PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Ensayo por Inmunoabsorción Ligada a Enzimas

PASO 1.- Preparación de reactivos

 Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (18° - 30°C) por al menos 15 – 30
minutos.
 Verificar el concentrado de buffer de lavado debido a la presencia de cristales, resolubilizar mediante
calentamiento a 37°C hasta disolver los cristales.
 Diluir el buffer de lavado 1 a 20 con agua destilada.
 Solo emplear recipientes limpios para diluir el buffer.

PASO 2.- Numeración de los pozos

 Colocar las tiras requeridas en el soporte de placas y numerar la cantidad de pozos incluyendo los tres
controles positivos (uno para el HIV1, uno HIV2 y uno para los controles de HIV Ag por ejemplo E1, F1, G1) y
uno en blanco (por ejemplo, A1, no se debe adicionar al pozo en blanco ni muestras ni conjugado-HRP). Usar
solo la cantidad de pozos requeridos.

PASO 3.- Adición del reactivo CONJUGATE 1: Adicionar 25 microlitros de anticuerpos anti-HIV biotinado dentro de
cada pozo.

Paso 4.- Adición de muestras: Adicionar 75 microlitros de controles positivos, controles negativos y especímenes
dentro de sus respectivos pozos (Nota: a fin de evitar la contaminación cruzada usar distintos Tips para cada
espécimen, control negativo o positivo).

Paso 5.- Incubación (1): Cubrir la placa con la lámina e incubar por 60 minutos a 37°C.

Paso 6.- Lavado (1): Al término de la incubación, retirar y desechar la lámina que cubre la placa. Lavar cada pozo 5
veces con el buffer de lavado diluido. En cada lavado dejar que los micropozos se remojen por 30 segundos. Luego
del ciclo final del lavado voltear la placa sobre papel absorvente y golpear suavemente para remover los residuos de
líquidos.

Paso 7.- Adición del reactivo CONJUGATE 2: adicionar 100 microlitros de conjugado-HRP dentro de cada pozo.

Paso 8.- Incubación (2): Cubrir la placa con la lámina e incubar por 30 minutos a 37°C.

Paso 9.- Lavado (2): Luego del término de la incubación, retirar y descartar la lámina que cubre la placa. Lavar cada
pozo 5 veces con buffer de lavado diluido como en el paso 5.

Paso 10.- Coloración: Dispensar 50 microlitros del CHROMOGEN SOLUTUION A y 50 microlitros del CHROMOGEN
SOLUTUION B dentro de cada pozo incluyendo el blanco, cubrir la placa con la lámina y mezclar golpeando suavemente
la placa. Incubar la placa a 30°C por 15 minutos evitando la luz. La reacción enzimática entre las soluciones de
cromógeno y el HRP produce un color azul en el control positivo y HIV 1+2 positivo para pozos de muestra
antígenos/anticuerpos.

Paso 11.- Parada de la reacción: retirar y descartar la lámina que cubre la placa. Empleando una pipeta multicanal o
manualmente, adicionar 50 microlitros de reactivo STOP SOLUTION dentro de cada pozo y mezclarlo suavemente. Se
desarrolla un color amarillo intenso en controles positivos y HIV 1+2 reactivos o positivo para pozos de muestras
antígenos/anticuerpos.

Paso 12 Medición de la absorbancia: Calibrar el lector de placas con el pozo blanco y leer la absorbancia a 450nm. Si
se emplea un instrumento de filtro dual, establecer la referencia de longitud de onda a 630nm. Calcular el valor del
Cut-off y evaluar los resultados. (Nota. Leer la absorbancia dentro de 15 minutos luego de parar la reacción).
 COMPONENTES DEL KIT

 MICROPLACA

12 tiras x 8 pozos por placa. Cada placa contiene antígenos recombinantes del HIV

 CONTROL NEGATIVO (1 vial)

Liquido amarillo llenado en un vial de tapa rosca color verde 1.2 ml por vial

 ANTICUERPO CONTROL POSITIVO-1 (HIV 1) (1 vial)

Liquido de color amarillo llenado en un vial de tapa rosca color azul 1.2 ml por vial

 ANTICUERPO CONTROL POSITIVO-2 (HIV 2) (1 vial)

Liquido de color amarillo llenado en un vial de tapa rosca color rojo 1.2 ml por vial

 ANTIGENO CONTROL POSITIVO (1 vial)

Liquido de color amarillo llenado en un vial de tapa rosca color amarillo 1.2 ml por vial

 CONJUGADO 2 (1 frasco)

Liquido de color rojo llenado en un frasco transparente de tapa de color rojo 12 ml por frasco (antígenos
recombinantes)

 CONJUGADO 1 (1 vial)

Liquido de color verde llenado en un vial de tapa rosca color verde 3.0 ml por vial (anticuerpos diluidos en buffer)

 BUFFER DE LAVADO (Concentrado 20x) (2 frascos)

Liquido incoloro llenado en un frasco claro de tapa transparente 25 ml por frasco; el contenido debe diluirse de 1 a 20
con agua destilada antes de su uso.

 SOLUCION CROMOGENO A (1 frasco)

Liquido incoloro llenado en un frasco transparente con tapa color blanco 14 ml por frasco (Solución de Urea
Peroxidasa.

 SOLUCION CROMOGENO B (1 frasco)

Líquido incoloro llenado en un frasco de color negro y de tapa color negro 14 ml por frasco, solución TMB (Tetramethyl
benzidine disuelto en ácido cítrico).

 SOLUCIÓN DE PARADA

Líquido incoloro llenado en un frasco transparente con tapa de color amarillo 14 ml por frasco. Solución de acido
sulfúrico diluido.

 LAMINAS CUBREPLACAS