UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA - DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

ASIGNATURA INMUNOLOGÍA – CODIGO 2023105

Técnicas de diagnóstico inmunológico

AGLUTINACIÓN:

Se basa en la interacción antígeno–anticuerpo, que permite establecer si hay presencia de un antígeno determinado, al
visualizarse por la formación de agregados o “grumos” macroscópicamente. Este fenómeno de aglutinación se da cuando el
antígeno (Aglutinógeno) se encuentra en la superficie de las células o en membranas de microorganismos, donde al contacto
con el anticuerpo (Aglutinina) produce agregación. La reacción es más visible cuando el anticuerpo es de tipo IgM que IgG.
Esta reacción es la usada para la clasificación de los grupos de sangre ABO y el sistema Rh.

También se emplea la aglutinación en látex, en la cual se usan partículas de este material cubiertas con el antígeno
específico para el anticuerpo del cual se quiere comprobar su presencia en un suero. La prueba de Coombs es otra prueba
de hemaglutinación que detecta anticuerpos contra los glóbulos rojos, importante en diagnóstico de enfermedades como
anemias hemolíticas autoinmunes, y en la prevención de la anemia hemolítica del recién nacido.

La aglutinación en látex también se emplea en la detección de Proteína A de S. aureus y de Ag capsular de H. influenza.

Hemaglutinación:

Según la clasificación de Landsteiner, que es la universal hay 4 grupos sanguíneos A, B, AB, O. La determinación de estos
grupos se da enfrentando los hematíes con antisueros: Anti-A, Anti-B. Si el antígeno se encuentra en las células se producen
agregados visibles. Para la clasificación del Rh. Se utiliza el mismo fundamento, exponiendo a las células a suero anti-D ( D
es el antígeno más importante en el sistema Rh.), si hay aglutinación es
Rh. Positivo, si no se presenta es Rh. Negativo. Esta técnica es básica
para clasificar el tipo de sangre para transfusiones.

Proteína C reactiva (PCR):

Es una lectina producida por el hígado, descrita por primera vez en 1930 por Tillet y Francis, que normalmente se encuentra
en concentraciones pequeñas en el plasma, pero que aumenta considerablemente en las primeras 24-48 horas de procesos
inflamatorios, debido a que se liga a los polisacáridos de las bacterias y activa el complemento (se une a C1q), para cumplir
su actividad bactericida. También actúa como opsonina para facilitar su fagocitosis, por medio de los receptores para C1q en
los fagocitos. Por esta razón su cuantificación resulta útil para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, proceso
inflamatorio o para evaluación terapéutica porque disminuye rápidamente con la recuperación. Cuando se hace examen
directo de PCR se basa en la aglutinación entre la PCR y un anticuerpo unido a la superficie de partículas de látex.
Valores menores a 6 mg/L se consideran normales.

Técnica
Materiales y procedimiento:

Látex recubierto por anticuerpos anti-PCR

Control positivo y negativo
Sueros de pacientes
Cartón visualizador
Palillos
Agitador de Manzzinni a 100 rpm u hoja de papel con un círculo de 16 cm

50 μl Control (-) +
20 μl látex
50 μl Control (+)
+ 20 μl látex Ctrl + Ctrl -
50 μl suero +
50 μl suero + 20 μl 20 μl látex
látex
Mx 1 Mx 2

1) Servir las muestras, controles y reactivo de látex como se indica en la figura

2) Homogenizar con ayuda de un palillo desechable procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del
circulo
3) Agitar la tarjeta a 100 rpm durante 2 min.
4) Leer e informar los resultados

Factor reumatoideo:

Es un anticuerpo, de clase IgG, IgM, IgA, IgE o IgD (más común IgM o IgG) dirigida contra la fracción Fc de la IgG propia. Se
encuentra elevado principalmente en artritis reumatoidea en un 80% de los casos y por eso es un factor diagnóstico de esta
enfermedad, aunque también se puede encontrar en otras enfermedades autoinmunes como el Síndrome de Sjögren en el
que casi todos los pacientes lo tienen elevado, Lupus Eritematoso Sistémico, Escleroderma etc., neoplasias, infecciones
crónicas, incluso en personas sanas. Las técnicas más comunes para su detección son la utilización de glóbulos rojos de
carnero recubiertos con IgG humana y la aglutinación con partículas de látex de poliestireno recubiertas con IgG humana. Si
al poner en contacto estas partículas con el suero del paciente en estudio se presenta aglutinación quiere decir que hay
presencia de Factor reumatoideo.
PRECIPITACIÓN:

Es el tipo básico de reacción antígeno-anticuerpo. Los

antígenos están en solución. Se realiza con antígenos
solubles que reaccionan con anticuerpos homólogos,
produciendo una precipitación visible. Esto ocurre
cuando los antígenos reaccionan con los anticuerpos
para formar red Ag-Ac (ambos deben ser al menos
divalentes aunque la mayoría son multivalentes) y los
anticuerpos actúan como puentes para unir a los
antígenos, el resultado es un agregado grande e
insoluble de Ag-Ac, que se ven en forma de banda o
anillo, que por su peso va hacia el fondo del tubo.

(Tomado de http://web.educastur.princast.es/proyectos/biogeo_ov/2BCH/B5_MICRO_INM/T52_INMUNOLOGIA/informacion.htm).

VDRL/RPR:

La prueba de oro para el diagnóstico serológico de la Sífilis, es el VDRL; el antígeno utilizado para la búsqueda de los
anticuerpos es una preparación artificial de colesterol-cardiolipina – lecitina, preparada en alcohol absoluto y desarrollada por
el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual de Estados Unidos (Venereal Diseases Research Latoratories), de
donde la prueba toma la sigla VDRL. La prueba se realiza en suero calentado a 56ºC, para destruir factores que puedan
interferir con la reacción. Derivadas de esta prueba, está Rapid Protein Reagine (RPR) en la cual el antígeno viene listo para
 usarse, no requiere el calentamiento del suero ni el uso del microscopio para la visualización de la reacción debido a que el
antígeno incorpora partículas de carbón, que facilitan la observación del fenómeno cuando la prueba es reactiva. Otra prueba
derivada del VDRL es la Uniheated Serum Reagin (USR) que utiliza el mismo antígeno que el VDRL, pero suspendido en
Clorhidrato de colina, que hace innecesario el calentamiento del suero y viene listo para usarse. Todas las pruebas: VDRL,
RPR y USR, tienen la misma especificidad, sensibilidad e interpretación.

VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) y RPR (Reagina Plasmática Rápida), son las pruebas no treponémicas para
el diagnóstico rápido de la sífilis y son las que se usan comúnmente para descartar la enfermedad. Debido a que no utilizan
anticuerpos específicos no tienen cien por ciento de confianza. Estas pruebas determinan los anticuerpos de tipo IgM o IgG
(llamados también Anticuerpos reagínicos), contra los lípidos que se liberan de las células dañadas durante la enfermedad y
están presentes en la superficie celular de los treponemas. El antígeno es la cardiolipina, obtenida del corazón de las vacas.
Ambas pruebas miden la floculación del antígeno cardiolipínico con el suero del paciente. Se debe inactivar el complemento
30 minutos antes de la prueba.

Técnica
Materiales y procedimiento:

Antígeno VDRL (lípidos como cardiolipinas+lecitinas y colesterol) o RPR

Sueros a procesar
Suero Control Positivo
Suero Control Negativo
Láminas planas con anillo de cerámica de 14 mm de diámetro
Agitador de Manzzinni a 180 rpm u hoja de papel con un círculo de 18 cm
Microscopio (objetivo de 10X)

1) Colocar 50 µl del suero control positivo en el primer círculo de la lámina, 50 µl del suero control negativo en el
segundo círculo y 50 µl del suero del paciente en el tercer círculo
2) Mezclar fuertemente el antígeno de VDRL durante 10 segundos, con movimientos de rotación e inversión
3) Adicionar 16 µl del antígeno mezclado (una gota con el dispensador) a cada uno de los círculos y mezclar con un
palillo cada muestra
4) Colocar las láminas en el agitador durante 4 minutos, a 180 rpm (manualmente dibujar un círculo de 18 centímetros
de diámetro) y sobre él, tomar cuidadosamente la lámina, durante 4 minutos, con movimientos suaves y constantes.
5) Colocar la lámina en el microscopio y leer en 10X la prueba de VDRL y la de RPR se lee directamente.

Suero No Reactivo Suero Reactivo

La ausencia de grumos se interpreta como una prueba NO REACTIVA (negativa), es decir, ausencia de anticuerpos anti –
cardiolipinas o antígenos no treponémicos. La presencia de grumos se lee como REACTIVA (positiva). Si los grumos son
muy tenues, la reacción se interpreta como REACTIVA DEBIL.
Cuando la reacción es REACTIVA O REACTIVA DEBIL, debe hacerse una prueba cuantitativa. Para ello se hacen
diluciones dobles del suero (1:2,1:4,1:8,....) hasta la dilución en que la reacción se haga débil. Esta última dilución, indica el
título de reactividad y si por ejemplo corresponde a la dilución 1:32, entonces se informa como REACTIVA 32 DILS.
Si el suero sin diluir es débil reactivo y en la dilución siguiente es NO REACTIVO, la prueba se informa como REACTIVA O
DILS.
Una prueba REACTIVA indica que hay anticuerpos o “reaginas sifilíticas” o anti-cardiolipinas. Estos anticuerpos o reaginas
son una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra el complejo cardiolipina-colesterol-lecitina.
Las pruebas “no treponémicas” son positivas después de 2-3 semanas de infección sifilítica no tratada y son positivas en
título alto en sífilis secundaria.
Estas pruebas son negativas en 6-18 meses con el tratamiento y por lo tanto para el médico constituyen un gran indicador de
la efectividad o no del tratamiento.
La prueba aunque altamente sensible, no lo es tanto en especificidad y bien puede ocurrir que en ciertas circunstancias la
prueba sea REACTIVA en ausencia de infección sifilítica, estas pruebas se denominan “Falsas Reactivas” y deberán
aclararse con pruebas confirmatorias específicas o pruebas treponémicas específicas.

TÉCNICA DE PRECIPITACIÓN EN GELES

1. Técnica de difusión radial de Ouchterlony

2. Técnica de difusión radial simple de Mancini

3. Técnica de inmunoelectroforesis

El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es
equivalente. En la Figura 1 se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo,
soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un antisuero. La precipitación es
máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que
predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reacción no es muy utilizado, al
requerirse grandes concentraciones de antígeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

Técnica de difusión radial doble de Ouchterlony

Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos

(Figura 2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a
investigar y en el resto se coloca el anticuerpo, preparado frente a la
sustancia que se quiere identificar.

Cuando difundan, ambos sistemas se encontrarán y se formará en la zona

de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente, que se hace visible
en forma de una línea de precipitación. En una preparación que contenga
varios antígenos, se obtendrán múltiples líneas de precipitado. La técnica
de Ouchterlony permite identificar sustancias según la forma de unirse las líneas de precipitación de dos o varios sistemas.

Técnica de Inmunoelectroforesis

La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa

la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se desea detectar
se hace reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un pocillo lateral. Por
difusión llegan a encontrarse los antígenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-
Ac, visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por
comparación con un sistema estándar (Figura 3). En Inmunología clínica, esta técnica
puede utilizarse en la identificación de las proteínas de mieloma.
Estas reacciones de precipitación son las que ocurren dentro del organismo entre Ag-
Ac, y en donde estos complejos inmunes son fagocitados o destruidos por el sistema
reticuloendotelial. Estas reacciones de precipitación se pueden hacer por medio de
diluciones si hay necesidad de cuantificación, con diluciones crecientes del Ag a
estudiar, en los primeros tubos se encontrará exceso de Ag, y en los últimos exceso de
Ac. En los tubos del medio habrán concentraciones parecidas por lo que se precipitan
formando inmunocomplejos.

Inmunodifusión Radial Simple (IDRS) - Técnica de Mancini

Es una prueba que permite la identificación de proteinas

plasmáticas. El antígeno (la proteína), se deposita en los pozos
en distintas diluciones, se incuba a 4° C durante 24-48 horas
donde se difunde radialmente en el gel de agarosa que contiene
un Ac específico, formando inmunocomplejos visibles como
anillos. El diámetro del anillo es directamente proporcional a la
concentración de la proteína en la muestra. Esta prueba es de
gran utilidad para medir proteínas de complemento, que son una
parte integral de la respuesta inmune no específica. El
componente C3 del complemento es vital para cualquiera de las
vías, y el C4 para la vía clásica. La activación del complemento se
asocia al consumo de estas proteínas y a su correspondiente
descenso en los niveles plasmáticos, por lo tanto una reducción
en sus valores puede llevar a diagnósticos muy importantes. En
enfermedades como Lupus Eritematoso Sistémico,
glomerulonefritis postestreptocóccica, inmunodeficiencias primarias y otras enfermedades autoinmunes como anemias
hemolíticas se ven niveles bajos de complemento.

Técnica
Materiales y procedimiento:
Placas de inmunodifusión radial para C3 ó C4
Calibradores
Control positivo
Sueros humanos problema
Micropipetas de 2-10µl
Puntas
Cámara húmeda
Nevera 4°C

1) Remover la placa de su embalaje hermético y dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos

2) Abrir la tapa
3) Servir 5 µl de los calibradores, control positivo y sueros problema sin diluir en cada pozo, comenzando en el No.1 y
terminando en el No.12
4) Cerrar la placa y llevar a incubar durante 24-48 h en cámara húmeda a 4°C
5) Hacer la lectura midiendo el diámetro de los anillos
6) Informar los resultados con base en la tabla de referencia

ELISA

La prueba de ELISA está basada en la habilidad del antígeno o anticuerpo de:

1) Adsorberse a un soporte - fase sólida, manteniendo su actividad inmunológica.
2) Unirse a una enzima y que el complejo antígeno o anticuerpo - enzima conserven tanto su actividad inmunológica como su
actividad enzimática.
Este método es empleado para la determinación de antígenos o anticuerpos a partir de diferentes muestras. Para realizar el
ensayo es preciso disponer de una preparación pura de un antígeno (Ag) o un anticuerpo (Ac) o de ambos. El componente
(Ag o Ac) se acopla a un soporte sólido como por ejemplo a placas de poliestireno, papel, perlas, etc., que absorberá una
cierta cantidad de la proteína; a uno de los componentes de la reacción, sea Ag o Ac, se le marca o conjuga con una enzima
y luego se escoge el substrato adecuado para la enzima utilizada. La reacción enzima-sustrato es detenida mediante el uso
de una solución de parada después del tiempo estandarizado para la reacción.

Componentes de la ELISA
- Fase sólida: Se puede utilizar para la fase sólida: plástico, nitrocelulosa, vidrio, celulosa, poliacrilamida, papel o
dextrán.
- Conjugado: Enzima + Ag o Ac: Se conjuga o marca el Ag o Ac con una enzima. La enzima utilizada debe ser
estable, fácil de conjugar, fácil de detectar y de bajo costo. Las enzimas más utilizadas para las pruebas de ELISA son la
fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la b-D-galactosidasa.
- Substrato: El substrato utilizado debe producir una reacción con un producto coloreado fácilmente medible,
también debe ser estable y de bajo costo. Para la enzima peroxidasa se utiliza el substrato o-fenilendiamina (OPD) y para la
enzima fosfatasa alcalina, el substrato más utilizado es el p-
nitrofenilfosfato (pNPP).
- Solución frenadora: Se utiliza para detener la reacción, los más
utilizados son HCl, H2SO4, NaOH, H2O, dependiendo del tipo de enzima
utilizada en el conjugado.

Métodos no competitivos
1- Placa cubierta con antígeno
Se conoce también como ELISA Indirecta para determinación de
anticuerpos. Esta técnica mide los niveles de anticuerpos del paciente
contra un antígeno específico. El antígeno especiíico de la prueba es
fijado en el soporte-fase sólida. Se agrega la muestra del paciente, si el
paciente tiene anticuerpos específicos para dicho antígeno se forma un complejo Ag-Ac que es detectado por un segundo
anticuerpo que es una anti-gammaglobulina marcada con una enzima. Luego es adicionado el substrato específico para la
enzima, observándose el desarrollo del color el cual puede ser medido en un espectofotómetro. La intensidad del color es
proporcional a la concentración de Acs en la muestra del paciente.

- Ensayo inmunoenzimático para la detección cuantitativa y/o cualitativa de anticuerpos IgG contra antígeno
de superficie de hepatitis B (HBs)

La determinación de anticuerpos anti-HBs es el último marcador en aparecer durante la

seroconversión, es un importante factor en la evaluación de recuperación de la infección por
el HBV y también en el screening de los programas de inmunización.

Este ensayo está basado sobre un ensayo inmunoenzimático (IEMA), donde las muestras de
los pacientes son incubadas junto con antígeno HBsAg conjugado con peroxidasa (HRPO) en
los pozos que contienen HBsAg. Durante la incubación los anticuerpos forman un sándwich con el antígeno marcado y el no
marcado con la enzima. Se lava para retirar el material no unido. La enzima residual es activada en la fase sólida. Se agrega
la solución buffer sustrato-cromógeno (Buffer fosfato-citrato en Tetrametilbenzidina-TMB) y se detiene la reacción con
solución de parada (H2SO4 1N). La intensidad del color desarrollada es medida usando un espectofotómetro a 450 nm o 405
nm.

Técnica
Materiales y procedimiento:
Micropozos fijados con HBsAg subtipos ad y ay
Calibradores
Controles positivo y negativo
Sueros de pacientes
Conjugado (HbSAg subtipos ad y ay conjugados con peroxidasa (HRPO))
Diluyente de muestra
Solución de lavado (PBS-Tween 20 concentrada): diluir 1:10 en agua destilada antes de usar
TMB cromógeno
Buffer sustrato-citrato
Solución de parada (H2SO4 1N)
Micropipetas
Puntas
Incubadora 37°C
Cámara húmeda

1) Llevar todo los reactivos a temperatura ambiente

2) Preparar el número de pozos requeridos, incluyendo blanco, controles y calibradores
3) Diluir los sueros de los pacientes 1:10 (50µl de suero en 450µl de diluyente)
4) Pipetear 50µl de cada muestra diluída 1:10, controles positivo y negativo y calibradores sin diluir en cada pozo
5) Agregar 200µl del conjugado (HBsAg conjugado con HRPO) a cada pozo excepto el pozo del blanco
6) Tapar e incubar la placa 3 horas a 37°C en cámara húmeda
7) Lavar 6 con solución de lavado (350µl por pozo)
8) Secar la placa y agregar 200µl por pozo de solución sustrato-cromógeno preparada inmediatamente antes de
servir, así: v/v cromógeno/buffer sustrato en oscuridad
9) Incubar 20 minutos a 37°C en cámara húmeda
10) Servir 100µl de solución de parada por pozo
11) Leer la absorbancia a 450 nm e informar los resultados
Esquema IEMA – Anticuerpos IgG anti-HBsAg

- Ensayo inmunoenzimático para la detección de IgG anti Rubeola

La rubeola es una infección viral contagiosa de carácter leve que afecta principalmente a niños y adultos jóvenes. Se
caracteriza por un exantema eritematoso maculopapuloso de 2-3 días de duración. Puede presentarse asintomático. Es
importante la detección de anticuerpos específicos durante el embarazo porque una primo infección podría causar aborto o
mortinato o en el feto puede producir daños congénitos.

Esta prueba está diseñada para la detección de anticuerpos de la clase IgG anti rubeola en suero humano. Los pocillos están
cubiertos con antígenos del virus de rubeola, luego se agrega el suero humano diluido donde ocurre la reacción específica
antígeno-anticuerpo. Se agrega anti-IgG humana (anti-cadena gamma) producida en cabra y marcada con peroxidasa
(HRPO). La reacción se revela por la adición de buffer sustrato-cromógeno (Tetrametilbenzidina-TMB) y se detiene la
reacción con solución de parada (H2SO4 1N). La intensidad del color desarrollada es medida usando un espectofotómetro a
450 nm o 405 nm.

Técnica
Materiales y procedimiento:
Micropozos fijados con antígeno inactivado de virus de rubeola
Calibradores
Controles positivo y negativo
Sueros de pacientes
Conjugado (Anti-IgG humana (anti cadena gamma) conjugada con peroxidasa (HRPO))
Diluyente de muestra
Solución de lavado (PBS-Tween 20 concentrada): diluir 1:10 en agua destilada antes de usar
TMB cromógeno
Solución de parada (H2SO4 1N)
Micropipetas
Puntas
Incubadora 37°C
Cámara húmeda

1) Llevar todo los reactivos a temperatura ambiente

2) Preparar el número de pozos requeridos, incluyendo blanco, controles y calibradores
3) Diluir los sueros, control positivo y negativo 1:10 (10µl de suero en 200µl de diluyente)
4) Servir en cada pozo 100µl de las muestras diluidas y 100 µl del diluyente como blanco de la prueba
5) Incubar la placa a 37°C durante 25 minutos en cámara húmeda
6) Lavar con solución de lavado 5 veces y secar la placa
7) Servir 100µl de conjugado por pozo
8) Incubar 25 minutos a 37°C en cámara húmeda
9) Lavar son solución de lavado 5 veces y secar la placa
10) Servir 100µl de TMB cromógeno por pozo
11) Incubar 15 minutos a 37°C en cámara húmeda
12) Servir 50µl de solución de parada
13) Leer la absorbancia a 450 nm e informar los resultados

IMMUNOCOMB:

Es un ensayo inmunoenzimático indirecto en fase sólida. La fase sólida

es un peine con 12 proyecciones (dientes), cada diente tiene 2 sitios:
arriba se encuentra inmunoglobulina humana y abajo el antígeno
específico de la prueba. En un plato se encuentran 6 filas con 12 pozos
cada una (para cada diente). Se debe mover el peine de fila a fila
esperando un tiempo definido en cada una. El plasma/suero del paciente
se pone en la fila A, donde se inserta primero el peine. Si hay
anticuerpos presentes se van a adherir a los antígenos del peine de la parte de abajo y de la mitad. Los componentes que
no se unieron son lavados en la fila B. en la fila C se encuentran anticuerpos marcados con una enzima contra anticuerpos
humanos, los cuales se van a pegar a los anticuerpos de la parte de abajo y a la inmunoglobulina humana que sirve de
control en la parte de arriba. En las siguientes 2 filas los componentes son de nuevo lavados, y en la fila F la enzima
reacciona con su sustrato cromógeno. Se observa entonces color azul en los dientes del peine. Esta prueba es muy útil en el
diagnóstico rápido de patologías como hepatitis B.

- Immunocomb para la detección de anticuerpos anti-HBs

1) Servir 100µl de cada muestra, control positivo y control negativo en la Fila A – Diluyente
2) Insertar el peine
3) Incubar 2 horas a 37°C en cámara húmeda
4) Lavar – Fila B –
5) Insertar peine en Fila C: HBsAg biotilinado – incubar 30 minutos a 37°C
6) Insertar peine en Fila D: Estreptoavivinda unida a fosfatasa alcalina – incubar 20 minutos a 37°C
7) Lavar – Fila E - 2 minutos
8) Insertar peine en Fila F: Sustrato cromogénico BCIP (5-bromo-4cloro-3-indol fosfato) en NTB (Nitro azul de
tetrazolium) – incubar 10 minutos a 37°C
9) Detener la reacción – Fila E – 1 minuto
10) Leer e informar resultados
 - Immunocomb para la detección de antígeno de superficie de Hepatitis B (HBs) 90 minutos

Etapa Fila Procedimiento

Captura de antígeno A Servir 100µl de cada muestra, control positivo y control negativo – Diluyente
Incubar 60 minutos a 37°C
Lavado B Mezclar e incubar 2 minutos

Unión con anti-Hbs C Incubar 10 minutos a 37°C

biotilinado

Unión de avidina- D Incubar 10 minutos a 37°C

fosfatasa alcalina

Lavado E Mezclar e incubar 2 minutos

Reacción de color F Incubar 10 minutos a 37°C

Detener la reacción E Mezclar e incubar 2 minutos

Leer e informar resultados

INMUNOFLUORESCENCIA:

Es una técnica muy sensible que permite detectar pequeñas

cantidades de anticuerpos que estén fijados a células o tejidos o en
suero o plasma. Gracias a esta técnica se ha logrado descubrir por
ejemplo que las células plasmáticas son las que producen los
anticuerpos y ha permitido agilizar diagnósticos para implementar una
terapia adecuada más rápida. Se usa un anti-Ac marcado con una
fluoresceína, que en el momento de la reacción se fijará a su Ag que
es la inmunoglobulina de la muestra que se desea detectar. Puede ser
directa o indirecta, es directa cuando el antígeno se localiza por el Ac
que ha sido marcado previamente con fluoresceína. En la indirecta es necesario un anticuerpo que reaccione con el antígeno
pero además un anti-Ac marcado que reaccione contra el anticuerpo anterior. Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el
antígeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta.

Inmunofluorescencia Indirecta para detección de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii o anti-Trypanosoma cruzi

Aplicación: esta prueba se utiliza como ayuda para el diagnóstico del lupus sistémico eritematoso y el lupus inducido por
fármacos. Sin embargo, también puede ser positivo en casos de escleroderma, enfermedad de Raynaud, síndrome de
Sjögren, artritis reumatoide, síndrome de los anticuerpos antifosfollípidos y otras enfermedades autoinmunes. Por este
motivo, el lupus sistémico eritematoso es difícil de diagnosticar y la prueba de los anticuerpos antinucleares se debe
completar con otras pruebas con objeto de descartar otras enfermedades autoinmunes.

Interpretación: un resultado positivo de este test sugiere la presencia de una enfermedad autoinmune, aunque en algunas
personas mayores, los resultados pueden ser positivos en ausencia de enfermedad autoinmune. Aproximadamente el 95%
de los pacientes con lupus sistémico eritematoso dan positivo a la prueba de los anticuerpos antinucleares. Si además, el
paciente presenta síntomas de artritis, rash o trombocitopenia, el diagnóstico del lupus es muy probable. La confirmación se
puede conseguir mediante dos pruebas adicionales, los anticuerpos anti-DNA de doble cadena, y los anticuerpos anti-SM

Otras condiciones que pueden producir un resultado positivo de la prueba de los anticuerpos antinucleares son:
 Síndrome de Sjögren: entre el 40 y el 70% de los pacientes con
este síndrome tienen un resultado positivo en la prueba de los
anticuerpos antinucleares. Sin embargo, el diagnóstico de este
síndrome debe ser confirmado mediante pruebas adicionales
como las pruebas de los anticuerpos a las ribonucleoproteínas
SSA y SSB. En particular la prueba de los autoanticuerpos a
SSA es positiva en el 90% o más de los pacientes con
síndrome de Sjögren si esta prueba se realiza por
enzimainmunoensayo
Escleroderma: entre el 60 y 90% de los pacientes con
escleroderma dan positivo a la prueba de los anticuerpos
antinucleares. En los pacientes con esta condición, algunas
pruebas adicionales pueden ayudar a distinguir entre las dos
formas de escleroderma
También puede dar positivo el test de los anticuerpos antinucleares en la enfermedad de Raynaud, la artritis juvenil
crónica y el síndrome de los anticuerpos antifosfolípido.
Otras enfermedades en las que se encuentran títulos elevados de anticuerpos antinucleares son la hepatitis crónica,
la enfermedad vascular del colágeno y muy ocasionalmente, en algunas enfermedades del tiroides

Un resultado negativo descarta prácticamente el diagnóstico del lupus sistémico eritematoso.

QUIMIOLUMINISCENCIA:

La quimioluminiscencia consiste en la producción química de luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias
capaces de emitir luz cuando, al absorber la energía de una reacción química oxidativa, son colocadas en un estado de
excitación electrónica. La emisión de luz se produce al volver a su estado inicial y la energía química absorbida se cede en
forma de fotones fácilmente cuantificables con un fotodetector.

Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de isótopos radiactivos en el inmunoanálisis, pues los
compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisión de luz sólo se produce cuando se provoca la reacción
oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes.

Tipos de quimioluminiscencia:

- Quimioluminiscencia directa: marcaje de sustancias sólidas con éster de acridina (quimioluminiscente) recubiertas
los Acs específicos contra la sustancia a analizar.
- Quimioluminiscencia indirecta: emplea como marcaje una enzima y produce una fuerte emisión de luz.

SEPARACION DE LT Y LB A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA HUMANA:

Los linfocitos son semejantes morfológicamente, pero son heterogéneos en cuanto a densidad, su movilidad electroforética,
vida media y respuesta a mitógenos. A nivel funcional existen varias subpoblaciones que participan por separado o en
conjunto en la respuesta inmune. Los linfocitos se pueden identificar de acuerdo con una serie de marcadores característicos
que se expresan con un gran número de moléculas de superficie diferentes. En la actualidad, muchos de estos marcadores
celulares pueden ser detectados mediante anticuerpos monoclonales específicos.

Los LT se pueden distinguir según sus diferentes receptores de antígeno (TCR) que caracterizan a las subpoblaciones de las
células T, aunque también existen ciertas moléculas de superficie que se expresan en todas las células T (marcadores pan-
T) y en algunos casos en otras líneas celulares (por ejemplo NKC), un buen ejemplo de los mismos es CD2 como receptor
para glóbulos rojos de carnero, permitiéndoles que in vitro formen rosetas espontáneas, in vivo y en circunstancias normales,
esta molécula junto con el complejo TCR-CD3 y otras glucoproteínas de membrana, colabora con la activación de las células
T.

Los LB presentan inmunoglobulinas de membrana que son sintetizadas por la misma célula y se encuentran insertadas en la
membrana celular en donde actúan como receptores de antígeno específicos. Estos receptores pueden ser detectados en la
superficie de las células maduras mediante anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes y específicos de la
inmunoglobulina en cuestión. Cuando las células se tiñen en frío, se observa sobre la célula B una fluorescencia con aspecto
anular. Los anticuerpos divalentes frente a las inmunoglobulinas de superficie se unen a los receptores de superficie y los
entrelazan, dando lugar a parches de inmunoglobulinas distribuidos por la superficie celular. Cuando las células son
sometidas a calentamiento, la mayoría de estos complejos se desplaza a lo largo de la superficie celular y se acumula en un
extremo de la célula, observándose entonces una especie de caperuza. Una vez formada esta caperuza, la inmunoglobulina
penetra en el interior de la célula donde es degradada.

De la población linfoide periférica humana, 50-80% forman rosetas espontáneas, 15-20% exhiben Ig de superficie de la clase
IgM e IgD y 2-10% no tienen marcadores ni para T ni para B, esta población corresponde a los linfocitos "nulos" que podrían
comprender la población celular implicada en linfocitotoxicidad y/o células precursoras de LT y/o LB.

Separación de células mononucleares

(linfocitos y monocitos) a partir de sangre
periférica a través de un medio de alta
densidad (Ficoll-Hypaque densidad 1.077
mg/dL) por centrifugación a baja velocidad
Plasma y plaquetas

Células mononucleares
Ficoll-Hypaque

Polimorfonucleares y glóbulos rojos

Bibliografía
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