INFORME DE LABORATORIO

Determinación de Biomasa

POR
Juan Esteban Muñoz Vergara

NOMBRE DEL PROGRAMA Y N° DE FICHA

Química aplicada a la industria
1751745

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

Centro textil y de gestión industrial
 INTRODUCCIÓN

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en un

bioproceso, ya que con esta cuantificación se puede verificar la eficiencia del mismo
proceso. Esta variable es la clave para establecer las tasas de producción, de consumo
de nutrientes y el cálculo de balances de masa de cualquier proceso biológico.

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico, como el incremento

ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un
aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En
organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del
individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que
ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que la
duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce en
aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica convirtiéndose en aquello que se denomina
biomasa. El crecimiento bacteriano y la producción de biomasa puede ser estudiado
desde dos puntos de vista:

 A escala individual
 A escala poblacional

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, e

inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmido

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:

 cinética del crecimiento

 factores que afectan el tiempo de generación (g)
 factores ambientales que limitan el crecimiento.

Para la determinación de la biomasa o crecimiento celular se puede recurrir a diferentes

métodos de cuantificación, quienes se dividen en dos tipos: directos e indirectos.
Métodos directos: Se basan en la medición del número de células o masa celular. Para
la determinación del número de células se pueden realizar conteos directos o conteos en
placa, para la masa celular se recurre a la medición del peso seco o de la turbidez del
medio de cultivo.
Métodos indirectos: Se fundamentan en la determinación de algún componente celular
específico, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos) o en
la medida del consumo de sustrato o formación de producto (métodos cinéticos). Los
métodos bioquímicos o cinéticos determinan, más que la viabilidad y/o número de las
células, su actividad metabólica.
Tabla 1. Métodos indirectos de cuantificación

Método Analito
Consumo de sustrato Azucares
Formación de productos Metano, etanol, dióxido de
carbono
Métodos cinéticos Respirometría (CO2 y O2)
Componentes celulares Ac. Nucleicos, proteínas,
lípidos, ATP
Actividades enzimáticas deshidrogenasa

Para la cuantificación de biomasa en la práctica se usaron los siguientes métodos

directos:

 Conteo en cámara de Neubauer

 Métodos gravimétricos (Peso seco)
 Método espectrofotométrico
.
 OBJETIVOS

 Determinar la biomasa o crecimiento celular usando métodos de cuantificación

directos
 Conocer sobre la inoculación y propagación de células en medios de cultivo
semisintéticos
 Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos
 METODOLOGÍA

Preparación medio
Preparación Inoculación
de cultivo medio
Inóculo medio
sintético YM
modificado (100 ml)

Se peso 0,5 g de Se tomó el tubo de

Se pesaron los siguientes ensayo con el
sacarosa
reactivos y se depositaron inóculo preparado
en un Erlenmeyer de 200 ml a partir de células
liofilizadas
 0,3 g de extracto de Se agrego en un comerciales
levadura liofilizada tubo de ensayo
 0,5 g de peptona
 1 g de glucosa
 100 ml de agua
Se añadieron 10 Se vertió el
ml de agua contenido del tubo
en el Erlenmeyer
con 90 ml de
Se agitó hasta diluir medio y se rotulo
Se esterilizó mediante el Erlenmeyer
procedimiento de
Se adicionó 90 ml del medio pasteurización
preparado en un Erlenmeyer de sumergiendo el cultivo
250 ml en un baño maría a Se agitó para
80°C por 15 minutos homogenizar

Se cubrió las bocas de los

Se depositaron 30
Erlenmeyer con tapones de
ml del medio en
algodón gasa Se peso 0,7 g de
un tubo falcon de
levadura y se añadió al
50 ml
tubo

Se esterilizó mediante
procedimiento de Se colocó en
pasteurización sumergiendo el Se agitó y se dejo shaker a 35°C
cultivo en un baño maría a actuar durante 5 durante 48 h
80°C por 15 minutos minutos
 Se tomó muestra a las 48 h y se
Se dejo enfriar a temperatura realizo nuevamente
ambiente cuantificación de la
concentración celular por peso
seco y absorbancia

Determinación de la concentración celular del inóculo y el medio fermentado

usando métodos directos

Densidad óptica
Se Ajustó la absorbancia del espectrofotómetro ultravioleta visible a 660 nanómetros
(nm), se tomó una celda plástica de 1 cm, se limpió suavemente por fuera y se purgó con
medio YM sin inocular, luego se llenó la celda hasta cierto punto con este mismo medio ,
se introdujo la celda en uno de los cubículos, ubicándola de forma adecuada para que el
haz de luz del equipo la atravesara, se leyó el blanco que en este caso es el mismo
medio YM sin el inóculo con el fin de llevar el equipo a una absorbancia de cero, corregir
el ruido o interferencias que puedan presentarse durante la lectura de la muestra ,
posteriormente se retiró la celda del equipo, se purgó nuevamente la celda con la muestra
en este caso medio YM inoculado (medio YM con una levadura), se llenó la celda con
este mismo medio, se introdujo nuevamente la celda en el equipo de la misma forma
como se introdujo al momento de leer el blanco , y se procedió a leer la absorbancia de la
muestra. .
La lectura de la muestra se realizó por triplicado para verificar la variación en el tiempo, a
mayor turbidez, mayor población celular.
Para calcular la absorbancia de la muestra se usó la siguiente ecuación

Ec. 1. Asb muestra=|medio|inoculado−|medio|sin inocular (blanco)

Método gravimétrico (peso seco)

Se pesaron 3 tubos falcon, de 14 ml con tapa en balanza analítica, se marcó cada tubo,
se agregó con macropipeta a cada tubo de a 5 ml de medio YM con inóculo de levadura,
se introdujeron los tres tubos en una centrífuga, se centrifugaron las muestras a 4.000
rpm durante 10 minutos, pasado este tiempo, se descartó la fase líquida de los tres tubos
con mucho cuidado, se colocaron los tubos en una gradilla y se llevaron a la estufa de
secado por 6 horas a 70°C, pasado este tiempo se pesó el tubo falcon con la muestra
seca y se determinó el peso de la biomasa obtenida con la siguiente formula:

Ec 2. Peso seco ( gLms )= ( Peso tubo+ muestra seca ) −( peso inicial tubo)
volumen muestra (¿ 0.005 L)

Método de Conteo en cámara de Neubauer

Se tomaron tres tubos de ensayo de 15 mL limpios y secos, se marcaron de acuerdo a las
diluciones que se realizarían, se adicionaron 9 mL ± 0,1 mL de solución salina con
peptona a cada uno de los tubos de ensayo, luego se Tomó 1 mL de medio YM con el
inóculo de levadura usando una micropipeta, se mezcló el primer tubo con ayuda del
vórtex.
Se Tomó 1 mL de la solución del primer tubo usando una nueva punta de micropipeta, se
adicionó a un segundo tubo y se mezcló bien con ayuda del vórtex, luego se tomó un ml
del segundo tubo y se llevó al tercer tubo
Se llega a tener una dilución de 1x10^3 en el tercer tubo
De la tercera solución se tomaron 10 µl y por capilaridad se agregaron por un borde del
cubreobjetos, se distribuyó la muestra, se llevó la muestra al microscopio y se observó
con el objetivo de 40x. Para realizar el conteo en cámara de Neubauer se debe usar la
siguiente ecuación

N ° células
Ec. 3. =( ( ∑ células en cuatro cuadros ) / 4)× 10000× FD
mL
 CÁLCULOS Y RESULTADOS

Método espectrofotométrico: Crecimiento microbiano Turbidez (Absorbancia)

Blanco Muestra
Resultados

Grupo Tiempo (min) Muestra (medio YM + Blanco( medio YM) Absorbancia

Inoculo de levadura)
1 0 2,081 0,060 2,021
2 30 2,125 0,060 2,065
3 60 2,143 0,060 2,083
 2,056
 0,0319
cv 1,55
 Absorbancia
2.100
2.080 f(x) = 0 x + 2.03
2.060 R² = 0.94
Absorbancia

2.040
2.020
2.000
1.980
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)

Grafica absorbancia vs tiempo. Se evidencia que hay crecimiento celular en el transcurso del tiempo

Métodos gravimétricos (Peso seco):

Grupo 1 Grupo 2
Tubo falcon + Tubo falcon +
Tubo falcon vacio Peso biomasa Tubo falcon vacio Peso biomasa
muestra seca muestra seca
5,9656 5,8324 26,64 5,8838 5,8566 5,44
7,3308 7,2888 8,40 5,9081 5,8769 6,24
7,2767 7,2446 6,42 5,9510 5,9205 6,10
Volumen muestra (l) 0,005 Volumen muestra (l) 0,005
 13,82  5,93
 11,15  0,43
cv 80,65 cv 7,21

Grupo 3
Tubo falcon +
Tubo falcon vacio Peso biomasa
muestra seca
4,8784 4,8501 5,66
5,9126 5,8619 10,14
5,9694 5,9387 6,14
Volumen muestra (l) 0,005
 7,31
 2,46
cv 33,63

Los tubos de cada equipo que contienen la biomasa seca presentaron datos bastante
dispersos, esto pudo haber sido por una mala homogenización al momento de tomar la
muestra o no se tomó el volumen de 5 ml correctamente, el único grupo que presentó
números con menos variabilidad fue el grupo 2

Conteo en cámara de Neubauer

Al llevar la muestra al microscopio se contó uno de los recuadros de la esquina de arriba.
Para poder realizar el recuento total en cámara de Neubauer se debe realizar el conteo en
los 4 recuadros que componen la cámara

Número de celulas
Grupo Dilución contadas en camara Celulas / ml
de Neubauer
1 1x10² 117 1,2 x10⁸
2 1x10³ 31 3,1x10⁸
3 1x10³ 18 1,8x10⁸
Limite de detención 1x10⁴

CONCLUSIONES

A partir de los métodos para la determinación de la biomasa o crecimiento celular se

puede decir que los métodos directos los cuales se basan en la medición del número de
células o masa celular pueden ser más simples de cuantificar que los métodos indirectos
porque estos se fundamentan en la determinación de algún componente celular específico
porque es posible determinar la actividad enzimática o consumo de algún sustrato en
particular pero es difícil obtener un número aproximado de células que pueden estar
presentes en alguna muestra en particular.
Ahora bien encontramos que los resultados arrojados por el método gravimétrico (peso
seco) el cual hace parte de los métodos directos fueron datos variados y distantes debido
que el primer grupo que realizó dicho proceso en uno de sus tubos falcón obtuvieron un
peso de biomasa muy distantes con relación a sus otros datos que se muestran en la
tabla 1, sin embargo los datos del grupo dos fueron más cercanos es decir presentaron
menor variabilidad con relación al peso de la biomasa y el grupo 3 presento datos un poco
menos desviados con relación al grupo número 1, lo cual nos hace inferir que se pudo
haber tomado mal el volumen de la micropipeta al tubo falcón.