UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Facultad de Ciencias -Escuela de Biología

Laboratorio Biología Celular (20064)
2020-I

Integrantes:
Anderson Alexander Carrillo Hernández 2190015
Lina Antares T. Echavarria Plata 2191044
Jenny Marcela Sarmiento Carvajal 2131034

TALLER 1. INSTRUMENTOS DE LA BIOLOGÍA CELULAR: MICROSCOPÍA

Cuestionario

1. Observe las siguientes fotografías. Corresponden a tres individuos diferentes de la misma especie
pero fotografiados con diferentes técnicas. En cada fotografía debe indicar si corresponde a MEB,
DIC o Contraste de fases.

Differential interference contrast Contraste de fases Microscopio electrónico de barrido

2. Complete las equivalencias en las unidades de longitud:

1 m = 1000 mm = 1000000 μm = 1000000000 nm = 1 x Å

1 mm = 1000 μm = 1000000 nm = 10000000 Å

1 μm = 1000 nm = 10000 Å

3. Con base en la anterior información complete el siguiente cuadro indicando el tipo de instrumento
que le permitiría observar las siguientes células o estructuras celulares.

Organismo Tamaño Unidad Instrumento

Bacterias 0.5-0.6 μm Microscopio

electrónico

Óvulo humano 150 μm Microscopio

electrónico,
microscopio óptico
Pared celular 15-20 nm microscopio
bacteriana electrónico

Micoplasma 0.2 μm microscopio

electrónico

Ameba gigante 100 μm microscopio

electrónico,
microscopio óptico

Membrana plasmática 8 nm microscopio

electrónico

Coronavirus 60-200 nm microscopio

electrónico

Mitocondria 0.5 μm microscopio

electrónico

4. Entre al siguiente enlace https://www1.udel.edu/biology/ketcham/microscope/scope.html, donde

podrá utilizar un microscopio óptico virtual. Describa paso a paso cómo se debe desarrollar una
correcta metodología en la utilización de un microscopio óptico.

Para la utilización de un microscopio óptico se deben seguir los siguientes pasos:

a. Asegurarse de que el microscopio se encuentre en una posición estable y cómoda para

trabajar.
b. Enchufar el cable del microscopio a un tomacorriente adecuado.
c. Encender el microscopio mediante el botón interruptor.
d. Encender la luz.
e. Ajustar la intensidad de la luz hasta 10 mediante el reóstato. Cualquier ajuste adicional debe
hacerse con la palanca del diafragma del iris.
f. Abrir la pinza que mantiene fijo el portaobjetos y encajar el portaobjetos en la esquina del
soporte del portaobjetos o platina (previa preparación de la muestra en dicha lámina). Una
vez hecho esto, soltar la pinza.
g. Ajustar el lente objetivo en 4x: para ello hay que girar el revólver hasta conseguir que el
objetivo 4x se encuentre en la posición trasera, la cual es la que necesitamos pues está en el
camino de la luz.
h. Mover el espécimen para que esté en el camino de la luz: para esto se debe reposicionar el
soporte del portaobjetos o platina mediante las perillas de ajuste de la platina, moviéndola
hacia adelante o hacia atrás con una de estas perillas y de lado a lado con la otra hasta que
el espécimen esté centrado sobre el círculo de luz.
i. Ajustar el enfoque: se debe mover la platina tan alto como sea posible, esto se logra
moviendo el tornillo macrométrico.
j. Ajustar oculares: se debe asegurar que el campo de visión no esté doble, sino que los dos
círculos se fusionen en uno.
k. Ajustar el enfoque nuevamente: en este paso se debe mover el tornillo macrométrico tan
lentamente como sea posible hasta que la imagen aparezca y asegurándose de tener el
objetivo 4x en posición (pues siempre se debe comenzar con el lente de menor poder). Si la
imagen no aparece después de varios intentos, se debe comprobar que la muestra esté en el
camino de la luz.
 l. Lograr nitidez en la imagen: mover el tornillo micrométrico para mejorar la claridad de la
imagen; mover las perillas de ajuste de la platina con el fin de centrar la imagen y manipular
el diafragma del iris para ajustar el brillo de la misma.
m. Una vez que se tenga la imagen bien enfocada con el lente de menor poder, se podrá pasar
a los siguientes lentes objetivos de mayor poder. Para ello primero se debe posicionar el área
de interés de la muestra en el centro del círculo de luz. También tener en cuenta que se debe
pasar de un objetivo a otro en orden (4x, 10x, 40x y finalmente 100x) ya que a menudo será
necesario reajustar tanto el tornillo micrométrico como el diafragma del iris después de
cambiar los objetivos.

5. Para qué sirve el diafragma en un microscopio de luz?

Es la parte del microscopio que contiene y controla el sistema de iluminación de este. Regula el
tamaño de apertura de la luz que llega a la muestra. Es importante ya que tanto la intensidad como el
tamaño del cono de luz que llegan a la muestra, determinan la resolución.

6. Complete la siguiente tabla teniendo en cuenta el poder de resolución en un microscopio óptico

Resolución (μm) Longitud de onda Índice de refracción Ángulo α

del medio

1.17 0.5 1,007 15°

0,71 0.4 1.0 20°

0.35 0.5 1,21 45.6°

0,28 0.6 1.33 72°

0.31 0,70 1.4 80°

0,20 0.5 1.5 90°

7. Qué aspectos se deben tener en cuenta para obtener una correcta visualización de un m ontaje en
un microscopio óptico?

Existen varios aspectos que se deben considerar antes y durante una visualización en un
microscopio óptico referente tanto a la correcta manipulación del microscopio como a la preparación
de la muestra a observar. Además de la metodología señalada en el punto 4, se debe tener en
cuenta:
-verificar que todas las partes mecánicas y ópticas del microscopio estén en una posición correcta,
por ejemplo que el revólver portaobjetivos esté bien enroscado y centrado.

-Verificar la limpieza de todo el sistema óptico. Nunca tocar, rayar, dañar, o dejar caer las lentes u
otros componentes ópticos. La limpieza se debe hacer con un material adecuado. Si se utilizó un
medio de inmersión se debe limpiar la lente objetivo posteriormente.

-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este
paso es muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de una
panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior.
-Para pasar al siguiente nivel de aumento se debe haber enfocado bien el anterior, posteriormente
determinar cuál es la estructura que se va a observar a mayor aumento y colocarla en el centro del
campo.
- Al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando única y lentamente
el tornillo micrométrico. Nunca se debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor
aumento, pues al estar éstos muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo.

-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento se debe realizar la observación moviendo
constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abrir o
cerrar el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste.

-El portaobjetos y cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que estén bien colocados y que no
haya dos de cada uno superpuestos.

-Cuando se utiliza aceite de inmersión comprobar que sea la cantidad exacta y que no hayan
burbujas ni impurezas.

-La intensidad lumínica no debe ser débil ni excesiva.

En cuanto a la preparación de la muestra, se debe tener en cuenta que ésta puede resultar un
proceso simple o complejo dependiendo de la naturaleza de aquello que se quiere observar. La
muestra puede ser orgánica o inorgánica y en este último caso se puede desear observar
propiedades que solo se manifiestan en estado vivo, o por lo contrario morfología y estructuras que
no se modifican cuando sobreviene la muerte celular. En este sentido se pueden realizar múltiples
tipos de preparaciones:

-estudio ”In vivo”: aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten las células. Por ejemplo
preparaciones húmedas, gota pendiente, examen en fresco con nigrosina, coloración vital, etc.
-estudio ”in vitro”: consiste en la observación de células y tejidos muertos. Por ejemplo fijación,
inclusión, corte y tinción.

8. Dé ejemplos de estructuras biológicas que pueden observarse mediante el microscopio de luz

polarizada.

Se usa para identificar sustancias cristalinas como minerales; sustancias amiloides (proteína anormal
que se deposita en cualquier tejido u órgano); sustancias fibrosas como el citoesqueleto; también
permite observar compuestos como el sílice, colágeno, queratina, polen, entre otros.

9. Investigue cómo se realizan mediciones de diámetro o longitud en microscopios ópticos.

Se puede hacer esta medición, utilizando una hoja milimetrada o una regla, ubicándola sobre la
platina, se enfoca y ubica de tal manera que se pueda observar desde dónde hasta dónde va
exactamente. También se puede ayudar haciendo uso del portaobjetos que está marcado con
milímetros. Al hacer la medición se debe tener en cuenta tanto el campo visible como la magnitud
con la que se está observando ya que varía entre cada una, por ejemplo, el c ampo visible a 40X
puede ser de aproximadamente 4,5 mm, mientras que con un objetivo de 400x será de 0.45mm,
reduciendo el campo de vista hasta un décimo.
Otra posibilidad es utilizar oculares de medición con retículos (retículo ocular micrométrico) en
combinación con micrómetros especializados, patrones calibrados, cámaras de conteo y el vernier.

10. Investigue en qué consiste la técnica de microscopía de fluorescencia.

Rta: La fluorescencia es un proceso en el que interactúa un material absorbiendo radiación y
emitiendo luz de menor energía que la que absorbe, rápidamente. El microscopio de fluorescencia
trabaja de esta manera y se usa para detectar sustancias con fluorocromos o sustancias
autofluorescentes como la Vitamina A. Es necesario el uso de diversos tipos de filtros que permitirán
observar únicamente las zonas iluminadas de la muestra por su espectro visible.

11. Complete la siguiente tabla comparativa entre un microscopio óptico y electrónico

Microscopio óptico Microscopio electrónico

Lentes Cristales de vidrio y cuarzo. Lentes electromagnéticas.

Iluminación Utiliza luz visible. Emplea electrones en lugar de

fotones para iluminar el objeto
a observar.

Resolución Está limitada por la longitud de Su límite de resolución es de

onda de luz visible aproximadamente 0.002 µm.
(aproximadamente 0.4-0.8
micras), lo que no permite ver
detalles más pequeños que la
magnitud de longitud de onda
de luz visible. Su límite de
resolución es cerca de 0.2 µm.

Magnificación 1000-1500 aumentos 2000-300000 aumentos.

Fijación Sí se realiza diferentes tipos de Sí se realiza diferentes tipos de

fijación, dependiendo de la fijación, dependiendo de la
muestra que se esté muestra que se esté
trabajando. trabajando.

Inclusión En mayor medida se usa Se realiza con resinas.

parafina.

Estado muestra Puede haber muestras vivas o Muestras muertas.

muertas, depende de si se
recurre a tención de las
células.

Ejemplo imagen Las imágenes son a color. Las imágenes no tienen color.

Hongo Aspergillus.
Amiloplasto de célula vegetal.

12. Entre los siguientes enlaces y compare desde su punto de vista las visualizaciones entre los
diferentes tipos de microscopía en una tabla (elija estructuras biológicas para su visualización).

Electronica de barrido:
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/ja va/electronmicroscopy/magnify1/index.html
Campo brillante:
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/magnifying/index.html
Contraste de fase:
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/phasecontrast/phas emicroscope/index.html

Luz polarizada: https://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/polarizedlight/rotation/index.html

Contraste-interferencia diferencial:
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/dic/index.html

Fluorescencia:
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/ fluorescence/index.html

Tipo de Imagen Punto de vista

microscopia
Electrónica de Es un microscopio
barrido que tiene una
ventaja crucial
frente a los otros:
permite apreciar
las texturas de las
muestras que se
están estudiando y
ofrece una imagen
en 3D. Aun así
posee una
desventaja frente
a otros, ya que
solo permite la
observación de
organismos sin
vida y solo otorga
imagen en blanco
y negro.
Campo Es un microscopio
brillante bastante práctico,
con el cual se
pueden estudiar
distintos
organismos
biológicos y
procesos de la
célula. Pero la
desventaja que
tiene es que a
veces es
necesario recurrir
a la tinción del
material biológico
para poder facilitar
el contraste y esto
puede llegar a
generar la muerte
de las células.
Microscopía Este tipo de
de contraste microscopía
de fase resulta bastante
provechoso para
estudiar las
células vivas, ya
que no es
necesario recurrir
a la tinción, pero
es necesario que
no sean células
individuales o en
cantidades muy
reducidas.

Luz polarizada Este tipo de

microscopia
permite analizar
diferentes tipos de
montajes,
incluyendo desde
tejidos vivos, hasta
minerales. La
imagen generada
por este tipo de
microscopio, en el
momento, puede
llegar a ser
complicada de
entender, debido a
que no hemos
tenido contacto
con este tipo de
microscopia.
Contraste- Es bastante
interferencia interesante la
diferencial: imagen que otorga
este tipo de
microscopia, da
una visión 3D del
organismo y
permite ver con
claridad la
estructura de éste.
Además de que
permite analizar
muestras
transparentes sin
la necesidad de
realizar tinción.
Fluorescencia Es interesante ver
como distintas
muestras
biológicas tienen
la capacidad de
absorber y emitir
fotones de varias
magnitudes de
ondas luz,
generando así una
imagen de
acuerdo a la
sensibilidad del
material estudiado.

13. Realice un cuadro comparativo entre las características de un microscopio electrónico de

transferencia y barrido.

Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)

La imagen se obtiene a partir de los electrones La imagen se obtiene a partir de radiaciones

que atraviesan la muestra. (electrones secundarios, electrones
retrodispersados, rayos X) que son producidas
por la colisión entre el haz de electrones y la
muestra y que no la atraviesan sino que chocan
y rebotan.

Se utiliza en preparaciones de muestras muy Se utiliza en muestras gruesas, no es necesario

delgadas (inferiores a 2000 Å), de lo contrario hacer cortes.
demasiado espesor impide que los electrones
puedan atravesarla.

Es útil para visualizar detalles internos de una Es útil para observar superficies tisulares, ya
muestra, por ejemplo estructuras muy pequeñas que produce imágenes tridimensionales
como la ultraestructura de células, organelos y realistas de la superficie del objeto, haciendo
virus. posible observar características morfológicas.

Mayor poder de resolución (0,2 nm o 2 Å) en Menor poder de resolución (3 - 5 nm o 30 - 50

comparación con el SEM. Å) en comparación con el TEM.

Examina una gran parte de la muestra cada vez. Explora la superficie de la imagen punto por
punto.

Mediante difracción de electrones es posible Una imagen originada por los electrones
determinar las propiedades de estructuras retrodispersados revela diferencias en la
cristalinas. composición química por diferencias de
contraste.

La imagen final se proyecta sobre una pantalla La imagen final se proyecta sobre una pantalla
fluorescente o una película fotográfica. de televisión.
Mayor capacidad de magnificación que en el Menor capacidad de magnificación que en el
SEM. TEM.

14. Investigue cuál es el procedimiento de preparación de las muestras para ser observadas en un
microscopio electrónico de barrido.

Dependiendo de la naturaleza de cada muestra se preparará (fijación, deshidratación y montaje)

conforme a sus características.

En especímenes muy pequeños como bacterias, esporas y protozoos, deben ser adheridos a
sustratos. Un método común para esto es filtrar usando filtros con una superficie uniforme (filtros de
policarbonato). En especímenes pequeños como algunos invertebrados, se procesa la muestra en
contenedores porosos como el papel de arroz y en especímenes más grandes se hace uso de
contenedores de vidrio.

Para la fijación de la muestra, se debe usar un fijador con un pH que se ajuste a cada espécimen y
realizar lavados con un amortiguador de fosfatos. La deshidratación generalmente se hace con etanol
y agua destilada; para muestras húmedas se debe realizar un secado. Los tiempos para cada paso
dependen del tipo de muestra, generalmente se tarda de 5-10 minutos en cada uno.

Para el montaje debe colocarse la muestra de tal modo que se observe la zona de interés; no debe
manipularse mucho ya que se puede dañar o quedar con restos del adhesivo que cubran sus
estructuras superficiales.

Además se necesita hacer que la muestra sea conductora de los electrones y esto se puede lograr
de dos formas: con una aparato que deposita una fina capa de carbón o con otro que deposita una
fina capa de oro sobre la muestra.

15. Nombre 10 posibles causas por las cuales se observa una mala imagen (borrosa, estructuras
indistinguibles, entre otras) en un microscopio óptico de campo luminoso.

- Mala preparación de la muestra.

- Organismos tan pequeños que no es posible observarlos detalladamente mediante
microscopio óptico.
- Mala regulación de luminosidad.
- Daños en la muestra u organismo/estructura a observar por el uso de reactivos o colorantes,
como por ejemplo el fotodaño provocado con el mal uso de fluorescentes).
- Limpieza inadecuada o no limpieza de los materiales (como por ejemplo el ocular).
- Deshidratación del preparado de muestra, al no hacerse este proceso de forma gradual (de
menor a mayor agente deshidratante).
- Graduación incorrecta al enfocar.
- Microscopio incorrecto, ya que dependiendo de lo que se vaya a observar se usa uno dist into
porque no todos los microscopios tienen el mismo alcance ni la misma capacidad de
resolución o funciones.
- Imagen descentrada o ubicación incorrecta de la muestra.
- Objetivo incorrecto, ya que el microscopio cuenta con distintos rangos de aumento y puede
que el que elijamos no sea el mejor para la muestra a observar.