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Imagen generada por ordenador de un modelo de la estructura tridimensional de la

enzima purina nucle�sido fosforilasa bacteriana.
Para otros usos de este t�rmino, v�ase Cin�tica.
La cin�tica enzim�tica estudia la velocidad de las reacciones qu�micas que son
catalizadas por las enzimas. El estudio de la cin�tica y de la din�mica qu�mica de
una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catal�tico, su papel en el
metabolismo, c�mo es controlada su actividad en la c�lula y c�mo puede ser inhibida
su actividad por f�rmacos o venenos o potenciada por otro tipo de mol�culas.

Las enzimas, en su mayor�a, son prote�nas con la capacidad de manipular otras

mol�culas sin ser alterados por la reacci�n,1? esas mol�culas son denominadas
sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al sitio activo de la enzima que lo
reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos
denominados mecanismo enzim�tico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos
diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al
romper una prote�na en dos polip�ptidos. En otros casos, se produce la uni�n
simult�nea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de
incorporar un nucle�tido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos
estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambi�n suelen
presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacci�n.
Esta etapa limitante puede consistir en una reacci�n qu�mica o en un cambio
conformacional de la enzima o del sustrato.

El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran

ayuda en la visualizaci�n e interpretaci�n de los datos cin�ticos. Por ejemplo, la
estructura puede sugerir c�mo permanecen unidos sustrato y producto durante la
cat�lisis, qu� cambios conformacionales ocurren durante la reacci�n, o incluso el
papel en particular de determinados residuos amino�cidos en el mecanismo
catal�tico. Algunas enzimas modifican su conformaci�n significativamente durante la
reacci�n, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la
enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar an�logos que se unen pero no
permiten llevar a cabo la reacci�n y mantienen a la enzima permanentemente en la
conformaci�n de sustrato unido).

Los mecanismos enzim�ticos pueden ser divididos en mecanismo de �nico sustrato o

mecanismo de m�ltiples sustratos. Los estudios cin�ticos llevados a cabo en enzimas
que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la
afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en
producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la
dihidrofolato reductasa, la cin�tica enzim�tica puede mostrar tambi�n el orden en
el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados.

Sin embargo, no todas las cat�lisis biol�gicas son llevadas a cabo por enzimas
proteicas. Existen mol�culas catal�ticas basadas en el ARN, como las ribozimas y
los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traducci�n del ARNm,
respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica
en el limitado n�mero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque
sus mecanismos de reacci�n y sus cin�ticas pueden ser estudiadas y clasificadas por
los mismos m�todos.
�ndice
1 Principios generales
2 Ensayos enzim�ticos
2.1 Factores f�sico-qu�micos que pueden modificar la actividad enzim�tica
3 Reacciones con un sustrato
3.1 Cin�tica de Michaelis-Menten
3.2 Representaci�n de la ecuaci�n de Michaelis-Menten
3.3 Significado de las constantes cin�ticas
4 Reacciones multisustrato
4.1 Mecanismo de complejo ternario
4.2 Mecanismo de ping-pong
5 Cin�ticas no Michaelianas
6 Cin�tica del estado preestacionario
7 Mecanismo qu�mico
8 Inhibici�n enzim�tica
8.1 Inhibidores reversibles
8.2 Inhibidores irreversibles
9 Mecanismos de cat�lisis
10 Cat�lisis enzim�tica
11 V�ase tambi�n
12 Notas
13 Referencias
14 Para m�s informaci�n
15 Enlaces externos
Principios generales

La velocidad de la reacci�n va aumentando a medida que aumenta la concentraci�n de

sustrato hasta que la enzima se satura.
La reacci�n qu�mica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato
y genera la misma cantidad de producto que una reacci�n no catalizada. Al igual que
ocurre en otros tipos de cat�lisis, las enzimas no alteran en absoluto el
equilibrio de la reacci�n entre sustrato y producto.2? La eficiencia de la
reacci�n, hasta el momento en que todos los sitios posibles est�n ocupados. En ese
momento se habr� alcanzado el punto de saturaci�n de la enzima y, aunque se a�ada
m�s sustrato, no aumentar� m�s la eficiencia de la misma.

Ensayos enzim�ticos
Art�culo principal: Ensayo enzim�tico

Curva de progreso de una reacci�n enzim�tica. La pendiente representa, en el

per�odo inicial, la velocidad de la reacci�n. La zona de la meseta representa el
equilibrio de la reacci�n (no confundir con la saturaci�n).
Un ensayo enzim�tico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio,
mediante el cual se puede medir la velocidad de una reacci�n enzim�tica. Como las
enzimas no se consumen en la reacci�n que catalizan, los ensayos enzim�ticos suelen
medir los cambios experimentados bien en la concentraci�n de sustrato (que va
decreciendo), bien en la concentraci�n de producto (que va aumentando). Existen
diversos m�todos para realizar estas medidas. La espectrofotometr�a permite
detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto
(seg�n la concentraci�n de estos) y la radiometr�a implica incorporaci�n o
liberaci�n de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo.
Los ensayos espectrofotom�tricos son los m�s utilizados, ya que permiten medir la
velocidad de la reacci�n de forma continua. Por el contrario, los ensayos
radiom�tricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos
discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten
detectar niveles muy bajos de actividad enzim�tica.3? Tambi�n se puede utilizar la
espectrometr�a de masas para detectar la incorporaci�n o liberaci�n de is�topos
estables cuando el sustrato es convertido en producto. Actualmente existen m�todos
sencillos que se pueden emplear con alumnos de bachillerato como el propuesto por
Johnson R.J. y colaboradores,4? quienes emplean hidrolasas de serina y un sustrato
fluorog�nico. Este m�todo es r�pido, sensible y permite medir la cin�tica
enzim�tica, a trav�s de la generaci�n de fluoresce�na como producto.

Los ensayos enzim�ticos m�s sensibles utilizan l�seres dirigidos a trav�s de un

microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando
catalizan una reacci�n. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la
fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de cat�lisis o bien
unir mol�culas fluorescentes en lugares espec�ficos de la enzima, que permitan
detectar movimientos ocurridos durante la cat�lisis.5? Estos estudios est�n dando
una nueva visi�n de la cin�tica y la din�mica de las mol�culas individuales, en
oposici�n a los estudios de cin�tica enzim�tica tradicionales, en los que se
observa y se mide el comportamiento de una poblaci�n de millones de mol�culas de
enzima.

En la figura de la derecha se puede observar la t�pica evoluci�n de una curva

obtenida en un ensayo enzim�tico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en
producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacci�n, se va
agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se
genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacci�n), lo que se
manifiesta en forma de curva asint�tica en la gr�fica. Dependiendo de las
condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el per�odo inicial puede durar desde
milisegundos hasta horas. Los ensayos enzim�ticos suelen estar estandarizados para
que el per�odo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas
m�s f�cilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla r�pida de l�quidos
permiten llevar a cabo medidas cin�ticas de per�odos iniciales cuya duraci�n puede
llegar a ser inferior a un segundo.6? Este tipo de ensayos r�pidos son esenciales
para medidas de la cin�tica del estado estacionario, discutida m�s abajo.

La mayor�a de los estudios de cin�tica enzim�tica se centran en el per�odo inicial,

es decir, en la zona lineal de la reacci�n enzim�tica. Sin embargo, tambi�n es
posible medir toda la curva de la reacci�n y ajustar estos datos a una ecuaci�n no
lineal. Esta forma de medir las reacciones enzim�ticas es denominada an�lisis de la
curva de progreso.7? Esta aproximaci�n es muy �til como alternativa a las cin�ticas
r�pidas, cuando el per�odo inicial es demasiado r�pido para ser medido con
precisi�n.

Factores f�sico-qu�micos que pueden modificar la actividad enzim�tica

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada
su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas �ptimos pueden llegar a
variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente
la temperatura, una enzima ver� incrementada su actividad hasta el momento en que
comience la desnaturalizaci�n de la misma, que dar� lugar a una reducci�n
progresiva de dicha actividad.
pH: el rango de pH �ptimo tambi�n es muy variable entre diferentes enzimas. Si el
pH del medio se aleja del �ptimo de la enzima, esta ver� modificada su carga
el�ctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar� la estructura de los
amino�cidos y por tanto la actividad enzim�tica.
Concentraci�n salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la
concentraci�n de sales del medio es crucial para una �ptima actividad enzim�tica.
Una elevada concentraci�n o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la
actividad enzim�tica, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentraci�n de
iones para mantener su carga y su estructura.
Reacciones con un sustrato
Las enzimas que presentan un mecanismo de �nico sustrato incluyen isomerasas, tales
como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas
intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.8? Sin
embargo, existen ciertas reacciones enzim�ticas de �nico sustrato que no pertenecen
a esta categor�a de mecanismos, como es el caso de la reacci�n catalizada por la
catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una mol�cula de per�xido de
hidr�geno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar el producto
(agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda mol�cula de sustrato. Aunque
durante la reacci�n solo participa un sustrato, la existencia de un intermediario
enzim�tico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la categor�a
de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido m�s adelante.

Cin�tica de Michaelis-Menten
Art�culo principal: Cin�tica de Michaelis-Menten
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de
cat�lisis no muestra un comportamiento lineal en una gr�fica al aumentar la
concentraci�n de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacci�n se mide a una
determinada concentraci�n de sustrato (representado como {\displaystyle {\rm
{[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}}), la velocidad de la reacci�n (representado como
{\displaystyle V}V) aumenta linealmente con el aumento de la {\displaystyle {\rm
{[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}}, como se puede ver en la figura. Sin embargo,
cuando aumentamos la {\displaystyle {\rm {[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}}, la
enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad m�xima {\displaystyle V_{\rm
{max}}}V_{\rm max}, que no sobrepasar� en ning�n caso, independientemente de la
{\displaystyle {\rm {[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}}.

Mecanismo de uni�n de �nico sustrato para una reacci�n enzim�tica. k1, k-1 y k2 son
las constantes cin�ticas para cada una de las etapas de la reacci�n.
El modelo de cin�tica michaeliana para una reacci�n de �nico sustrato se puede ver
en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacci�n qu�mica
bimolecular entre la enzima {\displaystyle {\rm {E}}}{\displaystyle {\rm {E}}} y el
sustrato {\displaystyle {\rm {S}}}{\displaystyle {\rm {S}}}, form�ndose el complejo
enzima-sustrato {\displaystyle {\rm {ES}}}{\displaystyle {\rm {ES}}}. Aunque el
mecanismo enzim�tico para una reacci�n unimolecular {\displaystyle {\rm
{ES\longrightarrow E+P}}}{\displaystyle {\rm {ES\longrightarrow E+P}}} puede ser
bastante complejo, existe una etapa enzim�tica limitante que permite que el
mecanismo sea simplificado como una etapa cin�tica �nica cuya constante es
{\displaystyle k_{2}}{\displaystyle k_{2}}.

{\displaystyle {\begin{matrix}v=k_{2}[{\mbox{ES}}]\end{matrix}}}{\displaystyle
{\begin{matrix}v=k_{2}[{\mbox{ES}}]\end{matrix}}} (Ecuaci�n 1)
{\displaystyle k_{2}}{\displaystyle k_{2}} tambi�n llamado {\displaystyle k_{\rm
{cat}}}{\displaystyle k_{\rm {cat}}} o n�mero de recambio, hace referencia al
m�ximo n�mero de reacciones enzim�ticas catalizadas por segundo.

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante

entre la forma libre {\displaystyle {\rm {E}}}{\displaystyle {\rm {E}}} y el
complejo enzima-sustrato {\displaystyle {\rm {ES}}}{\displaystyle {\rm {ES}}}.
Aumentando la {\displaystyle {\rm {[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}} tambi�n
aumentamos la {\displaystyle {\rm {[ES]}}}{\displaystyle {\rm {[ES]}}} a expensas
de la {\displaystyle {\rm {[E]}}}{\displaystyle {\rm {[E]}}}, desplazando el
equilibrio de la reacci�n hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacci�n
depende de la {\displaystyle {\rm {[ES]}}}{\displaystyle {\rm {[ES]}}}, la
velocidad es sensible a peque�os cambios en la {\displaystyle {\rm {[S]}}}
{\displaystyle {\rm {[S]}}}. Sin embargo, a altas {\displaystyle {\rm {[S]}}}
{\displaystyle {\rm {[S]}}}, la enzima se satura y solo queda la forma unida al
sustrato {\displaystyle {\rm {ES}}}{\displaystyle {\rm {ES}}}. Bajo estas
condiciones, la velocidad de la reacci�n ({\displaystyle v\approx k_{2}\mathrm
{[E]_{tot}} =V_{\rm {max}}}{\displaystyle v\approx k_{2}\mathrm {[E]_{tot}} =V_{\rm
{max}}}) deja de ser sensible a peque�os cambios en la {\displaystyle {\rm {[S]}}}
{\displaystyle {\rm {[S]}}}. En este caso, la concentraci�n total de enzima
({\displaystyle {\rm {[E]_{tot}}}}{\displaystyle {\rm {[E]_{tot}}}}) es
aproximadamente igual a la concentraci�n del complejo {\displaystyle {\rm {ES}}}
{\displaystyle {\rm {ES}}}:

{\displaystyle [{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\

[{\mbox{E}}]+[{\mbox{ES}}]}{\displaystyle [{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}\ {\stackrel
{\mathrm {def} }{=}}\ [{\mbox{E}}]+[{\mbox{ES}}]}

Representaci�n gr�fica de la curva de saturaci�n de una enzima donde se puede

observar como evoluciona la relaci�n entre la concentraci�n de sustrato y la
velocidad de la reacci�n.
La ecuaci�n de Michaelis-Menten9? describe c�mo la velocidad de la reacci�n depende
del equilibrio entre la {\displaystyle {\rm {[S]}}}{\displaystyle {\rm {[S]}}} y la
constante {\displaystyle k_{2}}{\displaystyle k_{2}}. Leonor Michaelis y Maud
Menten demostraron que si {\displaystyle k_{2}}{\displaystyle k_{2}} es mucho menor
que {\displaystyle k_{1}}k_{1} (aproximaci�n del equilibrio) se puede deducir la
siguiente ecuaci�n:

{\displaystyle v={\frac {V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}{K_{\rm {m}}+[{\mbox{S}}]}}}

{\displaystyle v={\frac {V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}{K_{\rm {m}}+[{\mbox{S}}]}}}
(Ecuaci�n 2)
Esta famosa ecuaci�n es la base de la mayor�a de las cin�ticas enzim�ticas de
sustrato �nico.

La constante de Michaelis {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}} se

define como la concentraci�n donde la velocidad de la reacci�n enzim�tica es la
mitad de la {\displaystyle V_{\rm {max}}}V_{\rm max}. Esto puede verificarse
sustituyendo la concentraci�n de sustrato por dicha constante ({\displaystyle
\mathrm {[S]} =K_{\rm {m}}}{\displaystyle \mathrm {[S]} =K_{\rm {m}}}). Si la etapa
limitante de la velocidad de la reacci�n es lenta comparada con la disociaci�n de
sustrato ({\displaystyle k_{2}\lll k_{1}}{\displaystyle k_{2}\lll k_{1}}), la
constante de Michaelis {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}} ser�
aproximadamente la constante de disociaci�n del complejo {\displaystyle {\rm {ES}}}
{\displaystyle {\rm {ES}}}, aunque sea una situaci�n relativamente rara.

La situaci�n m�s com�n, donde {\displaystyle k_{2}>k_{1}}{\displaystyle

k_{2}>k_{1}}, es denominada cin�tica de Briggs-Haldane.10? La ecuaci�n de
Michaelis-Menten a�n se mantiene bajo estas condiciones m�s generales, como puede
derivarse de la aproximaci�n del estado estacionario. Durante el per�odo inicial,
la velocidad de la reacci�n es m�s o menos constante, indicando que la
{\displaystyle {\rm {[ES]}}}{\displaystyle {\rm {[ES]}}} tambi�n se mantendr�
constante:

{\displaystyle {\frac {\mathrm {d} }{\mathrm {d} t}}[{\mbox{ES}}]=k_{1}[{\mbox{E}}]

[{\mbox{S}}]-k_{2}[{\mbox{ES}}]-k_{-1}[{\mbox{ES}}]\approx 0}{\displaystyle {\frac
{\mathrm {d} }{\mathrm {d} t}}[{\mbox{ES}}]=k_{1}[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]-k_{2}
[{\mbox{ES}}]-k_{-1}[{\mbox{ES}}]\approx 0}
De esta forma, la concentraci�n de {\displaystyle {\rm {ES}}}{\displaystyle {\rm
{ES}}} viene dada por la siguiente expresi�n:

{\displaystyle [{\mbox{ES}}]\approx {\frac {[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}[{\mbox{S}}]}

{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}}{\displaystyle [{\mbox{ES}}]\approx {\frac
{[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}}
donde la constante de Michaelis {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm
{m}}} se define as�:

{\displaystyle K_{\rm {m}}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}

{k_{1}}}\approx {\frac {[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]}{[{\mbox{ES}}]}}}{\displaystyle
K_{\rm {m}}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx
{\frac {[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]}{[{\mbox{ES}}]}}}
Con lo cual, despu�s de operar todos los factores, obtenemos una f�rmula general
para la velocidad de la reacci�n que coincide con la ecuaci�n de Michaelis-Menten:

{\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}

[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}={\frac {V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}
{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}}{\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}
[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}={\frac {V_{\rm
{max}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}}
La constante de especificidad {\displaystyle k_{\rm {cat}}/K_{\rm {m}}}
{\displaystyle k_{\rm {cat}}/K_{\rm {m}}} mide la eficiencia con la que una enzima
convierte un sustrato en producto. Utilizando la definici�n de la constante de
Michaelis {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}}, la ecuaci�n de
Michaelis-Menten podr�a escribirse de la siguiente forma:

{\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}}{K_{\rm {m}}}}[{\mbox{E}}]

[{\mbox{S}}]}{\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}}{K_{\rm {m}}}}
[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]}
donde {\displaystyle {\rm {[E]}}}{\displaystyle {\rm {[E]}}} es la concentraci�n de
enzima libre. As�, la constante de especificidad se convierte en una constante
bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para
formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el
sustrato y la enzima se encuentran en una soluci�n, y ronda aproximadamente un
valor de 1010 M-1 s-1 a 25� C. Curiosamente, este m�ximo no depende del tama�o del
sustrato o de la enzima. La proporci�n de las constantes de especificidad para dos
sustratos es una comparaci�n cuantitativa de la eficiencia de la enzima para
convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuaci�n de Michaelis-
Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando {\displaystyle \mathrm {[S]} \ll
K_{\rm {m}}}{\displaystyle \mathrm {[S]} \ll K_{\rm {m}}}) tambi�n proporciona la
constante de especificidad.

Representaci�n de la ecuaci�n de Michaelis-Menten

Art�culo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke
Art�culo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee

La gr�fica de Lineweaver-Burke o del doble rec�proco muestra el significado de los

puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la
velocidad.
La gr�fica de velocidad frente a {\displaystyle {\rm {[S]}}}{\displaystyle {\rm
{[S]}}} mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de
sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentraci�n
de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar
regresiones no lineales de forma sencilla, pod�a llegar a ser realmente dif�cil
estimar los valores de la {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}} y
la {\displaystyle V_{\rm {max}}}V_{\rm max} en las gr�ficas no lineales. Esto dio
lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar
linearizaciones de la ecuaci�n de Michaelis-Menten, dando como resultado la gr�fica
de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la
cin�tica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia a, se puede
simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cin�ticas.

La gr�fica de Lineweaver-Burk o representaci�n de doble rec�proco es la forma m�s

com�n de mostrar los datos cin�ticos. Para ello, se toman los valores inversos a
ambos lados de la ecuaci�n de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura
de la derecha, el resultado de este tipo de representaci�n es una l�nea recta cuya
ecuaci�n es {\displaystyle y=mx+b}{\displaystyle y=mx+b}, siendo el punto de corte
entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a {\displaystyle 1/V_{\rm {max}}}
{\displaystyle 1/V_{\rm {max}}}, y el punto de corte entre la recta y el eje de
abscisas equivalente a {\displaystyle -1/K_{\rm {m}}}{\displaystyle -1/K_{\rm
{m}}}.

{\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{\rm {m}}}{V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}}+

{\frac {1}{V_{\rm {max}}}}}{\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{\rm {m}}}
{V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\rm {max}}}}}

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para {\displaystyle 1/\mathrm

{[S]} }{\displaystyle 1/\mathrm {[S]} }; el m�nimo valor posible es {\displaystyle
1/\mathrm {[S]} =0}{\displaystyle 1/\mathrm {[S]} =0}, que corresponder�a a una
concentraci�n infinita de sustrato, donde {\displaystyle 1/v=1/V_{\rm {max}}}
{\displaystyle 1/v=1/V_{\rm {max}}}. El valor del punto de corte entre la recta y
el eje x es una extrapolaci�n de datos experimentales obtenidos en laboratorio.
Generalmente, las gr�ficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas
a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy
exactas de la {\displaystyle V_{\rm {max}}}V_{\rm max} y de la {\displaystyle
K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}}.11? Un modelo lineal mucho m�s exacto es el
diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones cient�ficas actuales, todo
este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por
m�todos m�s fiables basados en an�lisis de regresi�n no lineal. Para analizar los
datos es conveniente la normalizaci�n de los mismos, ya que esto puede ayudar
disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la
fiabilidad del an�lisis.12?

Significado de las constantes cin�ticas

La importancia del estudio de la cin�tica enzim�tica reside en dos principios
b�sicos. En primer lugar, permite explicar c�mo funciona una enzima, y en segundo
lugar, permite predecir c�mo se comportar� esa enzima in vivo. Las constantes
cin�ticas definidas anteriormente, {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm
{m}}} y {\displaystyle V_{\rm {max}}}V_{\rm max}, son los pilares fundamentales a
la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del
metabolismo. As�, {\displaystyle V_{\rm {max}}}V_{\rm max} se define como la
velocidad m�xima de una reacci�n con una concentraci�n de enzima determinada
({\displaystyle V_{\rm {max}}=E_{0}k_{2}}{\displaystyle V_{\rm {max}}=E_{0}k_{2}})
y {\displaystyle K_{\rm {m}}}{\displaystyle K_{\rm {m}}} como la concentraci�n de
sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad m�xima de la reacci�n.

Sin embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los

sistemas m�s simples. Por ejemplo, la malato deshidrogenasa sintetiza, en el
interior de la mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser sustrato de diversas
enzimas como la citrato sintasa, en el ciclo de los �cidos tricarbox�licos, la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, en la gluconeog�nesis, o la aspartato
aminotransferasa, en la bios�ntesis de �cido asp�rtico. Para ser capaz de predecir
cu�nto oxalacetato ser� desviado por cada una de las rutas es necesario saber tanto
la concentraci�n del oxalacetato como la concentraci�n y los par�metros cin�ticos
de cada una de las enzimas. Este ejemplo denota la complejidad que podemos llegar a
encontrar al intentar predecir el comportamiento de rutas metab�licas completas o
de organismos enteros, por medio de modelos matem�ticos. Aunque estos objetivos a�n
no se han alcanzado en eucariotas, se han obtenido ciertos progresos en bacterias,
utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.13?14?

Reacciones multisustrato
Las reacciones multisustrato siguen una serie de complejas ecuaciones que describen
c�mo se unen los sustratos y en qu� orden lo hacen. El an�lisis de estas reacciones
es mucho m�s sencillo si la concentraci�n del sustrato A se mantiene constante y la
del sustrato B var�a. En estas condiciones, la enzima se comporta igual que una
enzima de �nico sustrato, por lo que en una gr�fica de velocidad la concentraci�n
de sustrato dar� unos valores aparentes de las constantes cin�ticas, Km y Vmax,
para el sustrato B. Si se realizan una serie de medidas a diferentes
concentraciones fijas de sustrato A, los datos obtenidos permitir�n saber a qu�
tipo de mecanismo pertenece la reacci�n enzim�tica. Para una enzima que una dos
sustratos A y B, y los transforme en dos productos P y Q, existen dos tipos de
mecanismos descritos hasta ahora.

Mecanismo de complejo ternario

Mecanismo de complejo ternario al azar para una reacci�n enzim�tica. La enzima E

une los sustratos A y B y libera los productos P y Q en un orden no definido.
Las enzimas (E) que presentan este mecanismo de reacci�n unen al mismo tiempo los
dos sustratos (A y B), dando lugar a un complejo ternario EAB. El orden secuencial
de uni�n de los sustratos puede ser al azar (mecanismo al azar) o seguir un orden
en particular (mecanismo ordenado). Si fijamos la concentraci�n del sustrato A y
variamos la de B, y representamos gr�ficamente el comportamiento de la enzima
mediante un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas con un
punto de intersecci�n com�n a todas ellas.

Entre las enzimas que presentan este mecanismo podemos encontrar la glutation S-
transferasa,15? la dihidrofolato reductasa16? y la ADN polimerasa.17? Los
siguientes enlaces muestran animaciones del mecanismo de complejo ternario de la
dihidrofolato reductasa � y de la ADN polimerasa ?.

Mecanismo de ping-pong
Como se puede apreciar en la figura de la derecha, las enzimas con un mecanismo de
ping-pong pueden presentar dos estados, la conformaci�n normal (E) y la
conformaci�n modificada qu�micamente (E*) o conformaci�n intermedia. En este tipo
de mecanismo, el sustrato A se une a la enzima E, que pasa a un estado intermedio
E*, por ejemplo, por transferencia de un grupo qu�mico al centro activo de la
enzima, pudiendo ya ser liberado en forma de producto P. �nicamente cuando el
sustrato A ya ha sido liberado del centro activo de la enzima puede unirse el
sustrato B, que devuelve a la enzima modificada E* a su estado original E, y
liberarlo en forma de producto Q. Si fijamos la concentraci�n de A y variamos la de
B, y representamos gr�ficamente una enzima con mecanismo de ping-pong en un
diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas paralelas entre s�.

Mecanismo de ping-pong para una reacci�n enzim�tica. La uni�n de los sustratos A y

B tiene lugar en un orden definido y secuencial, por medio de un intermediario
enzim�tico modificado, E*.
Entre las enzimas con este tipo de mecanismo podemos encontrar alguna
oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa,18? transferasas, como la acil-
neuraminato citidil transferasa,19? y serin proteasas, como la tripsina y la
quimiotripsina.20? Las serin-proteasas conforman una diversa familia de enzimas muy
comunes, que incluyen enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina y elastasa),
varias enzimas del proceso de coagulaci�n y muchas otras. En las serin-proteasas,
el estado intermedio E* es una especie acilada en una serina del centro catal�tico
de la enzima. El siguiente enlace muestra una animaci�n del mecanismo catal�tico de
la quimiotripsina d.

Cin�ticas no Michaelianas

Curva de saturaci�n de una enzima alost�rica, donde se puede apreciar una cin�tica
sigmoidea.
Algunas reacciones enzim�ticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser representadas
en una curva de saturaci�n, lo que suele indicar una uni�n cooperativa del sustrato
al centro catal�tico de la enzima. Esto quiere decir que la uni�n de una mol�cula
de sustrato influye en la uni�n de las mol�culas de sustrato posteriores. Este
comportamiento es el m�s com�n en las enzimas multim�ricas, que presentan varias
zonas de interacci�n con el sustrato.21? El mecanismo de cooperaci�n es semejante
al observado en la hemoglobina. La uni�n de una mol�cula de sustrato a una de las
zonas de interacci�n altera significativamente la afinidad por el sustrato de las
dem�s zonas de interacci�n. Las enzimas con este tipo de comportamiento son
denominadas alost�ricas. La cooperatividad positiva tiene lugar cuando la primera
mol�cula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto de zonas de
interacci�n. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene lugar cuando la
primera mol�cula de sustrato unida reduce la afinidad de la enzima por nuevas
mol�culas de sustrato.

Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato

transcarbamilasa bacteriana22? y la fosfofructoquinasa,23? y con cooperatividad
negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mam�feros.24?

La cooperatividad es un fen�meno bastante com�n y puede llegar a ser crucial en la

regulaci�n de la respuesta enzim�tica a cambios en la concentraci�n de sustrato. La
cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho m�s sensible a la
concentraci�n de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran
medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentraci�n de sustrato. Por el
contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a peque�os
cambios en la concentraci�n de sustrato.

La ecuaci�n de Hill25? suele ser utilizada para describir cuantitativamente el

grado de cooperatividad en cin�ticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n)
indica cu�ntas de las zonas de uni�n de sustrato de una enzima afectan a la
afinidad de la uni�n del sustrato en el resto de las zonas de uni�n. El coeficiente
de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa.

n > 1: indica cooperatividad positiva.
Cin�tica del estado preestacionario

Representaci�n gr�fica del estado preestacionario de una reacci�n enzim�tica donde

se puede apreciar la fase inicial r�pida.
Al realizar un ensayo enzim�tico y mezclar la enzima con el sustrato, existe un
breve per�odo inicial en el que no se produce ni s�ntesis de producto, ni estado
intermedio de la enzima. El estudio de los milisegundos siguientes a la mezcla es
denominado cin�tica del estado preestacionario y est� relacionado con la formaci�n
y consumo de los intermediarios enzima-sustrato (ES o E*) hasta el momento en el
que se alcanzan ciertas concentraciones y comienza el estado estacionario.

La primera enzima en la que se estudi� este proceso, durante la reacci�n de

hidr�lisis, fue la quimiotripsina.26? La detecci�n de intermediarios suele ser la
principal evidencia necesaria para saber bajo qu� mecanismo act�a la enzima. Por
ejemplo, al realizar un ensayo de cin�tica r�pida de una reacci�n enzim�tica
gobernada por un mecanismo de ping-pong, podremos hacer un seguimiento de la
liberaci�n de producto P y medir la formaci�n de intermediarios enzim�ticos
modificados E*.27? En el caso de la quimiotripsina, el intermediario enzim�tico se
produce por un ataque nucleof�lico del sustrato sobre una serina del centro
catal�tico, lo que genera una forma intermediaria acilada de la quimiotripsina.

En la figura de la derecha, se puede observar como la enzima pasa r�pidamente a un

estado intermedio E* durante los primeros segundos de la reacci�n. Posteriormente,
cuando es alcanzado el estado estacionario, la velocidad disminuye. Esta primera
fase de la reacci�n proporciona la tasa de conversi�n de la enzima. Por lo tanto,
la cantidad de producto liberado durante esta fase (que puede obtenerse prolongando
la recta correspondiente al estado estacionario hasta cortar el eje y) tambi�n da
la cantidad de enzima funcional presente en el ensayo.28?

Mecanismo qu�mico
Uno de los objetivos m�s importantes en los estudios de la cin�tica enzim�tica es
determinar el mecanismo qu�mico que subyace en la reacci�n enzim�tica, por ejemplo,
determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformaci�n de
sustrato en producto. Las aproximaciones cin�ticas discutidas anteriormente pueden
proporcionar informaci�n relacionada con la velocidad de reacci�n de los
intermediarios enzim�ticos formados, pero no permitir�n identificar qu�
intermediarios son exactamente.

Con el fin de determinar la etapa limitante de la reacci�n o los intermediarios que

se forman durante la misma, se pueden llevar a cabo ensayos enzim�ticos en diversas
condiciones con enzimas o sustratos ligeramente modificados, que aporten datos al
respecto. Un ejemplo caracter�stico de etapa limitante de una reacci�n es aquella
en la que se rompe un enlace covalente dando lugar a un �tomo de hidr�geno. Si
intercambiamos cada �tomo de hidr�geno por su is�topo estable, deuterio, podremos
saber cual de los posibles hidr�genos transferidos es el que determina la etapa
limitante. La velocidad sufrir� una variaci�n cuando el hidr�geno cr�tico sea
reemplazado, debido al efecto isot�pico cin�tico primario, cuyo origen se encuentra
en la mayor estabilidad de los puentes de deuterio, m�s dif�ciles de romper que los
puentes de hidr�geno.29? Tambi�n es posible medir efectos similares por medio de
otras sustituciones isot�picas, tales como 13C/12C � 18O/16O, pero los efectos
producidos en estos casos son m�s dif�ciles de detectar.

Los is�topos tambi�n pueden ser utilizados para obtener informaci�n acerca del
destino de diversas partes de la mol�cula de sustrato cuando este es transformado
en producto. Por ejemplo, a veces es dif�cil de determinar el origen de un �tomo de
ox�geno en el producto final, ya que puede provenir del agua o de la mol�cula de
sustrato. Esto puede resolverse mediante la sustituci�n sistem�tica de los �tomos
de ox�geno de las mol�culas que participen en la reacci�n, por su is�topo estable
18O, llevando posteriormente a cabo una b�squeda del is�topo en el producto
obtenido. El mecanismo qu�mico tambi�n puede ser elucidado estudiando los efectos
cin�ticos e isot�picos bajo diferentes condiciones de pH,30? alterando los niveles
de iones met�licos u otros cofactores,31? por mutag�nesis dirigida de amino�cidos
conservados, o mediante el estudio del comportamiento de la enzima en presencia de
an�logos del sustrato.

Inhibici�n enzim�tica
Art�culo principal: Inhibidor enzim�tico

Esquema de una reacci�n enzim�tica en presencia de un inhibidor enzim�tico de uni�n

reversible.
Los inhibidores enzim�ticos son mol�culas que reducen o anulan la actividad
enzim�tica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la
desaparici�n del inhibidor restaura la actividad enzim�tica) o irreversible (el
inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

Inhibidores reversibles
Los inhibidores enzim�ticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos,
acompetitivos, no competitivos y mixtos, seg�n el efecto que produzcan en las
constantes cin�ticas Km y Vmax. Este efecto depender� de que el inhibidor se una a
la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos, como se puede observar en la
figura de la derecha y en la tabla inferior. Para clasificar correctamente un
inhibidor pueden llevarse a cabo estudios de su cin�tica enzim�tica en funci�n de
la concentraci�n de inhibidor. Los cuatro tipos de inhibici�n dan lugar a diagramas
de Lineweaver-Burke y de Eadie-Hofstee11? que var�an de diferente forma con la
concentraci�n de inhibidor. Para abreviar, se usan dos s�mbolos:

{\displaystyle \alpha =1+{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}}}}{\displaystyle \alpha =1+

{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}}}} y {\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+
{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}^{\prime }}}}{\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+{\frac
{[{\mbox{I}}]}{K_{i}^{\prime }}}}
donde Ki y K'i son las constantes de disociaci�n para unirse a la enzima y al
complejo enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor reversible,
los valores aparentes de la Km y la Vmax pasan a ser (a/a')Km y (1/a')Vmax,
respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos m�s
comunes.

Tipo de inhibici�n Km aparente Vmax aparente

solo Ki ({\displaystyle \alpha ^{\prime }=1}{\displaystyle \alpha ^{\prime }
=1}) competitiva {\displaystyle K_{\rm {m}}\alpha ~}{\displaystyle K_{\rm
{m}}\alpha ~} {\displaystyle ~V_{\rm {max}}~}{\displaystyle ~V_{\rm {max}}~}
solo Ki' ({\displaystyle \alpha =1~}{\displaystyle \alpha =1~}) no
competitiva {\displaystyle {\frac {K_{\rm {m}}}{\alpha ^{\prime }}}}{\displaystyle
{\frac {K_{\rm {m}}}{\alpha ^{\prime }}}} {\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}
{\alpha ^{\prime }}}}{\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}
Ki = Ki' ({\displaystyle \alpha =\alpha ^{\prime }}{\displaystyle \alpha =\alpha
^{\prime }}) acompetitiva {\displaystyle ~K_{\rm {m}}~}{\displaystyle
~K_{\rm {m}}~} {\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}
{\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}
Ki ? Ki' ({\displaystyle \alpha \neq \alpha ^{\prime }}{\displaystyle \alpha
\neq \alpha ^{\prime }}) mixta {\displaystyle {\frac {K_{\rm {m}}\alpha }
{\alpha ^{\prime }}}}{\displaystyle {\frac {K_{\rm {m}}\alpha }{\alpha
^{\prime }}}} {\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}
{\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}
Los ajustes por regresi�n no lineal de los datos de cin�tica enzim�tica32? pueden
proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociaci�n Ki y Ki'.

Inhibidores irreversibles
Los inhibidores enzim�ticos tambi�n pueden unirse e inactivar una enzima de forma
irreversible, generalmente por medio de modificaciones covalentes de residuos del
centro catal�tico de la enzima. Estas reacciones decaen de forma exponencial y
suelen ser saturables. Por debajo de los niveles de saturaci�n, mantienen una
cin�tica de primer orden con respecto al inhibidor.

Mecanismos de cat�lisis

La variaci�n de energ�a como funci�n de una coordenada de reacci�n muestra la

estabilizaci�n del estado de transici�n cuando dicha reacci�n es llevada a cabo por
una enzima.
El modelo de ajuste inducido es el m�s utilizado al realizar estudios de
interacci�n enzima-sustrato.33? Este modelo propone que las interacciones iniciales
entre la enzima y el sustrato son relativamente d�biles, pero suficientes para
producir ciertos cambios conformacionales en la enzima, que estabilizan e
incrementan la fuerza de la interacci�n. Estos cambios conformacionales implican a
una serie de amino�cidos catal�ticos del centro activo, en los cuales se producen
los enlaces qu�micos correspondientes entre la enzima y el sustrato. Despu�s de la
uni�n, uno o m�s mecanismos de cat�lisis disminuyen la energ�a del estado de
transici�n de la reacci�n, por medio de una ruta alternativa a la reacci�n. Los
mecanismos de cat�lisis se clasifican acorde a diferentes criterios: cat�lisis
covalente, cat�lisis por proximidad y alineaci�n de orbitales, cat�lisis �cido-base
general, cat�lisis por iones met�licos y cat�lisis electrost�tica.

Los estudios de cin�tica enzim�tica no permiten obtener el tipo de cat�lisis

utilizada por una enzima. Sin embargo, algunos datos cin�ticos pueden proporcionar
una serie de indicios que lleven a realizar otro tipo de estudios dirigidos a
determinar dicho tipo de cat�lisis. Por ejemplo, en un mecanismo de ping-pong la
cin�tica del estado pre-estacionario puede estar sugiriendo una cat�lisis de tipo
covalente. Por otro lado, variaciones en el pH pueden producir efectos dr�sticos en
la Vmax pero no en la Km, lo que podr�a indicar que un residuo del centro activo
precisa un estado concreto de ionizaci�n para que se pueda llevar a cabo la
cat�lisis enzim�tica.

Cat�lisis enzim�tica
...

Representaci�n de la variaci�n y diferencias de la energ�a libre de Gibbs entre una

reacci�n no catalizada por una enzima (arriba, en rojo) y otra que s� lo es (abajo,
en azul).
La cat�lisis enzim�tica es una disciplina de la enzimolog�a que estudia los
mecanismos de cat�lisis por los cuales las prote�nas o �cidos nucleicos con
actividad enzim�tica pueden favorecer la reacci�n de ciertos sustratos y su
conversi�n en productos. Este hecho est� subordinado a las leyes de la cat�lisis
qu�mica convencional: es decir, la existencia de una enzima no permite la aparici�n
de nuevas reacciones, ni va en contra de la termodin�mica del proceso; simplemente,
acelera su velocidad favoreciendo una ruta de menor coste energ�tico incluyendo en
la din�mica de la reacci�n un estado intermediario de alta energ�a de modo que el
n�mero de mol�culas activas, capaces de crear y destruir nuevos enlaces, aumente.