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Microtecnica de Aglutinacion en Gel
Microtecnica de Aglutinacion en Gel
2
PRÓLOGO
La microtécnica de aglutinación en gel representó un avance cuántico en
cuanto a la inmunohematología. En una época en la cual las enfermedades
transmisibles dominaban el interés de quienes trabajaban en Medicina
Transfusional, ésta técnica vino a centrar nuevamente la atención en la
inmunohematología: centro focal de la transfusión de sangre.
La rapidez, facilidad de empleo y sensibilidad de la microtécnica de
aglutinación en gel permiten resolver las complejas situaciones planteadas
en pacientes que presentan aloinmunización antieritrocitaria y requieren
soporte transfusional o cursan un embarazo.
No obstante, la microtécnica en gel requiere aplicar cuidadosamente los
procedimientos recomendados a los efectos de obtener resultados
confiables y reproducibles.
3
“En memoria de mi querido viejo:
José Golffed”.
(12.12.1928 - 14.03.1998)
4
PREFACIO
5
Argentina por permitirme nombrar la marca del producto y autorizarme a
reproducir fotografías de insumos y aplicación de las técnicas.
6
“Un libro abierto es un cerebro que habla; cerrado, un amigo que espera;
olvidado, un alma que perdona; destruido, un corazón que llora”.
Proverbio hindú.
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MICROTÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN
GEL.
INTRODUCCIÓN.
Fue así que en la década de los ´80, el Dr. Yves Lapierre desarrolla y patenta
el método de hemaglutinación en gel, el cual fue comercializado por la
empresa Diamed-Suiza a partir del año 1988.
DiaMed Suiza fue fundada en 1977 por un pequeño grupo de expertos en
diagnóstico de laboratorio para el desarrollo y fabricación de sistemas de
prueba destinada a proporcionar a los laboratorios la facilidad de uso,
seguridad y fiabilidad.
En el año 2007 Bio-Rad Laboratories, una empresa multinacional vinculada a
la investigación biológica fundada en 1952, adquiere el paquete accionario de
DiaMed Holding AG.
8
El Sistema DiaMed de Micro Tipificación en Gel revolucionó el trabajo en
los laboratorios de inmunohematología de los grupos sanguíneos.
Ha sido desarrollado tanto para la determinación de grupo sanguíneo,
investigación, identificación, titulación de anticuerpos irregulares y pruebas
de compatibilidad sanguínea pretransfusionales en un nuevo formato cuya
lectura no admite dudas de interpretación y más aún permite nuevas lecturas
hasta 48 horas después de la ejecución de la prueba.
El catálogo ID-System de Bio-Rad reúne 65 variedades de tarjetas de gel con
una gama que abarca la determinación de grupos sanguíneos ABO y Rh D
para donantes, pacientes y recién nacidos, prueba inversa, fenotipo Rh, Kell,
antígenos simples, test de coombs directo, investigación e identificación de
anticuerpos irregulares, pruebas de compatibilidad y estudios en medio
enzimático entre otras aplicaciones.
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PRINCIPIO DEL MÉTODO.
10
FORMA DE LOS MICROTUBOS.
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El fondo del microtubo tiene aspecto “CÓNICO”. Cuando los hematíes
atraviesan la columna de gel durante la fase de centrifugación forman un
punto en el fondo del mismo según sea el gradiente de aglutinación.
ASPECTO DE LA TARJETA
GEL ESPECÍFICO.
12
COMPOSICION DEL GEL
NEUTRO ESPECÍFICO
Sin antisuero específico. Mezcla de gel y antisuero
Contiene NaCl. específico.
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VOLÚMENES A DISPENSAR
ID-PIPETOR FP-4
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CONDICIONES DE INCUBACIÓN.
CONDICIONES DE CENTRIFUGACIÓN.
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Una vez finalizada la misma, la lectura macroscópica permite distinguir todo
el rango de aglutinaciones: desde los resultados negativos (-) hasta toda la
variedad de resultados positivos que se expresan en forma de cruces según su
intensidad en: 1+,2+,3+,4+ y dp (doble población).
Dado que la fuerza “g” se expresa en “rpm” (revoluciones por minuto) y que
disponemos de centrífugas con cabezales para 6,12 y 24 tarjetas, las “rpm”
varían para cada equipo, a saber:
La técnica de gel tiene la capacidad de separar los hematíes del fluido que lo
rodea.
Durante la centrifugación de la tarjeta, los hematíes son removidos fuera de la
suspensión por acción de la fuerza centrífuga e ingresan al gel, en tanto que
las inmunoglobulinas no conjugadas permanecen sobre el gel.
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Cada tarjeta de gel tiene en su reverso un código de barras para su
identificación.
Si bien la macrolectura es posible, un lector automático y con un software
especial, permite visualizar en pantalla los resultados y también transcribirlos
a una impresora con lo cual acotamos los errores administrativos.
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PATRONES DE LECTURA
REACCIÓN 4+
Las células rojas aglutinadas forman una banda sólida en la parte superior del
gel.
REACCIÓN 3+
REACCIÓN 2+
REACCIÓN 1+
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REACCIÓN NEGATIVA
Todas las células rojas atraviesan el gel y forman un botón celular bien
definido en la base del microtubo.
DOBLE POBLACIÓN.
La reacción de doble población también conocida como campo mixto se
caracteriza por una banda de células rojas aglutinadas en la parte superior de
la columna de gel en tanto que las células no aglutinadas se depositan en el
fondo del microtubo. Un ejemplo de doble población se observa en detalle en
la tarjeta de la página 22.
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Microtubo #5: reacción negativa Microtubo #6: reacción negativa.
OTRAS CONSIDERACIONES.
¿PLASMA O SUERO? :
20
Se desaconseja la congelación y descongelación de sueros, dado que durante
esa práctica, se destruyen proteínas e inmunoglobulinas.
Por tal motivo, se sugiere conservar los sueros en estudio en forma de
alícuotas congeladas.
DILUYENTES.
Diluyente 1:
21
La papaína suele emplearse para el tratamiento enzimático de los hematíes
antes de su uso, en tanto que la bromelina se utiliza además como reactivo
aditivo.
22
“El elefante muerto deja sus colmillos; el tigre su piel, y el hombre, su
nombre”.
Anónimo.
23
REACCIÓN SEROLÓGICA DE
AGLUTINACIÓN
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Las reacciones antígeno - anticuerpo son exotérmicas, por tanto a
temperaturas más bajas la velocidad de reacción disminuye y existe
menor fijación de anticuerpo.
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Efecto de la temperatura en la morfología del antígeno.
b) pH
Las modificaciones de pH pueden afectar las uniones electrostáticas.
Se desconoce el pH óptimo de la mayoría de los anticuerpos de grupo
sanguíneo, pero se presume que se aproxima al rango fisiológico.
Ciertos anticuerpos como ser los anti M, reaccionan mejor a pH por
debajo de 7.
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A un pH inferior al punto isoeléctrico, el anticuerpo tiene carga
positiva.
Esto facilita la unión con los hematíes (que tienen carga superficial
negativa), por tanto el pH óptimo para la fase de sensibilización estaría
entre 6,5 y 7.
Un marcado descenso en el pH, incrementa la disociación de los
complejos antígeno – anticuerpo.
La solución salina fisiológica tiene un pH que oscila entre 5 y 6.
La solución salina amortiguada (PBS o Solución Salina Buffer Fosfato
por su sigla en inglés) asegura óptimas condiciones de trabajo para los
estudios serológicos.
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Es más probable que se produzca la sensibilización cuando el
anticuerpo se presente en una concentración elevada. Esto puede
lograrse aumentando la proporción de suero en relación a la de
hematíes.
A tener en cuenta:
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Los iones Na+ (con carga positiva) de la solución salina fisiológica son
atraídos por la carga negativa de los hematíes y forman la capa interna
y los iones Cl- (con carga negativa) forman la capa externa.
El potencial eléctrico que se desarrolla entre la carga negativa de los
hematíes y las capas iónicas es lo que se conoce con el nombre de
potencial Z.
Este debe ser superado para que se produzca la aglutinación.
e) Tiempo de incubación
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Segunda etapa: AGLUTINACIÓN
Hematíes aglutinados.
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Cuando la reacción antígeno – anticuerpo es mediada por anticuerpos de tipo
IgM, las dos etapas (sensibilización y aglutinación) se superponen y se
observa fácilmente la aglutinación resultante.
Los anticuerpos de tipo Ig M son moléculas grandes (pentámeros de
inmunoglobulinas) de elevado peso molecular y de gran carga neta, lo que les
posibilita cubrir la distancia adyacente entre un hematíe y otro, estableciendo
puentes de unión entre ellos.
31
Tratamiento enzimático de los hematíes.
32
CUADRO COMPARATIVO DE
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
33
La solución de baja fuerza iónica (LISS: Low Ionic Strength Solution)
aumenta notablemente la velocidad de sensibilización de los hematíes y sus
respectivos anticuerpos.
En comparación con la solución salina normal (0,17 M) la solución LISS
tiene una molaridad de 0,03 M.
b) Temperatura.
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arrastrados a través de la membrana por la acción de anticuerpos
pasando así a formar agrupaciones.
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PRUEBA ANTIGLOBULÍNICA HUMANA
El principio de esta prueba fue descrito por Moreschi en 1908 pero fue
en el año 1945 cuando Coombs, Mourant y Race la aplicaron para
detectar la fijación de anticuerpos que no provocan el fenómeno de
aglutinación.
Esta prueba emplea anticuerpos contra globulinas humanas y se
denomina “Prueba Antiglobulina Humana”.
Todas las moléculas de anticuerpo son globulinas.
En inmunohematología, las pruebas antiglobulínicas producen
aglutinación visible de los hematíes sensibilizados.
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Test Antiglobulina Humana Directo practicado en ID-Card
37
Esta prueba se aplica, entre otros, para:
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REACTIVOS ANTIGLOBULÍNICOS HUMANOS.
Anti-IgG.
Contiene anti-IgG sin actividad anti-complemento (no necesariamente
específico para cadenas gamma).
Anti-C3b.
Sólo contiene anticuerpos anti-C3b sin actividad anti-
inmunoglobulínica.
NOTA: el anticuerpo que se produce en respuesta a la inmunización
generalmente se dirige contra el determinante antigénico que se
encuentra en la sub-unidad C3c; algunos profesionales lo denominan
“anti-C3c” pero en el rótulo del envase se debe designar como anti-
C3b.
Anti-C3d.
Sólo contiene anticuerpos anti-C3d sin actividad-inmunoglobulínica.
Anti-C4b.
Sólo contiene anticuerpos anti-C4b sin actividad anti-
inmunoglobulínica.
Anti-C4d.
Sólo contiene anticuerpos anti-C4d sin actividad anti-
inmunoglobulínica.
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MECANISMO DE SENSIBILIZACIÓN DE
ERITROCITOS CON COMPLEMENTO.
40
Mecanismo de adsorción. La droga se fija a las proteínas de la
membrana eritrocitaria. Si el paciente desarrolla anticuerpos antidroga
potentes, éstos reaccionan con el fármaco fijado. En consecuencia la
prueba de Coombs Directa con reactivos anti-IgG es positiva. En
general el complemento no se activa y la lisis es sobre todo
extravascular. La droga prototípica es la penicilina.
41
Mecanismo de acción del reactivo antiglobulina humana.
42
“Un experto es una persona que ha cometido todos los errores que se
pueden cometer en un determinado campo”.
Niels Bohr.
Físico danés
1885 - 1962
43
Pruebas en ID-Card Liss/Coombs
ID-Diluyente 2 1.0 ml
+
44
(*) En caso de utilizar sangre tomada del segmento de tubuladura se
aconseja realizar un lavado con solución salina fisiológica previo a su
suspensión en el diluyente 2.
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A continuación se muestra un ejemplo:
46
Ejemplo:
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III) INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES
(SCREENING o TAMIZAJE)
48
Para los sistemas Rh, MNSs, Duffy y Kidd la dotación antigénica debe estar
presente en forma homocigota. También han de estar presentes los antígenos
Lewis y el raro antígeno Kpa.
49
7. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-
Centrifugue.
8. Lea y registre los resultados.
50
51
Según sea el patrón de reacciones y la configuración de antígenos, puede
llegarse a dilucidar el o los anticuerpos involucrados.
Si existe una reacción positiva a todos los hematíes que conforman el panel,
un autocontrol positivo, pero uno o más hematíes que muestren una reacción
positiva más intensa que el autocontrol, deben cumplirse pruebas adicionales
en la muestra para estudiar la posibilidad de un aloanticuerpo subyacente.
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4. Transfiera de cada vial numerado del 1 al 11, una gota (50µl) a cada
microtubo igualmente numerado.
5. En el último microtubo (número 12) destinado a autocontrol (AC),
pipetee 50µl de la propia suspensión de hematíes.
6. Agregue a todos los microtubos 25µl del plasma o suero del paciente o
donante en estudio.
7. Incube ambas tarjetas durante 15 minutos a 37°C en el ID-Incubator.
8. Centrifugue ambas tarjetas durante 10 minutos en la ID-Centrifuge.
9. Lea y registre los resultados en la tabla de antígenos.
EFECTO de DOSIS
53
54
Según el patrón de las reacciones y la configuración de los antígenos,
el tipo de anticuerpo presente puede identificarse en la mayoría de los
casos, tenga presente que la reacción del microtubo de autocontrol debe
dar resultado negativo.
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Pruebas en ID-Card NaCl
Enzime Test and Cold Agglutinins
Esta tarjeta es apta para la detección de anticuerpos reactivos en técnica salina
y enzimática, a saber:
Introducción:
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No se considera necesario incluir la prueba salina a temperatura ambiente en
las pruebas de rutina de detección de anticuerpos, pero la prueba salina a 4°C
puede emplearse para detectar aglutininas frías.
ID-Diluent 2 1.0ml
+
Hematíes concentrados 10µl
o
Antes de su uso, deje que los reactivos de eritrocitos de prueba ID, los
diluyentes ID, y las muestras de suero o plasma alcancen la temperatura
ambiente (salvo para aglutininas frías).
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A continuación describiremos el procedimiento de las pruebas.
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reactivo A1, A2, B y O. Quite el papel aluminio de todos los
microtubos identificados.
3. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba ID-DiaCell ABO
(A1, A2, B y O) en los microtubos identificados a tales efectos.
4. Añada 50µl de plasma o suero del paciente o donante a cada
microtubo.
5. Incube la tarjeta ID-Card durante 10 minutos a temperatura ambiente,
entre 18 y 25°C.
6. Centrifugue la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la ID-
Centrifugue.
7. Lea y registre los resultados obtenidos.
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1. Marque los microtubos correspondientes de la ID-Card “NaCl, enzime
test and cold agglutinins” con el nombre o número del paciente o
donante en estudio.
2. Quite el papel aluminio de todos los microtubo que vaya a utilizar.
3. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba “ID-DiaPanel I-II-III
P” papainizados en los microtubos correspondientes identificados
como I, II y III.
4. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la propia suspensión
de eritrocitos del paciente en el microtubo destinado como AC (Auto
Control) y agregue 25µl de ID-Papaín (**).
5. Añada 25µl de plasma o suero del paciente o donante a cada
microtubo.
6. Incube la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37°C en el ID-
Incubator.
7. Centrifugue la tarjeta ID-card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.
8. Lea y registre los resultados obtenidos.
Antes de su uso coloque las tarjetas ID-Card “NaCl,enzime test and cold
agglutinins” en la heladera (4°C ±2) durante dos horas.
Mantenga refrigerados hasta el momento de la prueba tanto los hematíes “ID-
Cell I-II-III” como el suero o plasma a analizar.
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3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la propia suspensión
de eritrocitos del paciente en el correspondiente microtubo.
4. Añada 25µl de plasma o suero del paciente a cada microtubo.
5. Incube la tarjeta ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4°C±2).
6. Centrifugue la ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.
7. Lea y registre los resultados obtenidos.
61
Identificación de Anticuerpos.
1. Marque dos tarjetas “ID-Card, enzime test ando cold agglutinins” con el
nombre o número del paciente o donante y numere los microtubos del 1 al
11 (12 en caso de incluir autocontrol). Quite el papel de aluminio.
2. Pipetee 50µl de cada tipo de eritrocitos de prueba “ID-DiaPanel” en los
microtubos correspondientes marcados del 1 al 11.
3. Si va a incluirse un autocontrol, pipetee 50µl de la suspensión de eritrocitos
del paciente en el microtubo número 12.
4. Añada 25µl de plasma o suero del paciente o donante a cada microtubo.
5. Incube las tarjetas ID-Card durante 30 minutos en la heladera (4°C±2).
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6. Centrifugue las tarjetas ID-Card durante 10 minutos en la ID-Centrifugue.
7. Lea y registre los resultados en la cartilla de antígenos.
En la detección de anticuerpos:
63
En la identificación de anticuerpos:
En la prueba de compatibilidad:
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IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES (*)
65
“Es más fácil juzgar el talento de una persona por sus preguntas que por sus
respuestas”.
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Comportamiento Serológico e Importancia
Clínica de los Anticuerpos de Grupo
Sanguíneo.
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68
69
70
“En este mundo, todos necesitamos de todos”
O.R.L. uruguayo.
71
ALOINMUNIZACIÓN
Claro está que una prueba de compatibilidad negativa no impide una eventual
inmunización, como así también los eventos transfusionales y el embarazo no
acarrean la misma suerte de inmunización.
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Un elemento a tener en cuenta en la posibilidad de aloinmunización por
transfusión radica en la FRECUENCIA con que un antígeno se presenta en
la población.
73
La probabilidad de aloinmunización a distintos antígenos es muy variada en
comparación con el antígeno D, para el cual existe el tratamiento preventivo
de la misma por administración de globulina hiperinmune anti D capáz de
evitarla.
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IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
Para decidir cuáles serán los estudios a practicar al suero “problema”, a que
hematíes enfrentarlos (con o sin tratamiento enzimático) y a que temperatura
incubar las pruebas, se debe tener en cuenta los resultados obtenidos en la
etapa de investigación de aloanticuerpos.
También es fundamental recabar datos tales como:
* edad
* sexo
* raza
* transfusiones y/o trasplante de órganos recibidos
* diagnóstico clínico
* medicación que recibe
* número de embarazos
* abortos
* recién nacidos con EHRN
* administración de IgG anti Rh D
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Cada panel es acompañado de una cartilla de trabajo en las que están
consignados los antígenos presentes en cada muestra o vial.
El uso de los mismos requiere experiencia y claros conocimientos del
comportamiento serológico de los diferentes anticuerpos de grupo sanguíneo.
A la derecha del panel podemos observar los resultados que arrojaron los
estudios en diferentes medios y temperaturas ensayados.
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Para este ejemplo, se eliminan los antígenos presentes en las muestras
número 2 (antígenos c, e ,K ,k ,Fy b), número 3 (C, c, e, k y Fy a) y
número 6 (E, c, e, k, Fy b).
COMENTARIOS:
77
exaltados por el uso enzimático mientras que los anticuerpos de los sistemas
Duffy y MNSs son inhibidos por las mismas.
Es posible recurrir a estudios con muestras de eritrocitos suplementarios que
presentan el antígeno cuyo anticuerpo se quiere confirmar y que no presentan
los demás antígenos imputados.
De esa manera se incrementa el poder discriminatorio.
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Ejemplo # 2: de identificación de aloanticuerpo.
4°- No existen más muestras que resulten ser negativas. Las muestras
número 2, 5 y 6 son positivas en todos los medios y temperaturas. El o los
anticuerpos sospechados; pueden ser el anti E y/o anti Le b.
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Dicho en otros términos: ¿qué tienen en su composición antigénica en común,
las muestras número 2, 5 y 6?
Muestra número 2: E negativa Le b positivo.
Muestra número 5: E positiva Le b negativo.
Muestra número 6: E positiva Le b positivo.
Estos resultados nos orientan a la presencia de más de un anticuerpo.
D C E c e Cw K k Le a Le b M N
0 0 0 + + 0 + + 0 + +
80
Algoritmo de Investigación de Anticuerpos Irregulares utilizado por el
Laboratorio de Inmunohematología del
Servicio Nacional de Sangre.
81
Algoritmo de Identificación de Anticuerpos Irregulares utilizado por el
Laboratorio de Inmunohematología del
Servicio Nacional de Sangre.
82
TEST de COOMBS.
Algoritmo utilizado en el Laboratorio de Inmunohematología del
Servicio Nacional de Sangre.
83
FORMULARIO PARA REMITIR ESUDIO
ESPECIALIZADO AL S.N.S
84
CARACTERES DE LA MUESTRA Y CONDICIONES DE
ENVÍO DE LAS MISMAS PARA LA REALIZACIÓN DE
ESTUDIOS EN INMUNOHEMATOLOGÍA. (*)
85
La solicitud deberá ser firmada por un funcionario debidamente
autorizado a tales efectos. En caso de que la solicitud sea realizada por un
Servicio de Hemoterapia que no sea de ASSE, la solicitud deberá contener la
autorización correspondiente para abonar el costo del estudio.
86
No se facilitarán resultados por vía telefónica. Los resultados se podrán
retirar en RECEPCIÓN en el plazo estipulado, generalmente 24 horas,
aunque en situaciones especiales el estudio podrá requerir más tiempo. En
caso de urgencia en disponer del resultado del estudio solicitado, los
Servicios se deberán comunicar con el Técnico Transfusionista del
Laboratorio de Inmunohematología para anticipar la entrega del
RESULTADO.
87
Modelo de Informe de Estudio
Inmunohematológico.
88
CÁLCULO DE PROBABILIDADES
La probabilidad mide la mayor o menor posibilidad de conseguir unidades
compatibles para un receptor y toma valores entre 0 y 1 ó expresados en
porcentaje entre 0% y 100%.
Vale decir que por cada 100 unidades de sangre tomadas al azar, tendremos la
posibilidad de conseguir 23 con el fenotipo Jk (a-b+). O lo que es igual, por
cada 10 unidades testeadas, encontraremos 2,3 unidades Jk a-.
89
Pacientes aloinmunizados a múltiples antígenos.
Ejemplo 1:
N% = F1 x F2 x …….FX
100
90
Donde:
Ejemplo 2:
91
“El éxito es hijo seguro de la perseverancia y firmeza en el trabajo”.
92
TIPIFICACIÓN ABO Rh D
Para asegurar que se tomen las medidas terapéuticas apropiadas, los hematíes
de los pacientes DVI deben considerarse como Rh D NEGATIVO.
93
Los que plantean dudas son aquellas muestras que no aglutinan en forma
inmediata o directa.
En algunos eritrocitos D positivos, la demostración del antígeno D requiere
incubación con anti D y el agregado ulterior de suero antiglobulina humana
(test de coombs indirecto).
En el pasado, los hematíes que demandaban pasos adicionales para la
demostración del antígeno D, se clasificaban como “Du”.
Esta designación ya no se considera apropiada y los hematíes portadores
de antígenos que reaccionan débilmente con el anti D, podrían describirse
como “D débil” y son considerados Rh D POSITIVOS.
94
Los eritrocitos que carecen del complejo antigénico D, se denominan “D
mosaicos”, “D variantes”, siendo en la actualidad la denominación “D
parcial” como la más apropiada.
95
CLASIFICACIÓN ABO-Rh EN PACIENTES:
O……………. 46%
A……………. 41%
B…………… 9%
AB…………. 4%
96
Preparación de la muestra de sangre:
Procedimiento de la prueba:
Positivo: Los hematíes aglutinados forman una línea roja sobre la superficie
del gel o están dispersos en el gel.
97
Las reacciones más débiles que +++ pueden indicar sub-grupos A o B y
deben realizarse estudios adicionales.
Para una interpretación correcta debe realizarse una determinación completa
del grupo (prueba hemática y prueba sérica inversa).
Importante: el microtubo control (ctl) debe mostrar una reacción negativa, de
lo contario la prueba no es válida para la determinación ABO.
Reacciones para Rh D:
Observaciones:
Para dar por válidos los resultados, el control negativo siempre debe mostrar
una reacción negativa.
Si el control negativo (ctl) arrojara reacción positiva, lave inicialmente los
eritrocitos en estudio con solución salina templada o bien con ID-Diluent 2
antes de preparar la suspensión de eritrocitos.
Si a continuación, el control negativo muestra resultado negativo, las
reacciones pueden interpretarse y darse por válidas.
Si la reacción del control negativo persiste en su positividad, los resultados
ABO/Rh no son válidos y deben realizarse estudios ulteriores para saber la
causa que originó la discrepancia.
98
CLASIFICACIÓN ABO – Rh EN RECIÉN NACIDOS:
99
bromelina), con una incubación de 10 minutos a temperatura
ambiente.
Esto permite la determinación directa de la mayor parte de los antígenos
D débiles (D weak).
O bien:
MUESTRA de SANGRE:
Procedimiento de la prueba:
100
Interpretación de los resultados:
Reacciones para Rh D:
Observaciones:
101
Si el control “ctl” permanece aún positivo, no se puede asegurar la
interpretación de los resultados del grupo sanguíneo ABO y Rh D y será
necesario ampliar el estudio.
El anti-D monoclonal incluído en la tarjeta “DiaClon ABO/Rh for newborns”
fue seleccionado para que reaccionara con la variante DVI.
Tenga en cuenta que algunas variantes DVI pueden dar reacciones muy
débiles.
102
CLASIFICACIÓN ABO – Rh EN DONANTES DE SANGRE:
O……………. 46%
A……………. 41%
B…………… 9%
AB…………. 4%
103
El antígeno D consta de numerosos epitopos y en el modelo de 9 epitopos, los
eritrocitos DVI carecen de todos ellos salvo tres.
Esto significa que los individuos con fenotipo DVI pueden producir anti-D
contra los epitopos ausentes tras la inmunización por eritrocitos Rh D
positivos fetales o procedentes de una transfusión.
Para asegurarse que se toman las medidas terapéuticas adecuadas, los
eritrocitos de pacientes DVI deben considerarse como “Rh negativos”.
A la inversa, la sangre de donantes debe analizarse con un anti-D que detecte
la variante DVI y considerar a los portadores de la variante como “Rh
positivos”, para evitar su transfusión a pacientes Rh (D) negativos o D
parciales.
Procedimiento de la prueba:
104
Interpretación de los resultados:
Reacciones para Rh D:
105
Observaciones:
Para dar por válidos los resultados, el control negativo siempre debe mostrar
una reacción negativa.
Si el control negativo (ctl) arrojara reacción positiva, lave inicialmente los
eritrocitos en estudio con solución salina isotónica o ID-Diluent 2 antes de
preparar la suspensión de eritrocitos y proceda a reiterar la prueba.
Si a continuación, el control negativo muestra resultado negativo, las
reacciones pueden interpretarse y darse por válidas.
Si la reacción del control negativo persiste en su positividad, los resultados
ABO/Rh , CDE no son válidos y debe realizarse estudios ulteriores para saber
la causa que originó la discrepancia.
106
Anti-DVI+ Anti-DVI- Interpretación
+++ a ++++ +++ a ++++ Rh D positivo
± a ++ ** ± a ++ ** Rh D débil
negativo negativo Rh D negativo
+ a ++++ negativo DVI+ *
negativo + a ++++ DVI- *
107
CARACTERIZACIÓN DEL TIPO “D PARCIAL” POR TEST EN GEL.
108
DETERMINACIÓN DE LOS FENOTIPOS Rh y KELL:
C ………. 70%
c ………. 80%
E ………. 30%
e………. 98%
109
El microtubo “ctl” es el control negativo.
MUESTRAS:
CONTROLES:
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:
110
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
111
El antígeno C puede expresarse muy débilmente en sujetos Cw+ o en
otros fenotipos con expresión deprimida del antígeno C.
En estas raras circunstancias pueden observarse reacciones débiles o
negativas.
El antígeno Kpa en posición cis debilita la expresión de los antígenos
K.
112
ESTUDIO DE UNA EMBARAZADA:
113
MUESTRA de SANGRE:
Una vez obtenidas las muestras de plasma o suero por centrifugación, deberán
conservarse refrigeradas a 4°C por un máximo de 48 horas. Transcurrido ese
lapso, congelarlas a -20°C.
Controles:
Deben incluirse muestras positivas y negativas conocidas de acuerdo con las
normas de garantía de calidad aplicables.
Procedimiento de la prueba:
114
1. Identifique la tarjeta ID-Card con el número o nombre de la paciente.
2. Retirar la lámina de sellado solo de aquellos microtubos que se vayan a
utilizar manteniendo la ID-Card en posición vertical.
3. Pipetear 12.5µl de la suspensión de hematíes de la gestante en los tres
primeros microtubos (anti-A, anti-B, anti-D) de la tarjeta.
4. Dispensar 50µl de cada “ID-Cell I-II-III” en los microtubos 4, 5 y 6 de
la tarjeta.
5. Agregar 25µl de plasma o de suero de la gestante en los microtubos 4,
5 y 6.
6. Incubar la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37°C en la ID-
Incubadora.
7. Transcurrido ese tiempo, centrifugar la tarjeta durante 10 minutos en la
ID-Centrífuga.
8. Lea y registre las reacciones.
Positivo: los hematíes forman una línea roja sobre la superficie del gel o
están dispersos en el gel.
Reacciones para Rh D.
115
(*)Las reacciones débiles, las trazas o ± están sujetas a una ampliación del
estudio para distinguir entre los tipos D parciales y D débiles.
El suero anti-D de esta tarjeta no reacciona con las variantes DVI.
Un antígeno Rh D débil puede dar una reacción negativa.
Si se la tarjeta se utiliza para el estudio de pacientes y/o gestantes, recuerde
que la mayoría de las guías NO recomienda ampliar el estudio para
determinar fenotipos D débiles o D parciales.
Cuando se observe una reacción positiva con todos los hematíes test
“ID-DiaCell I-II-III”; se aconseja realizar un autocontrol (en una
tarjeta Liss/Coombs).
116
LIMITACIONES EN LOS PROCEDIMIENTOS REALIZADOS
EN LAS TARJETAS ID-Card
117
“Todo error deja una enseñanza, toda enseñanza deja experiencia y
toda experiencia deja una huella”.
Anónimo.
118
PROTOCOLO DE SEGUIMIENTO
INMUNOHEMATOLÓGICO DE LA GESTACIÓN.
119
En suma: lo primordial es determinar si la gestante tiene o no
anticuerpos irregulares, independientemente si es Rh (D) positiva o
negativa.
Si presenta anticuerpos, se los debe identificar para saber si pueden
causar EHFN o no.
En caso de carecer de anticuerpos irregulares, interesa el factor Rh (D).
Si es Rh (D) positiva no son necesarios más controles, pero en caso de
resultar ser Rh (D) negativa, se deberán repetir los estudios
inmunohematológicos entre las semanas 25 y 28 de la gestación.
120
ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE E.H.F.N EN EL
EMBARAZO
121
“Invertir en conocimiento produce siempre los mejores intereses”
Benjamín Franklin.
(1706-1790).
122
EPÍLOGO
Dirección
123
Definiciones útiles
Aglutinina: anticuerpo.
Aglutinógeno: antígeno.
124
Anticuerpo caliente: anticuerpo cuyo rango ideal de acción se ubica en el
orden de los 37°C.
Autoaglutinina: aglutinina que reacciona con los propios hematíes del sujeto
en el cual se encuentra.
125
Determinante antigénico: llamado también epitopo, comprende el sitio
particular de un antígeno que determinas la especificidad de la reacción
antígeno – anticuerpo.
126
ID-Card: término comercial con el que se conoce a las tarjetas para trabajo
en inmunohematología utilizando el sistema MTS (Micro Typing System).
Liss: sigla en inglés del reactivo de Solución de Baja Fuerza Iónica (Low
Ionic Strength Solution).
127
sanguínea, inhibe la participación del ion Ca++ en la cascada de la
coagulación de la sangre.
128
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA.
129
21.Microplacas: SU APLICACIÓN EN INMUNOHEMATOLOGÍA
BÁSICA DE BANCO DE SANGRE. Dra. Elena Franco 1998.
22.Manual de Técnicas Básicas en Hemoterapia. Jorge Golffed.
Oficina del Libro A.E.M 1992.
23.Enfermedad Hemolítica Perinatal. Dr. Jorge Decaro. Laboratorio
Clausen .2003.
24.MEDICINA TRANSFUSIONAL PERINATAL. Dr. Jorge Decaro.
Laboratorio Clausen. 2011.
25.Transfusion Medicine. Second Edition. Jeffrey McCullough. Editorial
Elsevier. 2005.
26.GUÍA SOBRE LA TRANSFUSIÓN DE COMPONENTES
SANGUÍNEOS Y DERIVADOS PLASMÁTICOS. Sociedad Española
de Transfusión Sanguínea. 2006.
27.Instrucciones de Uso. DiaMed-ID Micro Typing System. DiaMed
Argentina S.A.
28.Handbook of Transfusion Medicine. Robert G. Westphal, M.D.
American Red Cross. 1990.
29.Hemotherapy of the Infant and Premature. American Assiciation of
Blood Banks. 1983.
30.Hemolytic Disease of the Newborn. American association of Blood
Banks. 1984.
31.Página web: www.diamed.com
32.Página web: www.biorad.com/inmunohematology (para consultas
sobre los “insertos” de las diferentes ID-Card).
33.Instrucción Técnica. Hospital son Llátzer. Govern de les Illes Balears.
2007.
34.“Investigación de Anticuerpos Irregulares” por los Técnicos Miguel
Gómez y Sergio Ramos.
35.Diccionario de Inmunología. W.J. Herbert y P.C. Wilkinson Editorial
JIMS. 1974
36.UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER. Manual Técnico
de Camilo Andrés Valderrama Carrasco. Tesis de Pregrado. 2008.
130
Í N D I C E
131
60. Prueba en salino a 4°C (ID-Cell I-II-III)
62. Identificación de anticuerpos
62. Prueba enzimática con eritrocitos papaínizados ID-DiaPanel P)
62. Prueba salina a 4°C (ID-DiaPanel)
63. Interpretación de los resultados
63. Principios y consideraciones generales
72. Aloinmunización
75. Panel de antígenos eritrocitarios
76. ¿Cómo interpretar los resultados de un panel eritrocitario?
81. Algoritmo de investigación de anticuerpos irregulares
82. Algoritmo de identificación de anticuerpos irregulares
83. Algoritmo del Test de Coombs
84. Formulario para remitir estudio especializado al Servicio Nacional de
Sangre
85. Caracteres de la muestra y condiciones de envío de las mismas para la
realización de estudios en inmunohematología
88. Modelo de informe de estudio inmunohematológico
89. Cálculo de probabilidades
90. Pacientes aloinmunizados a múltiples antígenos
93. Tipificación ABO Rh D
96. Clasificación ABO-Rh en pacientes
99. Clasificación ABO-Rh en recién nacidos
103.Clasificación ABO-Rh en donantes de sangre
109. Determinación de los fenotipos Rh y Kell
113. Estudio de una embarazada
117. Limitaciones en los procedimientos realizados en las tarjetas ID-Card
119. Protocolo de seguimiento inmunohematológico de la gestación
121. Algoritmo diagnóstico de E.H.F.N. en el embarazo
123. Epílogo: Dra. Lourdes Viano.
124. Definiciones útiles
131. Índice
132
“Libros, caminos y días dan al hombre sabiduría”.
Proverbio árabe.
Montevideo - Uruguay
© Jorge Golffed
Reservados todos los derechos
ISBN 978-9974-99-524-6
Miguelete 1881
www.print.com.uy
133