Facultad de medicina veterinaria y zootecnia

Biotecnología Marina

“Prácticas de laboratorio”

Elaborado por:

Sarmiento Prego Juan Miguel

Regina Contreras Hernández

Lisbet Urgell López

Profesor:

Dr. Lorena Violeta León Deniz

26/06/18
Introducción

Medios de cultivo:

Se conoce como biotecnología a cualquier uso tecnológico de un sistema biológico,

organismo vivo o derivado de él para hacer un trabajo específico o un proceso especifico;
puede implicar desde la ingeniería hasta la medicina (se puede observar en la amplia gama
de factores que se pueden utilizar a partir de la misma como las bacterias para realizar la
fermentación hasta recombinar el ADN de un organismo) [ CITATION Sri12 \l 2058 ].

En [ CITATION EFB99 \l 2058 ] dividió a la biotecnología en cuatro ramas, cada rama se le

conoce con un color diferente; en el apartado de agricultura se le denomino con el color
verde y se centra directamente en la generación de alimentos con mayor nutrición, seguros
y libres de contaminantes; en medicina se le denomino el color rojo y se encargan de la
búsqueda de nuevos fármacos y nuevas terapias para tratar enfermedades; la aplicada a la
industria se le denomino con el color blanco y ve el manejo de los productos desde su
tratamiento hasta su proceso, busca crear nuevos materiales y combustibles útiles para el
ser humano; la más actual y que apenas se ha empezado a implementar es la biotecnología
azul o biotecnología marina se dedica al procesamiento de los organismos marinos para un
uso provechoso, ya se para la medicina o para evitar un impacto ambiental más severo.

Se pueden observar varias área de trabajo en biotecnología, según [ CITATION Soe08 \l 2058 ]
y [ CITATION Tan09 \l 2058 ] podemos distinguir cuatro posibles aplicaciones a la
biotecnología: en medicina (para diagnósticos, epidemiologia, terapéutica o terapia génica),
agricultura (producción de plantas, producción de animales o nutrición), para el ambiente
(bioremediadores, limpieza de procesos industriales o biomonitoreadores) o para
bioprocesos (fermentación, producción de químicos, producción de enzimas o biocatálisis),
ambos autores mencionan que la biotecnología puede llegar a ser utilizada en otros aspectos
pero esos son los campos donde más énfasis se les ha hecho.

El futura de la biotecnología es bastante amplio puesto que es un recurso muy útil para las
personas, en décadas anteriores se pudo observar un rápido avance en el uso de animales y
plantas para la ciencia desde técnicas con células hasta en algunos órganos especializados
[ CITATION Ami09 \l 2058 ], para medicina un diagnostico más rápida y eficiente, conjunto
con un tratamiento apto que puede resolver las enfermedades del siglo XXI (cáncer,
anemia, diabetes, etc.) [ CITATION New06 \l 2058 ]; en el área de la biotecnología marina es
un campo nuevo y apenas se están explorando los posibles campos de trabajo que pueden
verse aplicado.

En la biotecnología marina podemos encontrar diversos usos para organismos, en esta

práctica utilizamos medios de cultivo, un medio de cultivo es un gel o solución que
contiene nutrientes (dependiendo del cultivo será la variación en los nutrientes) [ CITATION
Gon17 \l 2058 ]. Generalmente se busca que un medio de cultivo tenga las condiciones, en
[ CITATION Tor13 \l 2058 ] divididas en dos: requerimientos físicos, que son la temperatura
(en los cultivos de microalgas existen un amplio espectro de temperaturas aceptadas pero la
gran mayoría prefieren climas cálidos) [ CITATION Che15 \l 2058 ], el pH en [CITATION
Cav01 \l 2058 ] se realizo un estudio de los diferentes espectros que pueden aguantar estos
organismos y según los resultados se pueden mantener sobre el 7 +- 1 para una actividad
normal/acelerada; y la presión osmótica (por este medio los microorganismos se nutren).

También tenemos los requerimientos químicos para un medio de cultivo se basa

principalmente en carbón (uno de los requerimientos más importantes para los organismos
fototrópicos) [CITATION Ana151 \l 2058 ], también es necesario nitrógeno, sulfuro, fosforo
(los microorganismos necesitan estos elementos para sintetizar material celular como ADN
o ATP) [ CITATION Tor13 \l 2058 ] y oxigeno (necesario para el crecimiento de organismos
vegetales).

Los usos son variados, pero se dividen en tres grandes: antibiograma (prueba
microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad de una bacteria a un grupo
de antibióticos), identificación (de algún microorganismo que se necesite en una sepa) y
multiplicación (buscar un microorganismo el cual pueda servir para atenuar o generar una
vacuna) [ CITATION Eri17 \l 2058 ].

En [ CITATION Sin17 \l 2058 ] divide los medios de cultivo de acuerdo con: de que se
componen (tanto naturales como sintéticos), según su uso (pueden ser conocidos como
enriquecidos, selectivos o diferenciales) o por su estado físico (líquido, semisólidos o
sólidos).
Para esta práctica se decidió realizar un medio de cultivo para microalgas, son conocidas
como microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplanconton que
abarca desde organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados auxótrofos
[ CITATION Tor15 \l 2058 ]. Según [ CITATION FAO041 \l 2058 ] existen muchos factores que
contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, desde los recipientes
utilizados (se deben de utilizar materiales no tóxicos como cajas Petri), la aireación
necesaria para evitar la sedimentación de nutrientes, la penetración de luz en el cultivo
(algunos cultivos requieren el cambio de inoculo para poder contribuir al proceso
fotosintético).

La importancia de estos microrganismos es variada, como por ejemplo en [ CITATION

Bei18 \l 2058 ] utilizan estos microrganismos como productos para realizar biocombustibles
cuantificando los lípidos que están dentro de sus células y utilizando energía que estas
puedan dar, en acuacultura el fitoplancton generalmente es utilizado para alimentar desde
larvas hasta macroorganismos [ CITATION Buc16 \l 2058 ].

Cromatografía de capa fina:

Todos los compuestos químicos tienen la capacidad de absorber, transmitir o reflejar los
efectos de luz, la espectrofotometría es una manera cuantificable de saber que cantidades de
luz refleja o acepta la muestra obtenida[ CITATION Tho17 \l 2058 ], en bioquímica es utilizada
para determinar el complejo enzimático-catalizado de una reacción [ CITATION Rot16 \l
2058 ].

Un espectrofotómetro es el instrumento que permite cuantificar la luz captable por la

sustancia (por medio de la intensidad de luz), con este instrumento se ha determinado las
concentraciones con el detector de luz que trabaja en dos modos [ CITATION Oli14 \l 2058 ]
UV-visible (utiliza los rangos de 185 – 400 nm y 400 – 700 nm para obtener la imagen) e
IR (utiliza los rangos de 700 – 1500 del espectro).

Uno de los derivados de la espectrofotometría es la cromatografía en capa fina que utiliza

una placa inmersa verticalmente para mantener una fase estacionaria polar para ser adherida
a una superficie sólida. [ CITATION Oli14 \l 2058 ]
En biología celular se utiliza frecuentemente para separar los macronutrientes de una
muestra y en algunos casos cadenas de polipéptidos o ácidos nucleicos como en [ CITATION
Eik07 \l 2058 ].

La fase estacionaria o absorbente es donde se encuentra la superficie de contacto formada

por una capa finísima más menos a 0.1 mm que entrara en contacto con la fase móvil o
eluyente en esta fase los agregados irán moviéndose por capilaridad y se verán separados en
la capa previamente puesta [ CITATION Men11 \l 2058 ].

Con este método podemos encontrar la relación de las distancias recorridas por el
compuesto y por el disolvente desde el punto de origen del cromatograma, a esa distancia
se le conoce como rate factor, el cual posee un valor constante (dependiendo de la polaridad
de los compuestos), cuanto más polar sea el compuesto más retenido estará en el absorbente
y por lo tanto irá más lento y el rf será también menor, los compuestos que presentan una
mayor polaridad consiguen desplazarse a mayor distancia del origen. [ CITATION Smi76 \l
2058 ]

Objetivo

Microalgas: Se realizará un cultivo de microalgas mixto con ayuda de dos medios de

cultivo.

Cromatografía: Se realizará una prueba cromatográfica de capa fina para conocer las
diferentes polaridades de compuestos.

Objetivo especifico

Microalgas:

Se prepararán dos medios de cultivo.

Se realizará la inoculación de microalgas dentro de los medios de cultivo.

Se llevará el conteo de estos organismos en cámaras de Neubaver.

Cromatografía:
Se buscarán las diferentes polaridades de los compuestos.

Se diferenciará con UV las polaridades.

Metodología

Microalgas:

Se dividió en tres partes la metodología de las microalgas, en el primer momento se lavaron

y esterilizaron cuatro matraces de 300mL en la autoclave de pared a 15 lbs durante 3 horas

El segundo momento fue realizado dos medios de cultivo Medio de cultivo Chu 10 y
Bristol con las siguientes medidas.

Medio de cultivo Chu 10 Medio de cultivo Bristol

Reactivo Cantidad para 1.2 L Reactivo Cantidad para 1.2 L
Ca(NO3)2 0.048 g Na3N 12 g
K2HPO4 0.012 g Ca2Cl 1.2 g
MgSO4.7H2O 0.03 g MgSO4.7H2O 3.6 g
Na2CO3 0.024 g K7P 8.2 g
Na2SiO3 0.03 g 2K4P 3.6 g
FeCl3 0.0096 g NaCl 1.2 g
Se agrego en dos matraces de 1.2L y se mantuvieron en agitación constante después de
terminar de agregar los reactivos anteriores se agrego 1 gota de cloruro férrico al 1%.

Después se limpiaron las campanas de flojo laminar con alcohol y luz ultravioleta. Se
procedió a encender mecheros de bunsen en ambos lados para evitar la contaminación,
enseguida se siguió al tercer paso que fue la inoculación de los organismos dentro de los
medios de cultivo, dentro de las campanas de flujo se llevo la inoculación con 10 mililitros
por muestra. Posteriormente se dejo a la luz arriba de la campana de flujo y con un
hematocitómetro se llevo el conteo de células en 10 microlitros; estos conteos fueron
realizados los días 11/06, 14/06, 15/06 y 25/06.

Cromatografía:
Se cortaron dos cromatofolios de aluminio impregnados con gel de sílice con un tamaño de
5 cm de largo por 2 cm de ancho, con un lápiz en la parte posterior se dejo de margen .5 cm
a todos los bordes evitando meter presión para no dañar la silica, con una pipeta se
añadieron dos gotas de la solución a la línea previamente marcada. Posteriormente fueron
llevadas a la lampara de UV para el revelado de las placas.

Resultados

Microalgas:

Grafico 1.- en el presente

Curva de crecimiento en Chu 10 grafico podemos observar
12 como se comporta la sepa
10 al avanzar los días 11/06,
14/06, 15/06 y 25/06
Promedio de Chu 10

8
respectivamente en la
6 muestra, por lo tanto,
podemos saber que nuestra
4
muestra está en fase
2 exponencial.
0
0 2 4 6 8 10 12
Dias

Curva de cremcimiento en Bristol Grafico 2.- en el grafico

posterior podemos
12
observar como se
Promedio de Bristol

10
8
comporta la sepa
6
dependiendo de los días
4 11/06, 14/06, 15/06 y
2 25/06 respectivamente,
0 podemos observar que se
0 2 4 6 8 10 12
mueven en forma
Dias exponencial.

Se realizo la conversión de células por microlitro a células por mililitro y posteriormente se

realizó la conversión para 300 mililitros:
Células en 300 ml=¿51.359 * 1000/10 = 5135.9 * 300 = 1,540,700 en Bristol

Células en 300 ml=¿54.59 * 1000/10 = 5459 * 300 = 1,637,700 en Chu 10

Utilizando el programa Start Graphics, se buscó tanto la normalidad como la

homocedasticidad en las medias aritméticas de las muestras y posteriormente juntas:

Pruebas de Normalidad para Bristol

Prueba Estadístico Valor-P
Estadístico W de Shapiro-Wilk 0.960021 0.810084
Pruebas de Normalidad para Chu
Prueba Estadístico Valor-P
Estadístico W de Shapiro-Wilk 0.906957 0.337736
Pruebas de Normalidad para Promedios
Prueba Estadístico Valor-P
Estadístico W de Shapiro-Wilk 0.908184 0.0000611092

Verificación de Varianza Chu 10

Prueba Valor-P
Levene's 1.61672 0.169717
Verificación de Varianza Bristol
Prueba Valor-P
Levene's 3.18256 0.039193
Verificación de Varianza Medios
Prueba Valor-P
Levene's 1.86274 0.0553179
Aunque las pruebas de verificación de la varianza fueron exitosas a un 95% de confianza,
las pruebas de normalidad evitan que se pueda realizar un ANOVA de dos vías para ver que
medio de cultivo es estadísticamente mejor, por lo tanto, se optara por hacer una prueba de
Kruskal- Wallis para ver las diferencias entre los dos medios de cultivo.

Prueba de Kruskal-Wallis para Promedios por Medios

Medios Tamaño Rango
Muestra Promedio
Bristol 10.25/06 8 51.4375
Chu 10. 25/06 8 54.5
Estadístico = 51.9592 Valor-P = 5.94773E-9
La prueba de Kruskal-Wallis evalúa la hipótesis de que las medianas de Promedios dentro
de cada uno de los 2 niveles de Medios son iguales. Primero se combinan los datos de
todos los niveles y se ordenan de menor a mayor. Luego se calcula el rango (rank)
promedio para los datos de cada nivel.

Gráfico Caja y Bigotes

Bristol 10.25/09

Bristol 10.15/08

Bristol 10.14/07
M e d io s

Bristol 10.11/06

Chu 10. 25/06

Chu 10. 15/06

Chu 10. 14/06

Chu 10.11/06

0 10 20 30 40
Promedios

Según el grafico de caja y bigotes podemos observar como las muestras fueron aumentando
durante los diferents días, diferenciándose por medio de las medias aritméticas.

Imagen 1.- (1) Células que, si se contaron, (2) Células que, no se contaron; para el muestreo
se utilizó ese criterio de conteo para discernir las células para un conteo y para las que no.
 1

Imagen 2.- (1) células que, si se contaron puesto que estaban dentro de un cuadrante del
hematocitómetro, (2) células que también se llevo el conteo puesto que estaban dentro de
un cuadrante en el hematocitómetro; para discernir lo que se cuenta y cuales no, dado que
se encontraban en dos cuadrantes diferentes se conto por dos.

Cromatografía:

Imagen 1.- podemos observar donde

se administró el disolvente (acetona),
y las marcas de donde se debía
agregar el disolvente.

Imagen 2.- Podemos observar como

se mueve el disolvente sobre el
cromatofolio de aluminio.
Discusión.
Microalgas:
Durante la realización de la practica de cultivo de microalgas que empezó desde el día
11/06/2018 hasta el día 25/06/2018, se realizaron cuatro conteos los días 11/06, 14/06,
15/06 y 25/06 con una muestra con diferentes especies de microalgas y dos tipos de medios
de cultivos, el conteo se llevó acabo con discriminantes específicos.

En [ CITATION Rag18 \l 2058 ] utilizaron el medio de cultivo de Zobell durante un mes para
obtener un biodisel, durante su fase exponencial (donde nos quedamos) obtuvieron un total
de 7,250,680 organismos por 500 ml, en comparación con nuestra densidad obtenida se
encuentran muchas diferencias, revisando la metodología el medio de cultivo se realizo con
medios de cultivo de agar y se mantuvo con un pH de 7.0, con aireación constante, durante
la realización de nuestro medio de cultivo no se tomó en cuenta y el cultivo apenas tuvo
aireación durante el tiempo que estuvo. Otro factor que también pudo afectar fue la luz,
mientras que en [ CITATION Rag18 \l 2058 ] se mantuvo con 1000 lux, en comparación con
nuestro cultivo que apenas tuvo entradas de luz.

Revisando [ CITATION Tan14 \l 2058 ] se utilizo un medio de cultivo que tendía a precipitarse
por todos los reactivos utilizados (Met 44) durante su fase exponencial se obtuvieron un
total 821,651 células por 500 ml en diferencia con nuestros cultivos que se obtuvo arriba de
1 millón de células por 300 ml, en el articulo especifica que se mantuvo con luz constante
durante 3 semanas, se omitió la aireación y no se tienen notas totales del pH en el medio de
los microorganismos, con estos datos podíamos encontrar algunas diferencias estándar
entre los cultivos.

En ninguno de los dos artículos se especifica cual fue el método de conteo en las muestras,
por lo tanto, se cree que puedan existir diferencias estadísticas que muestren diferencias
entre los cultivos.

En [ CITATION Kaw16 \l 2058 ]se utilizó un medio de cultivo (Guillard) enriquecido,

insertando cada semana durante un mes una solución diferente a la anterior para un cultivo
de Tetraselmis Spp. En cuatro semanas se tuvo un total de 10,962,210 células en 500 ml, se
mantuvo con aireación constante y luz para mantener el cultivo en estado óptimo donde se
puede observar que existe mayor cantidad de organismos que en las muestras es con el
método anteriormente utilizado fue en la última manteniendo en un sistema útil el cultivo
como lo describe en [ CITATION FAO041 \l 2058 ].

Cromatografía:

Durante la realización de esta practica se utilizaron tres muestras dos testigos y una que se
pudo observar el movimiento correcto de la acetona.

La cromatografía presenta un sinfín de oportunidades para encontrar diferencias en

muestras con diferencias polares, lo cual permitiría verse involucrados otros factores, en
[ CITATION Abd18 \l 2058 ] lo utilizan para conocer la elasticidad que se puede llegar a tener
dependiendo de la polaridad de los compuestos del cual puede estar compuesto un objeto,
[ CITATION WTi78 \l 2058 ] se realizo la separación de los diferentes compuestos con este
proceso dando paso a como se podían observar los compuestos en una prueba
cromatográfica, comparado con lo que se realizo en la imagen 2, se puede observar una
diferencia alta, puesto que en [ CITATION WTi78 \l 2058 ]se utilizaron compuestos
considerablemente puros (al 90%) mientras que en nuestra prueba se realizaron con
compuestos muy diluidos (generalmente al 10%) por lo tanto pudieron obtener una imagen
más nítida que la nuestra.

En [ CITATION Wal16 \l 2058 ] utilizan coloides silvestres para realizar la prueba de

cromatografía, dado que los compuestos se encuentran en un estado puro, pudieron recrear
las líneas con el UV comparado a lo obtenido en laboratorio podemos observar una
diferencia significativa entre ambos procesos dado a los compuestos, como en [ CITATION
WTi78 \l 2058 ] podemos notar una diferencia entre los resultados dado a la reacción de los
reactivos sobre la capa de cromatofolios.

En la metodología también podemos notar algunas diferencias con otros trabajos

previamente realizados [ CITATION Khu16 \l 2058 ] realizaron la prueba cromatográfica con
medicamentos pasados previamente en hexano para quedarse con solo la polaridad de los
compuestos, utilizaron micropipetas para poder llevar la prueba sobre los cromatofolios (en
nuestro caso se utilizó una pipeta pasteur, lo que impedía tener una medida cuantificable),
se realizó con 12 cromatofolios para tener una muestra estándar la cual pueda mostrar
diferencias estadísticas entre cada una (en nuestro caso solo se pudo realizar 2 veces la cual
una salió errónea por errores de manejo), en los resultados obtenidos por [ CITATION Khu16 \l
2058 ] se podían observar las líneas de polaridad fuera del UV mientras que en nuestra
muestra apenas se lograron ver las líneas de polaridad aun dentro del UV.

En [ CITATION Haw17 \l 2058 ] se utilizó esta prueba para poder separar compuestos extraídos
de la planta Ocimum Spp. Para poder separar los metabolitos secundarios que podían verse
presentados en esa planta, se obtuvieron 6 tipos de metabolitos secundarios a diferentes
concentraciones y se observo la separación de los compuestos en los cromatofolios,
comparado con nuestras pruebas que apenas se pudo observar las diferencias en los
compuestos; pero aun así pudimos observar que los compuestos estaban diferenciados
como en todas las pruebas anteriores, debido a la polaridad obtenida en cada uno de los
compuestos.

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