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LABORATORIO FISICO-QUIMICO
TEMA DE INVESTIGACION
La ciencia que se encarga de estudiar los diferentes componentes de una sustancia es
la química analítica, por lo que la cromatografía es una técnica dentro de la química
analítica.
El soporte puede ser papel, un gas, otro líquido, etc. Es un método físico de separación
de componentes. Luego veremos porqué se separan, las fases y los tipos de cromatografías.
PARTES DE UN CROMATOGRAFO
MAS IMPORTANTES:
Inyectores
Los cromatógrafos de gases cuentan con inyectores que son los dispositivos por donde se
inyectan las muestras en el GC, puede tener un máximo de dos inyectores.
Hoy en día, existe una gama completa de inyectores: con y sin división [0–100 psi y 0–150
psi], de multimodo, empaquetados con purga, fríos en columna, de vaporización de
temperatura programable y de interfaz para volátiles. El tipo de inyector se elegirá en
función del tipo de análisis que se haga, el tipo de muestra que se analice y la columna que
se utilice.
Las muestras se pueden inyectar en los inyectores a mano con una jeringa o con un
dispositivo de muestreo automático.
Válvulas de muestreo
Otra de las partes fundamentales un cromatógrafo son las válvulas de muestreo son
dispositivos mecánicos sencillos que introducen una muestra de tamaño fijo en el flujo del
gas portador. Las válvulas se usan más a menudo para probar gases o líquidos en flujos de
circulación constante.
Columna y horno de GC
Las columnas del GC se encuentran dentro de un horno de temperatura controlada. Por lo
general, un extremo de la columna está unido al inyector y el otro extremo está unido al
detector. Las columnas varían en longitud, diámetro y recubrimiento interno. Cada columna
está diseñada para su uso con diferentes compuestos.
El propósito de la columna y del horno es separar la muestra inyectada en sus compuestos
individuales a medida que pasa por la columna. Para contribuir a este proceso, el horno del
GC puede programarse para acelerar el flujo de la muestra a través de la columna.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una fase
estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro
por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará en permanente
movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o la estacionaria, éstas se
separaran. Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma
tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa
(para poder obtener la cantidad y composición de las sustancias separadas). Las fases
estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos
(sefadex), derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, sílice, etc.
TIPOS DE COLUMNA CROMATOGRAFICA
Cromatografía de intercambio iónico:
se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios de polaridad opuesta que se
encuentran en la fase estacionaria.
Cromatografía de exclusión:
Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes
de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas.
Cromatografía de afinidad:
se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas biológicas. Éstas se unen
específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con
variar el pH una vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.
Cromatografía de adsorción:
se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el
sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi
exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase
móvil.
Cromatografía de partición:
la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra vez, la fase móvil
puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía
de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de
partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel.
La cromatografía de gases (GC) y de alta resolución (HPLC) son técnicas de partición
ampliamente empleadas.
Cromatografía de fase reversa:
el mecanismo de separación depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de
soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La
naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de
unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión
de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un
grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el
ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico inmovilizado
disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de
la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.
CROMATOGRAFO DE GASES
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza
y se inyecta en la cabeza de un mechero de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos
de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única
función es la de transportar el analito a través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la
cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y
que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase
estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso
de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha
provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del
analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su
única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC
utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un
sólido inerte.
CROMATOGRAFO HPLC
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o
la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales
lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las
industrias químicas y farmacéuticas así como en la biotecnología y la bioquímica. La
cromatografía preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el
aislamiento de 1µg de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de
un compuesto puro de una mezcla de 100 g.
Características:
Respuesta universal
Respuesta lineal en un amplio intervalo
Fácil de utilizar
No destructivo
Baja sensibilidad
Características:
Detección universal
Elevada sensibilidad
Buenos resultados en mezclas orgánicas complejas
Elevado coste
Complejidad de uso