Adaptación y supervivencia de Brucella en la encrucijada del metabolismo y la virulencia

Resumen

La nutrición bacteriana ''In vivo'', es decir, la naturaleza de la red metabólica y sustrato(s) utilizado(s)
por las bacterias dentro de su huésped, es un aspecto fundamental de los estilos de vida patógenos
o simbióticos. Un ejemplo típico son los Brucella spp., patógenos intracelulares facultativos
responsables de infecciones crónicas de animales y humanos. Su virulencia se basa en su capacidad
para modular la respuesta inmune y la fisiología de las células huésped, pero el ajuste fino de su
metabolismo en el huésped durante la infección parece cada vez más crucial. Aquí revisamos nuevas
ideas sobre los vínculos entre la virulencia de Brucella y el metabolismo, señalando la necesidad de
investigar ambos aspectos para descifrar las estrategias infecciosas de Brucella.

1. Introducción

Con el fin de colonizar con éxito un huésped, las bacterias simbióticas y patógenas tienen que ser
capaces de ocupar nic Brucella spp. son patógenos intracelulares Gram negativos filogenéticamente
relacionados con simbiontes vegetales como las Rhizobiaceae. A menudo se conoce como ''insectos
desagradables'' debido a sus características inusuales de virulencia, o como ''Mr Hides'', en referencia a su
capacidad sigilosa para evadir la detección inmune, son patógenos zoonóticos importantes, ya que son capaces
de inducir infecciones crónicas de animales y humanos hos metabólicos específicos dentro de su
huésped. De hecho, cada vez es más evidente que la detección de las fuentes de carbono disponibles
y las adaptaciones metabólicas relacionadas están íntimamente vinculadas a la expresión coordinada
de otros determinantes de la virulencia, como los factores de colonización. Sin embargo, con la
excepción de algunos progresos recientes en bacterias modelo, la base mecanicista de esta
coordinación todavía se entiende frustrantemente mal. Aquí, revisamos la corriente sobre los
vínculos existentes entre el metabolismo y la virulencia de un patógeno intracelular particular:
Brucella.
1.1. Brucella, un desagradable Mr ''Hides''

. Sólo en América Latina, la pérdida económica anual en la producción animal a partir de la brucelosis se ha
estimado en más de $600.000.000 . Durante las últimas décadas, los esfuerzos para resolver el complejo
rompecabezas de la virulencia de Brucella se han centrado en factores de virulencia ''clásico'', o factores
bacterianos que interactúan directamente con los componentes del huésped. A pesar de un creciente
conocimiento de las estrategias moleculares utilizadas por este patógeno para interactuar con las células
huésped durante su ciclo infeccioso, todavía estamos lejos de entenderlo. Además, una nueva pieza de este
rompecabezas, olvidada durante mucho tiempo, ha llegado a la vista: el metabolismo bacteriano.

2. Brucella virulencia y metabolismo: dos lados de la misma Moneda.

El panorama global que emerge de lo que se sabe sobre la virulencia de Brucella es una adaptación
extremadamente eficiente para protegerse del reconocimiento inmune y manipular aspectos clave de la
fisiología de las células anfitrionas, por ejemplo la apoptosis y el tráfico vacuolar. También se ha hecho cada
vez más evidente, aunque todavía mal considerado, que una de las claves para la adaptación in vivo exitosa de
un patógeno es su capacidad para afinar el metabolismo para utilizar nutrientes específicos encontrados en
cada nicho ocupado por Brucella durante el ciclo infeccioso.

Un aspecto de la fisiología de los Brucellae que se entiende particularmente mal es la arquitectura y la

regulación de las vías metabólicas centrales. Según investigaciones bioquímicas pioneras, así como datos
genómicos más recientes, las hexósis pueden ser catabolizadas a través de la vía pentosa-fosfato (PP) y una vía
glucólítica Incompleta Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), como Brucellae parecen carecer de una
fosfotúctoquinasa incompleta. Sin embargo, en algunos casos, las funciones predichas a partir del análisis
genómico no están de acuerdo con los resultados del análisis bioquímico de la función metabólica in vivo. Por
ejemplo, mientras que el análisis genómico indicó que Brucellae lleva dos genes pronosticados para codificar
enzimas de la vía Entner-Doudoroff (ED) (gluconato-6-fosfato dehydratasa y 2-ceto-3-desoxigluconato
aldolasa), no se podría detectar actividad de deshidratasa de fosfato gluconato-6 in vitro. Esto también es
cierto para las dos enzimas de la derivación de glioxilato (isocitrato de lelasa y malato sintasa), cuya actividad
nunca se ha demostrado. Las hexosis se pueden metabolizar aún más a través de lo que parece ser un ciclo de
ácido tricarboxílico totalmente activo (TCA).(pregunta 5)

Sin embargo, cabe mencionar que las hexósis no son las fuentes de carbono preferidas para las tres especies
de Brucella mejor caracterizadas: B. abortus, B. melitensis y B. suis. En su lugar, estas bacterias utilizan
preferentemente un alcohol de azúcar de cuatro carbono (eritritol), cuyo catabolismo produce un fosfato de
trío. En resumen, la imagen real de la red metabólica central de Brucella spp. parece ser: (i) ciclos activos de PP
y TCA, (ii) vías potencialmente activas de ED y glioxilato (iii) un EMP interrumpido.

Debe tenerse en cuenta que la descripción anterior refleja lo que se sabe acerca de las tres especies
principales de Brucella más investigadas. A medida que se disponga de nuevas secuencias genómicas, las
diferencias de especies en esta red metabólica sin duda surgirán como se ilustra, por ejemplo, por la
seudonización en B. ovis de algunos genes del eritritol catabólico y los operons de transporte o del gen
fosfoenol piruvato carboxiquinasa (pckA) implicado en el primer paso de la gluconeogénesis.

Si bien es probable que estas diferencias sean de interés para entender las diferencias de especies entre las
Brucellae, debido a la caracterización bioquímica limitada de estas especies adicionales, centraremos nuestra
revisión en tres especies de Brucella mejor caracterizadas.

La información anterior describe la posible ''arquitectura'' de la red metabólica central de Brucellae. Sin
embargo, a partir de este ''blueprint'', podemos obtener un poco sobre las vías metabólicas funcionales y nada
sobre el potencial de Brucellae para adaptar su metabolismo a las condiciones en el huésped. Sin embargo, las
primeras pistas sobre la naturaleza del metabolismo in vivo de Brucella fueron proporcionadas por la
identificación de cepas mutantes atenuadas.

2.1. Los mutantes metabólicos son frecuentes entre los mutantes atenuados

Estudios previos, con el objetivo de identificar factores de virulencia en B. abortus o B. melitensis mediante la
detección de mutantes transposicionales atenuados en el modelo celular o el modelo de ratón de infección,
revelaron un vínculo entre la persistencia de Brucella en sus huéspedes y su metabolismo. De hecho, varios
sistemas de transporte y degradación de carbohidratos parecen ser esenciales para la supervivencia de
Brucella. Los transportadores cuya función pronosticada es la aceptación de aminoácidos o péptidos también
parecen ser necesarios durante la infección. Estos hallazgos sugieren que los carbohidratos, pero también los
aminoácidos y péptidos, podrían estar disponibles como fuentes de energía y/o carbono en algunos puntos
durante el proceso infeccioso.

Se puede esperar que algunas de estas fuentes de carbono sean metabolizados a través de la vía PP, ya que
entre los mutantes metabólicos atenuados, varios están deteriorados en un gen que codifica una enzima de
esta vía (ver Fig. 1, cajas n6). Esto es consistente con el hecho de que Brucella parece carecer de una
fosfoructoquinasa, para una glucólisis 'clásica'' EMP [18].

Por consiguiente, se sospecha que la vía del PP es crucial para la degradación del azúcar, además de ser
esencial para la generación de precursores de biomasa como la ribosa necesaria para la síntesis de novo de
purinas y pirimidinas.

Además, los mutantes en los reguladores globales que afectan al metabolismo se atenúan, haciendo hincapié
en el hecho de que Brucella tiene que adaptar sus funciones metabólicas (incluyendo su metabolismo central)
para una infección exitosa.

Por ejemplo, los mutantes De B. melitensis y B. suisrsh con una respuesta estricta deteriorada se atenúan
gravemente [28]. Recientemente se ha demostrado en Alpha proteobacterias estrechamente relacionadas con
Brucella (a saber, Sinorhizobium meliloti y Rhizobium etli) que la respuesta estricta a la limitación de nitrógeno
o carbono no sólo regula la expresión de genes que codifican vías biosintéticas o catabólicas (proteínas,
aminoácidos, nucleótidos y lípidos) sino que también tiene un impacto en la expresión de genes que codifican
las funciones del metabolismo central (PP y VÍAs EMP). Además, tres mutantes en el sistema de
fosfotransferasa de carbohidratos de fosfoenolpiruvato brucela (PTS) también se ven afectados en su
virulencia (ver más abajo). Mutantes similares en S.meliloti se vieron afectados en su metabolismo del carbono
y en su capacidad para hacer frente al estrés nutricional.

2.2. Una adaptación profunda y progresiva del metabolismo central se produce cuando Brucella entra y
persiste en su nicho intracelular.

Dos estudios recientes ilustran además la adaptación metabólica central realizada por Brucella durante la
infección intracelular. En el primero, el proteome de B. suis se analizó en los macrófagos J774 a 48 h después
de la infección (PI) y se comparó con el proteome de B. suis en la fase estacionaria temprana en un medio rico
[32]. La mayoría de las 44 proteínas producidas diferencialmente están involucradas en el metabolismo
primario (metabolismo estrictamente necesario para la supervivencia) de Brucella, entre los cuales nueve
están relacionados con el metabolismo central (ver Fig. 1, cajas 1). Los resultados sugieren que a 48 h PI
Brucella tuvo una actividad glucolítica restringida y un aumento de la gluconeogénesis. Además, la liasa
isocitrato (AceA) y la malato sintasa (AceB), dos enzimas pertenecientes a la derivación de glioxilato, fueron
reguladas. La derivación de glioxilato actúa como una vía anaplótica para el ciclo Krebs, proporcionando
succinato y malato de acetil-CoA e isocitrato. Por lo general, una derivación funcional de glioxilato permite que
las bacterias crezcan en ácidos grasos, que por lo tanto podrían convertirse en una fuente de carbono
importante para B. suis durante la infección, como se ha informado para Mycobacterium tuberculosis .

El segundo estudio añade una dimensión temporal a la adaptación fisiológica. Utilizando los macrófagos RAW
264.7, Lamontagne et al. realizaron un análisis proteome en B. abortus en tres puntos de tiempo: 3 h PI
(cuando las bacterias están internalizadas pero aún no han alcanzado el nicho replicativo), 20 h PI (cuando han
escapado de la ''carga' microbicida inicial e iniciado una replicación activa) y 44 hPI (cuando alcanzaron el
máximo de su número intracelular). Noventa proteínas se produjeron diferencialmente en B. abortus y la
mayoría de ellas participaron en el metabolismo primario, de las cuales siete están involucradas en el
metabolismo central (ver Fig. 1 para las cajas de puntos de tiempo de 3 horas 7). La reducción de la producción
de enzimas del metabolismo central del carbono (ciclo TCA, piruvato y vía PP), y de los sistemas de transporte
de la toma de azúcar sugiere que hay un suministro limitado de azúcar al comienzo de la infección. En este
momento, el catabolismo de aminoácidos que alimenta el TCA podría ser la alternativa privilegiada para
derivar los precursores necesarios. En momentos posteriores, una vez en el compartimento derivado de ER, la
vía PP estaría activa sugiriendo un reabastecimiento de azúcares.

Por lo tanto, estos experimentos in vivo que revelan adaptaciones metabólicas dinámicas durante la infección
celular, fueron particularmente valiosos, ya que desenmascararon una flexibilidad metabólica que no podría
haber sido predicha utilizando condiciones clásicas de crecimiento in vitro.

2.3. Los principales reguladores de la virulencia actúan como reguladores metabólicos '' y vice etversa''

Las adaptaciones metabólicas descritas anteriormente permiten a Brucella soportar la amplia gama de
condiciones ambientales existentes dentro de un huésped y sus células. En respuesta a las condiciones
encontradas en cada etapa específica del ciclo infeccioso, se necesita un ajuste fino estricto y coordinado de la
expresión génica, mientras que las funciones innecesarias (o que ya no son necesarias) se desactivan en
consecuencia. La expresión de genes de virulencia generalmente se rige por vías de señalización y mecanismos
reguladores similares a los que controlan los genes que no son específicos de la patogénesis. Estas vías de
señalización a menudo se basan en la fosforilación reversible de proteínas (sistema de dos componentes o
sistema de fosfoenolpiruvato dependiente de la fosfotransferencia de azúcar) o reguladores globales
especializados que actúan a una célula individual o a nivel de población.

2.3.1. El sistema crítico de dos componentes BvrS/R.

El sistema de dos componentes BvrS/R (TCS) es una vía de señalización que consiste en una histidina (BvrS)
unida a la membrana y su correspondiente regulador de respuesta (BvrR). Tras la detección de un estímulo
ambiental específico (aún desconocido), BvrS autofosforila sobre un residuo de histidina conservado y media la
transferencia del grupo de fósforo a un aspartato conservado de BvrR.

Este último coordina la respuesta celular, a través de la expresión diferencial de los genes diana. El TSEns/R
BvrS/R es esencial para la virulencia. La inactivación transposicional conduce a defectos en la fijación, invasión
y replicación intracelular [34]. Un análisis transcriptomico reciente reveló un claro impacto de la mutación bvrR
en la expresión de genes relacionados con carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos y metabolismo del
nitrógeno [35]. Entre los genes regulados en el mutante bvrR se encuentran la fosfoenolpirpiruvato
carboxiquinasa (pckA) que codifica la primera enzima en gluconeogénesis, y cuatro genes implicados en el ciclo
de TCA y el metabolismo de piruvato (ver Fig. 1, cajas 3). Inicialmente se pensó para regular la homeostasis y la
estructura de la envoltura celular de Brucella (proteínas de membrana externa (Omp), lipoproteínas, LPS,
varios transportadores de perilasmáticos), el BvrR / BvrS TCS parece afectar a una gama más grande de
fenotipos relacionados con las funciones metabólicas que potencialmente median la adaptación a un estilo de
vida intracelular.

Sin embargo, cabe mencionar que para el mutante de transposón bvrR utilizado para los estudios discutidos
anteriormente, siguen existiendo preguntas sobre si la inserción de transposon condujo a una pérdida o
ganancia de la función BvrR, ya que los intentos de crear interrupciones genómicas definidas o mutaciones
nulas no tuvieron éxito, lo que provocó su designación como gen esencial. Observaciones similares se hicieron
para Agrobacterium tumefaciens y S. meliloti homólogos de bvrR. La mutación en estos TCS impide el
crecimiento de las bacterias en medios complejos y un mutante nulo sólo se puede obtener en medios
mínimos. Además, el homólogo de bvrR en S. meliloti (chvI) es estrictamente necesario para el crecimiento en
más de 21 fuentes de carbono diferentes y el mutante bvrR crece mal en un medio mínimo, reforzando así el
vínculo entre este metabolismo TCS y S. meliloti. Si los efectos de la mutación transposicional bvrR en la
envolvente celular (Omp y transportadores) es la consecuencia o la causa de estos defectos de crecimiento
queda por investigar mediante la identificación de los objetivos directos del regulador. El enlace potencial de
este TCS con el metabolismo se discutirá más adelante en paralelo con el sistema de fosfotransferasa (PTS).

2.3.2. La sensación del cuórum y la inanición.

La sensación de quórum (QS) es un sistema regulador que permite a las bacterias coordinar la
expresión génica a nivel de población de acuerdo con la densidad celular bacteriana local a través de
la síntesis individual y la sensación de moléculas de señal difusible. También se sabe que la sensación
de quórum participa en la regulación de los determinantes de la virulencia de Brucella,
principalmente vinculados a la superficie celular (sistema de secreción de tipo IV, flagelo, proteínas
de membrana externa y exopolisacárido). Sorprendentemente, los análisis transcriptómicos y
proteómicos recientes han avelado que la inactivación de vjbR y babR, dos reguladores QS, tiene un
fuerte impacto en los genes involucrados en el metabolismo y particularmente en los genes que
codifican enzimas del ciclo TCA y la glucólisis (Fig. 1, cajas 4 y 5 respectivamente). Curiosamente,
VjbR y BabR regulan conjuntos superpuestos de genes diana de una manera opuesta, lo que sugiere
que QS podría tener un efecto de reorganización global en los procesos metabólicos centrales. No se
pudo observar ningún retraso en el crecimiento de las cepas mutantes de vjbR y babR a través de un
cultivo líquido o sólido en medios ricos. Sin embargo, las diferencias en el crecimiento de estos
mutantes se reportaron en medios definidos, dependiendo de la fuente de carbono disponible.
Colocarse en un contexto intracelular, en la vacuola, la sensación de un ''Quorum'' para Brucella
podría significar la sensación de difusión limitada debido a la limitación de espacio. Eso corresponde
a ''invernes'''. Se puede sugerir que QS está directa o indirectamente involucrado en el ajuste del
metabolismo de Brucella. De hecho, al ralentizar el metabolismo básico de Brucella, QS (a través de
VjbR) evitaría la multiplicación hasta que se alcance el compartimiento replicativo derivado de ER.
Posteriormente, el regulador BabR podría desempeñar un papel en la reactivación del metabolismo
basal. Se formuló una propuesta similar para el BvrS/R TCS [17,35]. Por lo tanto, tanto el TS BvrS/R
como el sistema QS podrían contribuir a la adaptación de la red metabólica durante el cambio de
nutrientes que enfrenta Brucella a lo largo de su continuo de tráfico intracelular. Estos dos sistemas
reguladores parecen estar conectados, ya que BvrR tiene un efecto activador en la transcripción de
vjbR [35,44]. Sin embargo, todavía no se sabe si esta activación es directa o si está mediada a través
de otros mecanismos globales de observación de la hambruna, como la respuesta estricta y/o el
sistema PTS.

2.3.3. El sistema fosfoenolpiruvinato fosfotransferasa (PTS) – un eslabón faltante.

Los sistemas de PTS están muy extendidos entre las bacterias. Activado por fosfoenolpirpiruvato
(PEP), este sistema generalmente consiste en dos proteínas de acoplamiento de energía
citoplasmática (Enzima I y HPr), así como varias enzimas específicas de carbohidratos II, que catalizan
la translocación concomitante de carbohidratos y fosforilación [46].

El estado de fosforilación de los componentes de PTS refleja tanto la disponibilidad de carbohidratos

como las condiciones energéticas de la célula.

En muchas bacterias, el PTS y sus proteínas asociadas convierten esta información en señales, que
luego se transdulan a través de diferentes mecanismos (interacciones alostéricas, fosforilación) y
conducen a fenómenos como la represión catabolizada y el control del inductor [46,47]. El PTS
proporciona a las bacterias un sistema integrado que garantiza una utilización óptima de los
carbohidratos en entornos complejos, una característica que es particularmente importante en la
interacción huésped-bacteria [1,48,49]. En lugar de un PTS clásico, algunas bacterias han
evolucionado sistemas paralelos que sirven funciones estrictamente regulatorias. Entre estos
sistemas se encuentran los llamados ''Nitrógeno PTS'', que se cree que vinculan los metabolismos del
carbono y el nitrógeno, pero no parecen catalizar el transporte de sustratos, ya que carecen de las
permeasas de PTS [50–53]. Brucella spp., A. tumefaciens, S. meliloti y otras a-proteobacterias
poseen un sistema de PTS de nitrógeno, y sus respectivos pts mutantes fueron mostrados
previamente como deteriorados para la interacción con el huésped [25,54,55]. En todas las
aproteobacterias patógenas o simbióticas, tres genes pts (hprK, ptsM y ptsO) se encuentran aguas
abajo de los genes del sistema de dos componentes conservados (bvrS/R, exoS/chvI) esenciales para
la infección o simbiosis [34,38]. Esta organización genómica conservada sugiere un vínculo funcional
entre BvrS/R y el PTS [53,56]. Recientemente dos documentos corroboraron este vínculo al mostrar
(i) que los genes pts mencionados anteriormente están co-transcritados con los genes bvrS/R y (ii)
que el gen hprK está regulado en el mutante bvrR:Tn5 [35]. Además, un estudio proteómico con un
mutante B. abortus bvrR [57] reveló que BvrR regula el complejo de 2-oxo-glutarate deshidrogenasa
que convierte 2-oxoglutarate en succinyl-CoA en el ciclo TCA. Recientemente se demostró que la
subunidad SucA de la misma enzima interactúa con el PTS EIIAMan como proteína codificada por el
propio ptsM ubicado en el locus conservado específico mencionado anteriormente. Tanto los
mutantes bvrR como los pts tienen un crecimiento inalterado en los medios ricos líquidos, pero
muestran un crecimiento restringido o abolido en un medio mínimo con fuentes de carbono
definidas. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que el PTS de Brucella detecta el estado metabólico
de la célula (al percibir entre otros la relación de PEP/piruvato y la fructosa 1,6-bifosfato) que
conduce a una regulación coordinada de los metabolismos De y N y así como algunos genes clave de
virulencia (por ejemplo, los genes virpero on, flagelare ...). Esto probablemente implica hablar entre
sí con el sistema de dos componentes BvrS/R. Curiosamente, tanto el bvrR como un pts mutant
(ptsP) parecen compartir la capacidad de regular la expresión del regulador QS VjbR, que a su vez
regula los determinantes de la virulencia y el metabolismo (ver arriba).

3. Lo que NO se sabe sobre el metabolismo central de Brucella: desafíos para el siglo en curso.

Por supuesto, este artículo no es una revisión exhaustiva de todos los enlaces que conectan la
virulencia y el metabolismo de Brucella. Nuestro enfoque es principalmente el metabolismo central,
omitimos algunos vínculos conocidos (es decir, la reciente identificación del regulador del gen virB
HutC o el papel de la respuesta estricta en la regulación del sistema crucial de secreción tipo IV [28].
En un futuro próximo es probable que se descubran otras conexiones. Un gran avance vendrá sin
duda del campo en evolución de la regulación basada en el ARN. Considerados durante mucho
tiempo sólo como macromoléculas informativas, los pequeños ARN (ARN son cada vez más
reconocidos como reguladores importantes de la expresión génica que permiten la rápida
adaptación del crecimiento celular en respuesta al estrés y los cambios en el medio ambiente. Estos
ARNs posteriores a la expresión génica modulan transcripción la expresión génica, principalmente a
través del emparejamiento de base con los ARNM objetivo, regulando así los niveles relativos de
traducción o decadencia [59]. Además, los propios ARN mensajeros pueden actuar como sensores
directos del estado físico o metabólico de la célula a través de su región de 50 no traducidas (5'-UTR)
que sufren cambios estructurales al unir metabolitos (riboswitch). La alteración de la conformación
de la estructura del ARNm afecta a la expresión de la transcripción descendente [60]. En conjunto,
estos ARN están muy extendidos en bacterias y regulan las vías metabólicas, la utilización de la
fuente de carbono y la composición de la membrana [61]. Además, su participación directa o
indirecta en la regulación de los genes de virulencia y en la relación huésped-patógeno es cada vez
más clara [62,63].

Con respecto al impacto de estos ARNS en el metabolismo o la virulencia de Brucella, esto es casi
''terra incognita''. Sin embargo, debido al papel reconocido de Hfq en facilitar la acción del ARN sRNA
y la importancia de esta proteína de unión al ARN en la adaptación a Brucella, las posibilidades son
altas de que la regulación del ARN brucela se sitúe en el centro, como ha sido recientemente el caso
de otros patógenos bacterianos intracelulares como Listeria monocytogenes o Legionella
pneumophila.

https://drive.google.com/file/d/17YipURVJ92A8pge2_0EFqZYYbQQDxtDU/view