TEMA 2.

CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO DE CULTIVO.

Los productos de composición mal definida tienen el inconveniente de que no se conoce su

formulación exacta. A lo mejor el elemento que me da el proceso clave está en una
concentración en el doble o la mitad.

Se tiende a utilizar compuestos perfectamente identificados.

Los dos últimos componentes van a modificar las condiciones físicas de cultivo. El carbón
activo en principio no aporta ningún nutriente si no que lo que aporta al medio es que lo va a
oscurecer. En principio no le aporta nutrientes. Se utiliza en determinados procesos.

El agente gelificante aporta la consistencia al medio que estemos diseñando.

ELEMENTOS MINERALES.

Siempre tienen que estar presentes en el medio de cultivo. Son los 14 elementos minerales
esenciales indispensables para el crecimiento y el desarrollo de las células y los ejidos
vegetales.

Hay elementos minerales que pueden estar muy abundantes en el suelo, pero la planta no
pueden absorberlo, como el Fe 3+. Lo pueden asimilar como Fe 2+.

La forma en la que la planta absorbe nitrógeno del suelo es en forma de ion nitrato, pero no en
forma de ion sino en forma de sal de nitrato. Dependiendo de cuál es el catión que acompaña
el nitrato el efecto será negativo o positivo. Hay que decidir en qué forma iónica, con que
catión acompañante va y en que cantidad.

En la tabla la parte A representa la forma salina en la que se añade el elemento y la cantidad

en mg/L y en la parte B lo que nos pone es la concentración del catión o del anión en mM.

El medio de Murasai Skoog en lugar de aportar el nitrógeno como nitrato, potásico o cálcico,
este medio aporta el nitrógeno en forma de nitrato, pero con una pequeña diferencia que es
que la mayor parte de ese nitrato va como nitrato potásico, pero en una concentración de
1900 mg/L. le pone como catión acompañante amonio, pero el amonio le aporta al medio es
más nitrógeno y encima en forma reducida como lo introduce el amonio. El nitrato que entra
es reducido posteriormente a nitrito y después a amonio.

El sulfato de magnesio apenas es modificado. Murasai Skoog revierten la concentración de

calcio y potasio. La concentración que se requiere de calcio no es muy grande y este medio las
diferencias que tiene con los anteriores es esa. De calcio lo aporta como cloruro cálcico mucho.
De potasio tiene 20 mM y de calcio tiene 3mM. La relación potasio calcio es muy favorable al
potasio. Es un medio salino muy rico. El medio es tan rico que da problemas porque hay pantas
que requieren un medio salino más pobre por lo que a partir de este medio lo que ha ido
sucediendo es que se va disminuyendo la cantidad de nitrógeno total. La relación potasio
calcio se sigue manteniendo muy favorable al potasio.

Con los microelementos hay que hacer dos grupos.

- Aporte de hierro. Se utiliza una única formulación diseñada por Murasai Skoog que son
27,85 mg/L de FeSO4 hidratado y 37,25 de quelato de sodio. El medio más usado aquí
es el de Murasai Skoog.
Si cultivamos una planta de cultivo en vitro nos salen las soluciones minerales pero si vamos al
campo y queremos cultivar una planta que nadie había cultivado anteriormente lo que se le
añade de medio generalmente es una primera aproximación utilizando como solución mineral
el medio de Murasai Skoog y lo comparamos con ese mismo medio diluido un tercio y diluido a
la mitad para ver si mi panta crece igual en el medio que esta más rico o en el que está diluido
a la mitad para ver donde crece mejor.

Puede ser que tu planta tenga unos requerimientos nutricionales que tenas que diseñar un
medio como por ejemplo para el cultivo de la vid. Esta requiere mucho nitrógeno, menor
cantidad de magnesio y azufre que otras pantas y por tanto se adapto para la vid modificando
ligeramente el medio de Murasai Skoog. El potasio del medio de Murasai Skoog es el que
requiere la vid por lo que de ese nutriente no queremos que haya más concentración.

COMPUESTOS ORGÁNICOS.

Fuente de carbono.

En un cultivo in vitro no tenemos plantas completas, además para que se produzca la

fotosíntesis es necesario tener hojas, que haya luz y unas diferencias de presiones de vapor
entre la cámara subestomática y la atmosfera. En los cultivos in vitro puedo tener tejidos que
no sean fotosintéticos como raíces, podemos concentrarnos que no haya luz. Además,
suponiendo que haya luz y que haya estomas estos si que son funcionales porque en el interior
del recipiente de cultivo. En las condiciones de cultivo in vitro los niveles de fotosíntesis o no
hay o son muy bajos por lo que no aportan la energía necesaria y ni los compuestos de
carbono necesario por lo que le tengo que añadir al medio este carbono. La principal forma
que utilizan las plantas es sacarosa que es la mayoritaria. La concentración normal está entre
el 1 y el 3 % de medio, pero hay excepciones como procesos de morfogénesis como la
embriogénesis en los estadios iniciales que requieren hasta el 14 % de sacarosa.

Funciones que realizan los hidratos de carbono.

- Aporte de carbono y energía.

- Función osmótica. Se pensó que los hidratos de carbono estaban siendo utilizados
para otra cosa y se sustituyó parte del carbono por el sorbitol. Lo que se obtuvo fue
que había una determinada cantidad de sorbitol que cuando sustituía a la m isma
cantidad de sacarosa los tejidos seguían prácticamente igual. Esto quiere decir que al
menos hay 5 g de sacarosa que no están siendo utilizados con fines de aporte de
energía. Determinados procesos requieren un determinado potencial osmótico.
- Sistemas de señalización. Sirven de sensor celular. La célula debe de saber el estado
fisiológico en el que se encuentra. Dependiendo de la cantidad de sacarosa la célula
tiene que adaptarse, sintetizar algunas hormonas, bloquear otras…

Vitaminas.

No se ha demostrado que estas vitaminas sean necesarias para el proceso de morfogénesis,

pero si se ha demostrado que en presencia de vitaminas favorece la morfogénesis.

La tiamina estimula el crecimiento, la biotina favorece la acción de las auxinas, el pantofenato

calcico es estimulante de la CoA.
Normalmente se utiliza lo que se llama un coctel de vitaminas. Una de las más utilizadas de los
cocteles es la tiamina, piridoxina y acido nicotínico. En unas cantidades que oscilan entre 0,01 y
1 mg/L. de la tiamina es de la que más se pone y del resto menos cantidad.

Hay determinados procesos de morfogénesis, en el caso del olivo, que se ven favorecidos si al
coctel anterior de vitaminas se le aporta el ácido fólico.

Tenemos que impedir que la planta se oxide, para eso lo que utilizamos es inositol de forma
rutinaria.

Aminoácidos.

Además de las vitaminas hay otro grupo de compuestos que también se añaden aminoácidos
tales como glutámico, glutamina, asparagina o triptófano. En todos los casos se añaden en
grandes cantidades y solo uno de estos aminoácidos ya que la adición de más de uno de estos
puede ser tóxica para la planta.

Hormonas vegetales.

Controlan todos los procesos del ciclo de las pantas. Cuando la panta se hidrata ya hay una
hormona que es capaz de empezar a llevar a cabo todos los procesos que conlleven a la
germinación. Luego tiene que crecer y formarse el sistema radicular, el aéreo, el proceso de
transición floral, el proceso de maduración y formación del fruto, la senescencia y abscisión del
fruto, el desarrollo del embrión en el fruto y el proceso de desecación. Estos grandes grupos de
procesos de desarrollo vegetativo de todas las partes de las pantas son auxinas, citoquininas,
giberelinas, brasinoesteroides y estrigolactonas.

Sea cual sea la hormona el sistema de actuación es el mismo, un proceso de síntesis de esta
hormona que puede ser catalizada, conjugada para dar a otro compuesto o transportada a la
diana de la planta y cuando llega aquí primero tiene que ser percibida y cuando lo es la
respuesta que va a dar la célula está relacionada a factores de transcripción. Estos son los que
activarán o inactivarán los genes diana de las hormonas que es lo que va a dar la respuesta a
esta hormona. La actuación de la hormona sobre los factores de transcripción puede ser dos
vías. Desde que llega la hormona hasta que se da la respuesta. esto implica en algunos casos
procesos de fosforilación y en otros casos procesos de proteólisis. El caso de actuación de la
proteólisis es dependiendo de giberelina, auxina y citoquinina y cada una de ellos actúan sobre
un tipo de factor de transcripción. En cualquier caso, las tres hormonas comparten la misma
vía. Si no está en ausencia de la auxina, se forma el complejo IAA, que es una proteína que se
une al factor de transcripción y se inactiva, en presencia de auxina cuando esta se une al
receptor este complejo señaliza para que loa proteína que se une a la auxina en lugar de unirse
al factor de transcripción se dirige a la proteasoma y se destruye y el factor de transcripción
puede unirse a su diana.

AUXINAS.

El proceso de elongación esta controlado por las auxinas y después se tiene que formar la
pared celular, proceso controlado también por las auxinas.

Las auxinas tienen una estructura cíclica y una cadena lateral. El nombre de la auxina es el
ácido 3-indol acético. Es la natural y es la menos activa de todas.

Ácido 3-indol butírico. La cadena lateral tiene dos carbonos más. El ácido naftalen acético es
exactamente igual a la primera que es que en el segundo anillo en lugar de haber 5 C hay 6.
Otro compuesto sintético el más potente de todos, no tiene segundo anillo y tiene una cadena
lateral con grupo ácido, es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético. Hay un compuesto que no tiene
nada que ver que es el Picloram que tiene actividad auxínica porque tiene anillo y luego tiene
grupo ácido. Hay que aprenderse el nombre y las siglas de la auxina.

La auxina promueve la ramificación de las raíces, mantiene la dominancia del meristemo

radicular, la dominancia apical, lo que lleva a inhibir la ramificación.

CITOQUININAS.

La zeatina es natural, la 2-isopeniladenina, la quinetina es la 6-furfurilaminopurina, hay

compuestos análogos que son el tidiazurón y el mata-topolín.

CHARCOAL.

Cuando añadimos esto el medio se pone negro, cambia la coloración del medio y esto es
importante. La cantidad que se añade puede ir de 5 a 50 g/l de charcoal. Este compuesto
forma una estructura tridimensional que deja pasar nutrientes, pero oscurece el medio. La
cutícula hace que la hoja no pierda agua. Os podemos encontrar que empezamos a formar
tallos.

MEDIOS LÍQUIDOS.

Aportan un mayor crecimiento, y crecen mejor, porque tienen libre acceso al agua y a los
nutrientes. Tiene un inconveniente que es la manipulación porque necesitamos un sistema
que nos permita sujetar el tejido vegetal.

Lo que se hace normalmente es utilizar medios sólidos a los que se les añade un agente
gelificante que en principio solo aporta la gelificación, permitiendo la difusión del agua y de los
nutrientes. Hay diferentes agentes gelificantes, como el agar, es el más barato, no aporta
nutrientes, pero algo si disminuye la aireación. Además del agar otro compuesto es el gelrite,
se obtiene a través de bacterias y tiene mejor retención iónica que el agar. En principio se
utilizan como agentes gelificantes, pero estos compuestos también los pueden utilizar las
plantas.

FACTORES FÍSICOS.

Dependiendo de los factores ambientales las plantas están en una situación u otra y esto
tendremos que tenerlo en cuenta para el cultivo in vitro. Los tres principales factores físicos
son:

- Luz. Podemos estar en casos extremos en los que tenemos que poner mayor
intensidad luminosa y por tanto inducimos la fotosíntesis. El rojo largo inhibe el
fitocromo y entonces si pones una cantidad alta del tipo largo, el fitocromo se inactiva
y no se produce el proceso de morfogénesis. Ahora se está viendo que las luces
fluorescentes potencian os procesos.
- Temperatura. Aquí hay menos variación, la temperatura oscila entre los 22 y 27
grados. Si nos vamos a una planta de clima frio habrá que bajar. Aquí lo general es que
la temperatura sea constante a lo largo del día. Pero si le damos un termoperiodo
crecen mejor. El fotoperiodo con termoperiodo funciona muy bien.
- Humedad relativa. Cantidad de vapor de agua que va a haber en la atmosfera de
cultivo. En un recipiente cerrado es saturante, del 100 por cien. Hay que controlar la
humedad relativa desde el tubo de cultivo hasta el invernadero.