técnicas como el PCR, que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco
reproducibles y requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de
contaminación de la muestra.

USO DE LA PROTEINASA K Y EL DODECILSULFATO DE SODIO

El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K -

sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la extracción de ADN ya
que la digestión de la muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada
por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en
el lisado celular usando detergente aniónico el SDS. La proteinasa K también es
usada en otros de los métodos.

USO DE RESINAS DE INTERCAMBIO IÓNICO

Para la extracción del ADN también se han diseñado resinas que son capaces de
formar complejos con el ADN. El uso de resinas hidrocarbonadas con estructuras
rígidas en tres dimensiones permite que la superficie se encuentre cargada con
alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede protonarse en medio ácido y
quedar cargado positivamente por lo que interacciona con los grupos fosfatos del
ADN. Esto es un método directo, que puede realizarse en un solo tubo y
relativamente rápido, pero tiene como inconveniente que se aíslan cadenas
sencillas de ADN, y este no puede ser utilizado por ejemplo para el análisis de la
variación de polimorfismos en fragmentos de restricción (RFLP).

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (CORTE DE ADN):

Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen y cortan las moléculas de
DNA por secuencias nucleotídicas específicas. Aunque estas enzimas
desempeñan una función propia en las células procariotas en las que se
descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en
varias áreas de la biología molecular, de interés tanto básico como aplicado al
diagnóstico clínico; en especial, se utilizan en el proceso de clonación molecular
del DNA. Además, tienen aplicación en otras técnicas como la secuenciación del
genoma y el estudio de los polimorfismos.

En 1971, un artículo publicado por Kathleen Danna y Daniel Nathans marcó el

inicio de la era del ADN recombinante. Este artículo describe el aislamiento de una
enzima de una cepa bacteriana y la utilización de esta enzima para cortar ADN
vírico por secuencias nucleotídicas específicas. Utilizando enzimas de restricción y
otros recursos diversos, entre
mediados y finales de la década de
1970 se desarrollaron técnicas
para generar, replicar y analizar
moléculas de DNA recombinante.
Este conjunto de métodos,
denominados tecnología del DNA
recombinante, supusieron un
progreso importante en la
investigación y permitieron a
cientos de científicos aislar y
estudiar secuencias específicas de DNA. Por sus contribuciones al desarrollo de
esta tecnología, en 1978 Nathans, Hamilton Smith y Werner Arber fueron
galardonados con el premio Nobel de fisiología y medicina.

Las enzimas de restricción son producidas por las bacterias como un mecanismo
de defensa contra las infecciones víricas, concretamente contra virus
bacteriófagos, cuya reproducción depende de la maquinaria genética de la
bacteria. Se trata de los sistemas de restricción-modificación o metilación-
restricción. Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma
secuencia que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos
metilo a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. El mecanismo de
defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una forma
específica, característica de cada especie bacteriana (en las secuencias
reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La
metilación de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el
ADN propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro
organismo, no metilado o con un patrón de metilación diferente, este DNA puede
ser degradado por la enzima de restricción, ya que carece de los grupos metilo en
la secuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma habrá
un cierto número de secuencias e 6, 6 u 8 pares de bases iguales a la reconocida
por la enzima, por lo tanto, habrá secuencias diana disponibles). A partir de este
mecanismo de acción combinada surgió precisamente el nombre de enzimas de
restricción, ya que la acción de estas enzimas restringe la posibilidad de infección
por virus.

Las enzimas de restricción se nombran con tres letras tomadas del género y
especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por
una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y
finalmente por un número romano que las identifica en caso de que en una misma
variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad:

Estas enzimas se han clasificado en tres grupos distintos (tipo I, tipo II y tipo III) de
acuerdo a sus propiedades, siendo las de tipo II las más estudiadas debido a su
utilidad en el campo de la bilogía molecular, sobretodo en el área de genética
molecular. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción tipo
tienen una simetría palindrómica, es decir, dichas secuencias se leen igual en
ambas cadenas del DNA en dirección 5’ – 3’.

El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para

producir insulina humana para los diabéticos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restricción han tenido mayor
implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con
cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o
deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de
la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de
corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se
deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una
electroforesis.

SOUTHERN BLOT
Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de
biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN
concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la
técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de
ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en
la cual se efectúa la hibridación de la sonda.1 Su nombre procede del apellido de
su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

Pasos de Southern blot

1. Extracción del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del
delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras
de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que

es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es
HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según
su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis,
las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más
deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado,
se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su
tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia
con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.

4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan

mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución
alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o
"calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es
"secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como
método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual
que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una
réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la
membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN
conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.

5. Hibridación con sonda radioactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de
hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la
molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en
el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern
resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de
sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de
sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de
nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del

ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X
dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde
hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el
registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en

varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la
primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda
radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una
misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".
TÉCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS:
I. BLOTTING: SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT

I.1. Southern blot

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para
la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN es digerido con una
enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una
electroforesis en un gel. Se realiza tinción con bromuro de etidio para comprobar
la calidad de la electroforesis y del ADN (Fig. 1). A continuación los fragmentos de
ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido débil y
desnaturalizados con NaOH para permitir la transferencia. Posteriormente, el ADN
es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada
una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A
continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada
(radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va
hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia
complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una
exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una
película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo.

I.2. Northern blot

Es esencialmente idéntica al método de Southern blot, salvo que las moléculas de
ácido nucleico de la muestra, en este caso de ARN (total, mensajero, vírico, etc.),
se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (en presencia de
formaldehído, que forma parte de la composición del gel). Esto es debido a que, a
pesar de ser una molécula de una sola cadena, se forman complejas estructuras
secundarias que dificultan la migración. Al igual que en el Southern blot, el ARN se
transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada.
Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm
correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S)

Tanto la técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al
haber sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR.

II. CGH (HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA):

La hibridación genómica comparada es una técnica citogenética para detectar

regiones cromosómicas que están amplificadas o delecionadas en una muestra,
especialmente en tumores. En la CGH, dos muestras de DNA genómico (una
tumoral y una normal) se marcan con diferentes fluorocromos y se hibridan
simultáneamente sobre una extensión de cromosomas metafásicos. La relación de
intensidad entre las dos señales fluorescentes proporciona una medida de la
relación entre el número de copias de las dos muestras de DNA genómico. Una
técnica derivada de la anterior es la matriz de CGH (CGHarray), en la que los
DNAs marcados se hibridan sobre una matriz de fragmentos de DNA bien
definidos, inmovilizados sobre un soporte sólido. Como resultado, la resolución
obtenida se incrementa enormemente, ya que existe una gran cantidad de
fragmentos génicos representados y de relativamente pequeño tamaño. La alta
resolución de esta técnica permite la detección de desequilibrios genómicos
submicroscópicos.

III. MICROARRAYS DE ADN

Es el tipo de microarray al
que suele referirse cuando
se habla de forma general
y sirven para analizar el
nivel de expresión de miles
(o todos) los genes de una
muestra. Los hay de dos
tipos principales: aquellos
que utilizan como sondas
fragmentos de cDNA y los
que usan fragmentos más
pequeños de ADN
(oligonucleótidos). A estas
sondas, colocadas sobre el
soporte, se les lanzará el ARN de la muestra que ha sido previamente
transformado en cDNA, de tal manera que aquellos genes muy expresados (con
gran cantidad de ARN en la muestra original) darán una mayor señal al unirse
(hibridación) a su sonda correspondiente, lo cual se detecta por medio de
fluorescencia con un lector de luminosidad
El resultado del experimento es una “fotografía” del estado de expresión del ARN
de los genes de la muestra (tumoral o normal). Se trata por tanto de un método de
screening masivo para detectar aquellos genes que se sobre- o infraexpresan en
una muestra. Utilidad en Patología Molecular: - Detección de mecanismos o vías
estimulados o reprimidos en el metabolismo celular (neoplasias o no neoplasias) -
Detección de marcadores tumorales útiles para el diagnóstico y clasificación de las
neoplasia - Detección de marcadores tumorales útiles para el pronóstico y
predicción de respuesta terapéutica de las neoplasia. - Detección de dianas
terapéuticas

IV. HIBRIDACIÓN IN SITU

Es una técnica de hibridación que se realiza directamente sobre tejido, células o

cromosomas localizados sobre un soporte sólido, habitualmente un portaobjetos.
La visualización puede realizarse por medios isotópicos, enzimáticos o con
fluorescencia, siendo evaluada en un microscopio. Su gran virtud es que permite
identificar las células donde se produce la hibridación que detecta la alteración
genómica o transcripcional. La visualización de resultados puede realizarse por
marcaje con fluorescencia de la sonda (FISH) o cromogénico (CISH, SISH). Este
último tiene la ventaja de poder realizarse en microscopio de campo claro y poder
almacenarse casi indefinidamente las preparaciones.

AMPLIFICACION DE ADN
¿QUÉ ES?
Multiplicación de un pedazo de ADN en una probeta en muchos miles de
millones de copias. Proceso de el más comúnmente usado es el sistema de
reacción en cadena (PCR) de polimerasa, pero se están desarrollando otros
sistemas, incluyendo la reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación de
ácidos nucleicos dependiente de la secuencia y el sistema Q-β.1

¿EN QUE CONSISTE?

Con el fin de estudiar o detectar genes individuales o regiones de ADN
específicas o mutaciones de interés, a menudo es necesario obtener una gran
cantidad de ácido nucleico para el estudio. En lugar de aislar una sola copia
del ADN diana de un gran número de células, a menudo es más útil generar
múltiples copias de un objetivo a partir de una sola molécula de ADN o
ARNm, a través de un método de amplificación in vitro.

Como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es el método de

amplificación de ADN más común en biología molecular, la cartera de
productos de Isla SAS presenta una gran selección de polimerasas orientadas
hacia este poderoso método.2

TÉCNICAS:

 REACCIÓN EN CADEMA DE LA POLIMERASA (PCR):

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio
que permite amplificar pequeños fragmentos de ADN para identificar
gérmenes microscópicos que causan enfermedades.

PCR son las siglas por las que se conoce a la reacción en cadena de la

polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction), una técnica científica
avanzada que fue inventada por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en
1985. Esta técnica permite amplificar pequeñas regiones específicas
del ADN en laboratorio. Es decir, consigue que un p equeño segmento de
ADN que pasaría desapercibido en un análisis cualquiera se multiplique
millones de veces y así sea
fácil de detectar.
Gracias a esta técnica se
han podido
realizar estudios
genéticos en cualquier
campo de la ciencia. Por
ejemplo, se utiliza
diariamente para la
identificación de cadáveres
o en el estudio de escenas
del crimen para buscar
rastros del culpable. También se emplea en la biología, para identificar
cadenas genéticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la
medicina se reúne la experiencia de todos esos campos y se usa
principalmente para identificar gérmenes agresores que se encuentran en
nuestro organismo.

Cuando se desarrolló la prueba de la PCR por primera vez se trataba de una

técnica cara y algo engorrosa de realizar, pero pronto se generalizó su uso y
se empezaron a desarrollar equipos sencillos y muy baratos que se utilizan
todavía hoy en muchos centros diagnósticos. 

Además, se han diseñado PCR más específicas que se pueden elegir según
sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, además de la básica,
son:
  PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de
millones de
fragmentos. Es capaz
por lo tanto de
detectar trazos
minúsculos.

 PCR in situ: permite la

detección de ADN en
el mismo lugar de la
muestra, sin tener que
procesarla primero con
técnicas de
laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.

 PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos
de ADN a la vez y con una sola muestra.

 PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN

para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa
inversa, la misma que utiliza el VIH entre otros virus.

 PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente

fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del
ADN detectado.3

 NASBA:
Es una tecnología dependiente de primers que puede ser usada para la amplificación
continua de ácidos nucleicos en una mezcla única a una sola temperatura .

El NASBA es una técnica que permite una amplificación exponencial de ARN a

partir de una muestra inicial dada. El factor de amplificación está entre 500 y
1000 veces. La cantidad de moléculas generadas depende del número de
moléculas iniciales.

Está diseñado específicamente para la detección de virus de ARN y otros

microorganismos difíciles de detectar (Chlamydias) al detectar los ARNm.
Para amplificar dianas de ADN es preciso desnaturalizarlo para que la RT una
el cebador b con el promotor de la T7P.

El NASBA presenta una serie de limitaciones, pues su sensibilidad y

especificidad no son muy elevadas, generándose falsos positivos y falsos
negativos.

 TMA:
La tecnología de amplificación mediada por la transcripción en tiempo real
(TMA),detecta la contaminación microbiana especifica en horas,en comparación
con los días o semanas usualmente necesarios para generar resultados usando la
tecnología tradicional de cultivos .

 LCR:
El método utiliza la DNA ligasa para unir dos pares de sondas complementarias después de
que estas se hayan unido a la secuencia diana in vitro .4

POLIMORFISMOS GENÉTICOS

La palabra polimorfismo en términos de ADN

hace referencia  a un sitio concreto (locus) de
esa larguísima molécula, que puede contener
diferentes informaciones o secuencias de los
nucleótidos componentes en el ADN  en dos
individuos diferentes. Si analizamos esos lugares
de las diversas cadenas de ADN de diferentes
personas,  nos  vamos a encontrar diferencias
entre unas y otras. Si existen más de 2 variantes
(dimorfismo),  hablamos de polimorfismo. Los
polimorfismos pueden ser de dos tipos:
polimorfismo de secuencia  o polimorfismo de
longitud.

Los polimorfismos de secuencia son aquellos

donde el orden de los nucleótidos se ve alterado.
Normalmente, al tratarse del mismo locus su
diferencia no es muy notable, pero no forman
exactamente la misma secuencia. Una clase de estos polimorfismos son los SNPs (Single
Nucleotide Polimorphism) que afectan a un sólo nucleótido, es decir, el cambio de una
base (A, T, C, G) dentro de la secuencia del ADN.  A simple vista un sustitución de una
base en la secuencia de ADN parece un cambio insignificante pero, en ocasiones, la
sustitución de un nucleótido por otro; por ejemplo C por  T,  modifica en algunos casos la
cadena de aminoácidos que se forma en el proceso de traducción, generando  una
proteína diferente con funciones totalmente distintas.

Un ejemplo de polimorfismo de secuencia  es el de los alelos del sistema sanguíneo ABO,

que fue el primero descubierto en nuestra especie por Landsteneir en 1900. En el sistema
sanguíneo ABO, las secuencias que van a determinar el tipo de alelo A, B o O son muy
parecidas pero distintas, y se encuentran en el mismo lugar del ADN del individuo que
porta esa variante. Así cada uno tenemos una información diferente en la misma región
de nuestro ADN que determinará si somos A, B ó O.

Los polimorfismos de longitud son variantes del mismo locus pero que se diferencian por
la longitud, es decir el número de nucleótidos dentro del fragmento de ADN. Cada
polimorfismo tiene en sus extremos una secuencia que delimita su posición y permite
identificarlo. La mayoría de estos polimorfismos de longitud son secuencias repetitivas en
tándem; es decir, una serie ordenada de nucleótidos más corta que se repite una y otra
vez. Las veces que cada secuencia se repite varía, por lo que cuantas  más repeticiones
se den, más larga será la longitud del locus del ADN total. Se desconoce el significado
biológico de esos locus “tartamudos” del ADN, pero en ellos se basa la elaboración de
perfiles genéticos por los que se identifica el ADN de cada persona.

Se ha comprobado que las diferentes combinaciones en los locus polimórficos de un

mismo individuo hacen que presente mayor o menor tendencia a manifestar un rasgo o
propiedad fisiológica. Esto implica realizar un análisis de ADN completo de muchos
individuos, localizar los polimorfismos presentes y realizar estadísticas sobre dichos
análisis.

APLICACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS

El estudio de los polimorfismos tiene muchas aplicaciones en medicina,
investigaciones biológicas y procesos jurídicos. En algunos casos las
enfermedades genéticas pueden ser causadas por polimorfismos. De esta forma,
los investigadores pueden usar los polimorfismos como marcadores de ciertas
enfermedades, por ejemplo, si el presentar ciertos polimorfismos puede ser causal
de riesgo para el desarrollo o progresión de alguna enfermedad. Los
polimorfismos localizados cerca de un “gen candidato” pueden ser usados para
hallar el gen por sí mismo a través de un mapeo genético. En este proceso el
investigador está en búsqueda de polimorfismos que son heredados junto con la
enfermedad, tratando de delimitar estos polimorfismos en regiones más y más
pequeñas del cromosoma. Así, la región del cromosoma implicada en la
enfermedad puede ser progresivamente delimitada, y el gen responsable
finalmente puede ser localizado.

Los polimorfismos genéticos pueden ser usados como marcadores para ayudar a
esclarecer ciertos patrones y/o procesos biológicos; además, pueden establecer
parentescos. También se puede determinar la cantidad de entrecruzamiento entre
diferentes grupos de la misma especie (flujo genético), y la información ser usada
para identificar poblaciones únicas, potencialmente importante para la
sobrevivencia de la especie. Puede no ser claro si dos grupos distintos de
organismos deben ser clasificados como de diferentes especies y el comparar los
polimorfismos genéticos de los dos grupos puede ayudar a su clasificación.

De igual forma, si se analizan suficientes polimorfismos, es posible distinguir

distintos individuos con un alto grado de confianza. Este método es conocido
como “huellas de ADN” y representa una herramienta importante en medicina
forense y en procesos jurídicos. El genotipo de una persona o su huella de ADN,
puede ser determinado a partir de muestras muy pequeñas (cabello, sangre,
células de la piel, etc.). El genotipo de la muestra encontrada puede ser
comparado con el genotipo del individuo “sospechoso”. También, el análisis de los
polimorfismos puede ayudar a probar la paternidad en situaciones de disputa.

IDENTIFICACIÓN DE POLIMORFISMOS
Para identificar factores genéticos asociados con determinado fenotipo, se busca
perfeccionar las herramientas de estudio. A continuación se mencionan algunos
métodos que se han desarrollado con el objeto de identificar nuevos
polimorfismos, así como para la discriminación alélica (identificación de
polimorfismos ya conocidos).

D/TGGE (GENES DE ELECTROFORESIS EN GRADIENTE

DESNATURALIZANTE/TÉRMICO)

Analiza el polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones

desnaturalizantes o a diferentes temperaturas del DNA amplificado. Su principal
problema reside en las dificultades técnicas para mantener estables las
condiciones experimentales.

SSCP (POLIMORFISMO DE CONFORMACIONES DE CADENA SENCILLA)

Técnica basada en el análisis del polimorfismo a través de las diferencias

conformacionales de fragmentos de DNA de cadena sencilla. Las distintas
conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de
poliacrilamida no desnaturalizante. Es especialmente útil cuando las reacciones de
PCR producen bandas de DNA de gran tamaño, o bien bandas de tamaño muy
parecido; puede llegar a distinguir cambios de pocos nucleótidos.
DHPLC (CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN)

La técnica es una variante del análisis heteroduplex. En lugar de usar un gel y

separar los fragmentos de ADN por electroforesis, se utilizan una resina
modificada y el HPLC. Cuando se separan los fragmentos de ADN a altas
temperaturas, se realinean los fragmentos y se pueden distinguir las cadenas
heteroduplex de las homoduplex mediante el tiempo de retención en la columna.

SECUENCIACIÓN POR HIBRIDACIÓN

Cuando se conoce la secuencia de un fragmento de ADN, es posible colocar un

juego de oligonucleótidos cortos representando el fragmento completo de ADN o
“chip” de ADN. Debido a que se conoce la secuencia de los oligonucleótidos en
cada posición, se puede inferir la secuencia de ADN de una prueba de ADN
marcada con fluorescencia, analizando el patrón de hibridación. Actualmente se
pueden escanear más de 15kb de ADN en un chip conteniendo 40,000
oligonucleótidos. Este método es uno de los mejores para analizar fragmentos
grandes de ADN.

DISCRIMINACIÓN ALÉLICA

No existe el método ideal; los usados actualmente emplean cuatro mecanismos

generales para llevar a cabo la discriminación alélica: hibridación alelo-específica,
ligación de oligonucleótidos alelo-específicas, incorporación de oligonucleótidos
alelo-específica y corte enzimático alelo-especí- fico.46 Algunos ejemplos de estas
técnicas son:

PCR-RFLP (POLIMORFISMO EN EL TAMAÑO DE LOS FRAGMENTOS DE

RESTRICCIÓN).

Se usan enzimas de restricción que cortan secuencias específicas de ADN; es

decir, un fragmento de ADN amplificado por PCR se somete a digestión con una
endonucleasa, ésta tendrá un sitio de corte específico y las variaciones alteraran
este patrón de corte; dando como resultado un patrón diferente de migración que
puede ser visualizado mediante el corrimiento de estos fragmentos en geles de
agarosa, comparando y distinguiendo los distintos genotipos.

HIBRIDACIÓN

En ésta se diseñan dos pruebas alelo-específicas para hibridar a una secuencia

blanco, solamente cuando éstas sean totalmente complementarias. Cuando las
sondas alelo-específicas son inmovilizadas sobre un soporte, se capturan las
muestras de ADN y se visualizan los eventos de hibridación detectando una marca
fluorescente. La hibridación es una de las formas más fáciles para la
discriminación alélica47 ya que no se usan enzimas.

EXTENSIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMER EXTENSIÓN).

Prueba muy sólida y flexible de discriminación alélica. Hay tres categorías de

variaciones del método, basadas en que la ADN polimerasa puede incorporar
nucleósidos específicos complementarios a la secuencia del templado

PCR EN TIEMPO REAL

Método basado en la aplicación de la técnica de PCR y en la creación de dos

sondas alelo-específicas, las cuales emiten una señal fluorescente al unirse al
templado. Este tipo de análisis es más utilizado hoy en día porque ya existen
sondas prediseñadas para un sinnúmero de polimorfismos, ya descritos.

CASOS DE IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL EN LA PRÁCTICA DE LA

MEDICINA FORENSE:
Son técnicas empleadas en genética para la identificación de los individuos en
base al análisis del ADN. El hecho de utilizar el análisis de ADN para identificar a
una persona sigue un razonamiento sencillo. Cada ser humano es diferente; dos
personas pueden ser más o menos parecidas, sobre todo entre familiares
cercanos, pero nunca son idénticos, salvo en el caso de los gemelos univitelinos.
Esta diferenciación entre las personas se debe a que existen millones de
combinaciones posibles de ADN entre un óvulo y un espermatozoide, debido a la
recombinación genética que se produce en la meiosis. Pero a pesar de ello, los
genes de todos los seres humanos son poco variables y constituyen un gran
porcentaje de la información contenida en la molécula de ADN; la información
restante, incluye sectores que pueden exhibir un cierto grado de variabilidad entre
los individuos, en consecuencia: “todos los seres humanos tenemos sectores del
ADN en común y otros que no lo son”.
MODELOS PARA LA INVESTIGACION DE RESTOS:

- El estudio de un cráneo nos permite diagnosticar de:

Sexo
Raza
Edad

- Examen de la pelvis ayuda a determinar:

Edad
Sexo
- Estudio de huesos largos gran aporte sobre la talla.
- MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:
- Esqueletizar los restos
- Dibujo gráficamente realizado por un dibujante del Laboratorio de
Criminalística de la Guardia Civil
- Fotografía
- Radiografía
- Análisis de ADN mitocondrial
- Edad: crecimiento y desarrollo óseo
- Análisis del grado de la formación y erupción de los dientes, aparición de
los centros de osificación y la maduración ósea.
- Estado de sinostosis de las suturas craneales, cambios morfológicos de la
sínfisis púbica y de la faceta auricular y el grado de osificación del extremo
esternocostal de la cuarta costilla.
- RECONSTRUCCIÓN FACIAL:
Técnicas:

1. Computarizada:

- es la más nueva en el campo antropológico forense.

- fue desarrollada con fines museográficos y artísticos.

- Capaces de captar imágenes y rostros en diferentes materiales tales como

arcilla, cemento, terracota o cualquier material maleable.

2. Recurso en la identificación de víctimas recuperadas sin un contexto en

particular

- Fue utilizada como último recurso

- se aplicó en casos antropológico forenses a finales de los años 70

- Ha sido una gran forma de identificación de víctimas y ha pasado a formar

parte de las técnicas utilizadas.

CASOS RECIENTES

-Los casos más recientes están en los Estados Unidos como consecuencia de las
guerras de Corea y Vietnam.

-Entre cadáveres de miles de soldados norteamericanos enterrados en Japón y

Hawaii fueron desenterrado al cabo de varios años para su traslado a Estados
Unidos, donde intervinieron grandes expertos en medicina forense para llevar a
cabo su identificación.
 CONCLUSIONES:

- Conocimos las diversas técnicas o métodos que se usan para poder extraer
el ADN de las diversas células o tejidos que se posean.
- Nos informamos que las enzimas de restricción reconocen una secuencia
de nucleótidos en el ADN y cortando esa parte, además de conocer que el
primer uso de esto fue para producir insulina humana para diabéticos
manipulando la bacteria E. coli.
- Los polimorfismos genéticos pueden ser usados como marcadores para
ayudar a esclarecer ciertos patrones y/o procesos biológicos; además,
pueden establecer parentescos.
- Existen muchos métodos que han ido apareciendo a través de la ciencia
para identificar los polimorfismos genéticos entre estos tenemos: D/TGGE,
SSCP, DHPLC, Secuenciación por hibridación, Discriminación alélica, PCR-
RFLP, Hibridación, Extensión de oligonucleótidos, PCR en tiempo real.
- Consiste en el estudio o detención de genes individuales o regiones de
ADN especificas o mutaciones de interés ,para la obtención de estudio
- La medicina forense nos ayuda a identificar a los individuos en base a un
análisis del ADN., así como la cantidad de heridos infligidas en víctimas de
crímenes violentos, por ende, con la ayuda de estos el instituto de ciencias
forense ha podido aclarecer algunos casos.
 BIBLIOGRAFÍA:
- ¿Qué son las Enzimas de Restricción, para qué se usan y qué función
desempeñan en la naturaleza? [Internet]. AllScience. 2018 [citado el 25 de
Abril del 2018]. Disponible en: https://www.e-
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by-m-gabriela-g