COLORADO SILVA ANGEL ADOLFO: 18020340068.

HERNANDEZ TELLEZ CYNTHIA NAZARETH.

RESUMEN SOBRE TEJIDOS CONECTIVOS OSEOS.

Bioimplante como una restauración novedosa para la pérdida de dientes.
Un implante dental se utiliza para reemplazar un diente que falta. La fijación del
implante en su posición natural requiere la ingeniería de una cantidad sustancial de
crecimiento óseo conformado dentro de la cavidad del implante, osteo-integración.
Sin embargo, este accesorio de implante convencional no incluye el ligamento
periodontal (PDL), que tiene un papel fundamental en la amortiguación de altas
cargas mecánicas. Como resultado, los implantes dentales tienen una vida útil más
corta que el diente natural y tienen una alta probabilidad de infecciones.
Debido a esa alta probabilidad de infecciones alta diseñaron un biomaterial como
bioimplante, que da una conexión de PDL viva de titanio con implantes de titanio
donde básicamente consiste en un tornillo de titanio envuelto en un biomaterial muy
conocido para las áreas odontológicas, la Hidroxiapatita envainado en láminas
celulares hechas de células periodontales humanas inmortalizadas. Los
bioimplantes fueron trasplantados a la región molar del primer molar superior de un
modelo de ratón de extracción dental. En 8 semanas, el bioimplante generó tejido
conectivo fibroso, una red localizada de vasos sanguíneos y un nuevo crecimiento
óseo fusionado en la cavidad ósea alveolar.
Básicamente el estudio consistió en un bioimplante diseñado con células humanas,
especializado para la conexión de la raíz, y resultó en la reconstrucción parcial de
un complejo de unión dental naturalizado (periodontium), que consiste en todos los
tipos principales de tejido, cemento, PDL y hueso alveolar.
Métodos utilizados.
Cabe destacar que los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y
aprobados por Onsei University College of Dentistry, Intramural Animal Use and
Care Committee.
Uso de Animales.
Todos los experimentos fuero realizados bajo anestesia profunda para evitar el
sufrimiento de los animales.
Los peratones desnudos femeninos (nu/nu BALB/c/Bkl) (Narabiotech Co.,
Pyeongtaek, Corea) estaban alojados en una habitación con temperatura controlada
a 22 grados centigrados bajo iluminación artificial con un ciclo de luz y oscuridad de
12 horas y una humedad relativa del 55%. A los ratones se les proporcionó acceso
a alimentos y agua ad libitum.
Preparación de ARN y análisis de reacción en cadena de transcripción inversa-
polimerasa (RT-PCR).
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El ARN total se aisló de cultivos

celulares confluentes utilizando
Trizol de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Para la síntesis de ADNc, la
transcripción inversa se realizó
utilizando Maxime RT PreMix. Y
PCR se realizó utilizando los
dados de ciclo térmico TP600 (Takara, Japón) con AccuPower PCR PreMix (K-
2016, Bioneer, Corea). El programa de amplificación consistió en 40 ciclos de los
siguientes: desnaturalización a 95oC durante 20 segundos, recocido a 57oC
durante 20 segundos y extensión a 72oC durante 70 segundos. Las imprimaciones
RT-PCR de oligonucleótidos para ColI, ALP, BSP, CEMP-1, PLAP-1 y
gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH).

Cultivo de hojas celulares.

Los ihDEL y erMs se cultivaron en platos de cultivo celular convencionales con el
medio mínimo de Eagle de Dulbecco con suero bovino 10% fetal y 1% solución de
penicilina/estreptomicina 2 Condiciones. Con una confluencia del 90% en los platos
convencionales, las células se separaron usando reactivo de trippsina y luego se
cosechaban y se extendían en platos sensibles a la temperatura a 50.000
celdas/cm2. Posteriormente, las celdas se cultivaron durante 2 días adicionales
para generar una hoja de celda intacta.
Cultivos HUVEC en hojas celulares.
Los HUVEC sin PFG fueron comprados a Angio-Proteomie y cultivados en medio
basal endotelial o medios de crecimiento endotelial siguiendo la instrucción del
distribuidor. El medio celular se cambiaba cada 2 días. Después de cosechar los
HUVEC utilizando trippsina, las células se extendieron sobre hojas de ihCER o
ihDDLa a 50.000 células/cm2 en EGM.
Inmunohistoquímica (IHC)
Los tejidos fueron extirpados y sumergidos en un 4% de paraformaldehído (PFA).
Después de la fijación, los tejidos fueron descalcificados en citrato de sodio al 10%
y 22,5% de ácido fórmico durante 6 semanas a 4oC. La tinción se realizó en
secciones incrustadas en parafina de 6 m. Después de la desfinación, las
diapositivas fueron incubadas con Proteinase K (10 g/ml, AM2546, Thermo
Scientific, EE. UU.) durante 20 minutos a 37oC o, para GFP, con pepsina (Digest-
All™ 00–3009, Invitrogen, USA) durante 10 minutos a 37oC. Posteriormente, los
portaobjetos fueron incubados con anticuerpos contra la periostina (1:1,000 diluido,
ab14041, Abcam plc, Reino Unido), fibrillin1 (1:500 diluido, ab53067, Abcam plc,
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UK), vWF (1:100 diluido, AB7356, EMD Millipore Co., EE.UU.), HLA (1:100 diluido,
ab70328, Abcam plc, Reino Unido), nestin (1:200 diluido, MAB353, Millipore co.
EE.UU.), panCK (1:50 diluido, MS-343-P0, Thermo Scientific, EE.UU.) o GFP (1:500
diluido, 2955 S, Tecnología de señalización celular, EE.UU.) Los especímenes
fueron incubados secuencialmente con anticuerpos secundarios y estreptavidina
peroxidasa.
Tinción de resorcina-fucin.
La tinción se realizó en secciones incrustadas en parafina de 6 m, que se describió
anteriormente. Después de enjuagarlos con tres
lavados de agua destilados, los portaobjetos se tiñieron
con solución de resorcina-fucin durante 10 minutos.
Después de enrestar con agua corriente, fueron
deshidratados y montados.
Trasplante del bioimplante
Los implantes se generaron a partir de titanio puro y se
afeitaron para producir hilos en el lado apical, con una
ranura para el conductor en la cabeza. El hilo de los
implantes tenía 1,42 mm de longitud y 1,00 mm de
diámetro. La hoja de celda se cortó al tamaño
adecuado. El implante HA se colocó en el centro de la
hoja de células cortadas verticalmente, y la hoja celular
se envolvió alrededor del implante HA levantado con
una aguja de tungsteno de punta redonda.
Bajo anestesia profunda, se preparó un orificio piloto
utilizando un motor portátil de baja velocidad con una punta de taladro de 0,75 mm
diseñada para estos implantes HA. Posteriormente, el bioimplante fue trasplantado
en el agujero usando un conductor.
Resultados.
Preparación de implantes, procedimiento de trasplante y características celulares
humanas inmortalizadas
Para implantar un accesorio en el hueso alveolar maxilar, el primer molar derecho
se extrajo de ratones desnudos BALB/c de 3 semanas de edad. Después de que el
hueso alveolar sanó, el accesorio fue envuelto con una hoja celular e implantado en
una región extraída de dientes de un ratón desnudo. Para investigar las funciones
de las combinaciones de hojas de celda, se utilizaron 10 ratones desnudos para
cada combinación. La Figura 1b ilustra cómo se utilizaron varios tipos de hojas de
celdas en cada caso.
Formación de tejido similar a un periodotio entre el accesorio del implante y el hueso
alveolar
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Para investigar si el trasplante de implantes dentales cubiertos por células podría

regenerarse in situ de tejido periodontal, se utilizaron ihDEL como componente de
la hoja celular. Para confirmar si este tejido conectivo recién formado era PDL, la
inmunohistoquímica se realizó utilizando los conocidos dos marcadores PDL,
periostina y fibrillina 1. Además, se observaron vasos sanguíneos comprometidos
en el tejido similar a la PDL recién formado, según
lo confirmado por la expresión positiva del factor von
Willebrand. De hecho, el tejido conectivo similar a la
PDL se originó a partir de células humanas. IHC de
GFP se realizó para comparar este trasplante de
láminas ihDEL de una sola capa con otras
combinaciones de hojas celulares, incluidos los
HUVEC con etiquetas GFP.
La contribución de los HUVEC y los ihCEMs a la
hoja de células de varias capas
Para regenerar el tejido periodontal, se incorporaron
HUVEC en la hoja celular. Los HUVEC se
sembraron en ambas hojas celulares con una
densidad de semillas de 50.000 HUVECs/cm2. Los HUVEC formaron una forma
circular de vasculatura en la hoja celular después de cultivar con el medio de
crecimiento endotelial durante 7 días. Estas hojas fueron denominadas 'ihCEM ' e
'ihPDL ' . Aunque los HUVEC se diferenciaron en la hoja ihPDL, el ihPDL se contrajo
después de que se desprendiera del plato de cultivo sensible a la temperatura .
Adición de EMAT en láminas celulares calcificación inducida
Para parecerse más a la composición celular presente
en el periodontium dental natural, las EER se
incorporaron en la hoja celular tricapa alrededor de los
implantes y posteriormente se trasplantaron. Para la
lámina de tres capas, se observó tejido calcificado en
forma de placa en la superficie del accesorio. Se formó
tejido conectivo entre este tejido calcificado y el hueso
alveolar. Las flechas de la Fig. 3c indican manchas rojas
en el tejido calcificado azul, lo que indica tejido
calcificado recién formado. La tinción resorcina-fuctina
mostró fibras oxitaínas en el tejido conectivo entre el
hueso alveolar y el tejido calcificado en forma de placa.
Para confirmar el resto de ERMs, se realizó IHC contra
la queratina. Se observaron células panpositivas de queratina en el tejido similar a
la PDL . También se realizó IHC contra la anidación para detectar la presencia de
tejido nervioso.).