Instituto Superior del Profesorado

“Dr. Joaquín V. González”

Construcción génica de Phaseolus

vulgaris resistente a Rhizoctonia solani,
por sobreexpresión del gen 2HIS

Taller: Biotecnología

Profesor: Ghio, Sergio

Alumna: Escobar, Nayla Romina

Carrera y Año: Profesorado de Biología; 5° A

Fecha: 11/2017
 Introducción
Phaseolus vulgaris, mejor conocido como poroto, frijol o judía, es una
planta herbácea originaria del sur de México, cuyas semillas son un alimento
de alta demanda a nivel mundial por su gran riqueza en proteínas, hierro,
fósforo, vitaminas y otros nutrientes. Esta planta se ve expuesta a numerosos
organismos patógenos como Rhizoctonia solani, un hongo basidiomicete,
habitante común del suelo que invade los tejidos del hospedante a los fines de
obtener nutrientes y, eventualmente, reproducirse; provocando daños tanto a
nivel de las raíces como de las hojas, tallos y frutos.
Considerando esto, el presente trabajo propone realizar una construcción
génica de Phaseolus vulgaris resistente a Rhizoctonia solani, mediante la
sobreexpresión del gen 2HIS que codifica para la 2-hidroxiisoflavanona
sintetasa, que se encuentra especialmente en las fabáceas (grupo al que
pertenece Phaseolus) y que controla la producción de metabolitos secundarios
con actividad antimicótica llamados Isoflavonoides, entre los cuales se
encuentra la Genisteina, con efecto comprobado sobre el hongo en cuestión.
 Características generales de Phaseolus vulgaris
Phaseolus vulgaris es una planta herbácea anual, erecta o trepadora, de
tallo pubescente y hojas trifoliadas compuestas. Su raíz es de tipo pivotante
con tendencia fasciculada y presenta nódulos característicos de la familia de
las leguminosas, ocupados por bacterias del género Rhizobioum que fijan
nitrógeno atmosférico. Los frutos de Phaseolus, de forma lineal-oblonga, son
dehiscentes, es decir, se abren espontáneamente y expulsan las semillas al
madurar. Estas semillas, de 0,5 a 1,5 cm, son comestibles y tienen un gran
valor en el mercado de los alimentos debido a su riqueza nutricional (son buena
fuente de calcio, hierro, fósforo, proteínas y vitaminas).

Phaseol
us vulgaris: Hoja trifoliada y flores (derecha); frutos (izquierda)
y semillas de diversos colores (abajo).

El poroto es una especie de clima templado-cálido, muy sensible a

heladas en cualquier estado de su desarrollo. La temperatura ideal para su
cultivo es de 10°C a 27ºC. La cosecha de sus frutos se realiza cuando estos
llegan al 70% de madurez, que generalmente se da 40 días luego de que la
planta ha sido trasplantada al suelo.
 Características generales de Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani es un hongo de la clase Basidiomycete que se
reproduce asexualmente, por lo que no existe en forma de esporas sino que se
presenta como un micelio vegetativo compuesto por masas de hifas
estrechamente entretejidas con superficies duras. Las hifas miden de 4 a 15
μm de ancho y tienden a ramificar en ángulos rectos.

Micelios de Rhizoctonia solani

Este hongo se desarrolla a temperaturas muy diversas en zonas cálidas,

templadas y frías y se reconoce que puede atacar a 250 especies de plantas
diferentes. Es un habitante común del suelo por lo que puede atacar a
cualquier plantación, e incluso puede encontrarse en los sitios de
almacenamiento si una planta contaminada es llevada a ellos. En este caso, el
hongo causa la infección sólo por contacto de la planta contaminada con la no
contaminada.
Los daños que produce la infección por este hongo son:
 En tubérculos: rajaduras y deformaciones debido a que el tejido
afectado detiene su crecimiento mientras que el tejido sano crece
normalmente. Los daños son importantes en la etapa pre-
emergente del cultivo.
 En los frutos: cuando tocan el suelo, son invadidos en forma directa
iniciando procesos de putrefacción.
 Tallo y hojas: necrosis secas, de color pardo a rojo que origina la
muerte de la planta.
En Phaseolus vulgaris, de interés en este trabajo, puede dañar la planta
completa: hojas, raíces, tallo, semilla, causando los daños antes mencionados.
 Isoflavonoides
Ciertas plantas como Phaseolus vulgaris, producen compuestos químicos
que actúan como defensas constitutivas en contra de patógenos. Estos
compuestos pueden ser fitoanticipinas, si se encuentran en la planta antes del
ataque, o fitoalexinas, si se sintetizan cuando el ataque ya se ha inicia.
Los isoflavonoides, presentes mayoritariamente en fabáceas, son
metabolitos secundarios que actúan como precursores tanto de las
fitoanticipinas como de las fitoalexinas. En el marco particular de este trabajo,
se considera sólo al isoflavonoide genisteina, cuyo efecto toxico sobre
Rhizoctonia solani ha sido comprobado según Leicach (2006).
La genisteina es un precursor de fitoalexinas. Se trata de un compuesto
orgnánico polifenólico que procede de “la ruta de los Fenilpropanoides” que
inicia a partir del ácido shikimico y forma el cinamato, la chalcona y la flavona.

A partir de la flavona se forma el isoflavonoide genisteína. Este proceso es

iniciado por la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS) y apoyado por la 2-
hidroxniisoflavona dehidrasa que producirá la deshidratación necesaria para
conformar el isoflavonoide.
 Fitoalexinas y sistema de defensa inducible en plantas:
Las fitoalexinas tienen la capacidad de sintetizarse rápidamente, su
formación está restringida a una zona local alrededor del sitio de infección y
son tóxicas a un espectro amplio de hongos y bacterias patógenas en plantas.
Forman parte del sistema de defensa inducible, por cuanto su síntesis inicia
una vez se ha producido el ingreso del patógeno, aunque algunas veces la
cantidad producida no es suficiente para controlar el ataque.
Para que el sistema de defensa inducible se active, deben existir
inductores específicos que “son proteínas codificadas por genes Avr de
avirulencia del patógeno invasor y que son capaces de activar un gen de
resistencia R en la planta”. Cuando las proteínas codificadas por los genes R
se acoplan por complementariedad química a los iductores, se produce el
reconocimiento y activación de los procesos de resistencia que suponen “una
rápida generación de especies reactivas de oxígeno, cambios en los polímeros
de la pared celular, síntesis de compuestos de bajo peso molecular como las
fitoalexinas, producción de proteínas relacionadas con las defensas, y muerte
celular hipersensitiva.” (Agrios, 2005. En: Vargas, 2015)”.

Diseño experimental
Como se mencionó oportunamente, el objetivo de este trabajo es crear
especímenes de Phaseolus vulgaris resistentes al hongo Rhizoctonia solani,
mediante la sobreexpresión del gen 2HIS, considerando que la planta ya posee
mecanismos de defensa que pueden ser mejorados con el aumento de la
enzima específica que controla la producción de isoflavonoides como la
genisteína.
Para realizar un proceso de transformación genética, es necesario:
 Contar con un protocolo de cultivo in vitro que garantice, mediante
su seguimiento, las mejores condiciones para realizar el proceso.
 Realizar una construcción génica (formada por los genes de interés
y selección con sus respectivos promotores y terminadores).
 Seleccionar el sistema de transferencia de ADN a utilizar para
introducir la construcción génica.
 Contar con un sistema de regeneración rápido y eficiente (es
conveniente establecerlo al inicio del proceso, antes de realizar la
transferencia).
 Utilizar un sistema de selección acorde con el gen de selección
utilizado en la construcción génica.
 Hacer uso de diferentes herramientas de análisis para la detección
de los genes introducidos y de su eficiencia.

Construcción Génica
Se propone la siguiente construcción genética:

Pi 2HIS Tr Pc Bar Tr

Promotores: inician la transcripción del gen. Existen diferentes tipos, los

seleccionados para este trabajo son, el inducible (Pi) y el constitutivo (Pc).
 Pi: los promotores inducibles son aquellos que inician la
transcripción ante la presencia de determinadas señales
provenientes de sustancias o situaciones particulares.
Considerando que el objetivo del presente es sobreexpresar un
gen (2HIS) que en Phaseolus vulgaris, por presión de selección y
evolución, sólo se activa ante infecciones de patógenos (sistema
de defensa inducido), se decide no modificar esta característica y
 utilizar un promotor inducible por ataque de microorganismos como
Rhizoctonia solani.
 Pc: los promotores constitutivos son aquellos que transcriben el
gen en todo momento, en todos los tejidos del organismo. Se elige
este tipo de promotor para el gen de selección (BAR), por cuanto
permitirá realizar las pruebas de selección a partir de cualquier
tejido de las plántulas obtenidas.
Gen de interés: es aquel que se desea transferir a la planta. Existen de
diferentes tipos, el utilizado en este trabajo es de sobreexpresión, ya que se
busca introducir más copias de un gen que la planta ya posee, el 2HIS que
codifica para la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa, iniciadora y controladora de la
síntesis de isoflavonoides.
Gen de selección: confiere a la plantula transformada una característica
(como por ejemplo, la resistencia a medicamentos o herbicidas) que permite
identificarla y separarla de las que no fueron transformadas. En un proceso de
transformación, no todos los explantos 1 utilizados presentan el gen transferido,
por lo que al ser expuestos al medio de selección, algunos sobrevivirán (los
que sí lo presentan) y otros no. El gen de selección utilizado en este trabajo
será el gen BAR que confiere resistencia al herbicida glufosinato.
Terminadores (Tr): señalizan el final de la transcripción del gen en
cuestión.

Método de transformación
Existen diferentes métodos de transformación que permiten trasferir el
ADN seleccionado. Algunos se basan en vectores biológicos como
Agrobacterium tumefaciens y otros son de transferencia directa por
procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica, o mecánica, como es el
caso de la transferencia por bombardeo de partículas o biobalística. Se
selecciona este último método para el trabajo y no el primero debido a que
Phaseolus vulgaris resulta “una planta particularmente difícil de regenerar y su
respuesta a la infección por las cepas de A. tumefaciens más comúnmente
empleadas es muy agresiva, provocando una respuesta hipersensible de
defensa, que lleva a grandes áreas de muerte celular en donde la bacteria
estuvo en contacto con la planta”2.
Los métodos de transferencia directa presentan diversas ventajas en
comparación con los métodos mediados por vectores biológicos, como por
ejemplo: son universales porque pueden aplicarse a cualquier especie; no
requieren la eliminación de las células del organismo vector de los tejidos o
plantas transgénicas, como sucede en la transformación mediada por

1
Porciones de tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de
crecimiento.
2
Estrada, G., Guillén, G. et Al. (2007). La transformación genética y genómica del frijol. Instituto
de Biotecnología. UNAM: México. Pg. 286.
Agrobacterium; las construcciones son más simples y pequeñas, ya que no son
necesarias secuencias particulares como los bordes del plásmido Ti de
Agrobacterium. Sin embargo, también presentan desventajas como ser la
aparición de frecuencias fragmentadas del gen que se ha dañado durante el
proceso y la mayor probabilidad de ocurrencia del silenciamiento génico, tanto
a nivel transcripcional como post-transcripcional. Por lo que se suele reducir el
número de transgenes a transferir, entre otras cosas para atenuar dichas
desventajas.
Biobalística
El término “biobalística” deriva de la conjunción de “biológico” y “balística”,
haciendo referencia a “la utilización de partículas microscópicas
(microproyectiles) cubiertas con moléculas de ADN o de ARN que son
acelerados a alta velocidad para atravesar la pared y las membranas
celulares”3. Las micropartículas son metálicas, las más utilizadas son las de oro
o tugsteno. Las primeras son biológicamente inertes pero de alto costo,
mientras que las segundas son más económicas pero presentan una potencial
toxicidad frente a ciertos tipos celulares, además de estar sujetas a rápidos
procesos de oxidación que llevan a la degradación del ADN.
Para realizar transferencia, los microproyectiles son colocados en un
cañon de biobalística que los impulsa a alta velocidad para que estas penetren
a la célula. Una vez dentro, si se utilizó ARN, este puede ser traducido
directamente, mientras que si la molécula empleada fue ADN, puede ser
transcripto y traducido.

La expresión de los genes puede darse de manera transitoria,

observándose entre 24 a 72hs después del bombardeo. Esto significa que el
transgén ingresó a la célula pero nunca se insertó en el ADN genómico del

3
Documento perteneciente al Curso 2011 de Agrobiotecnología: Sistemas de transformación
vegetal. Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. UBA.
especimen. Por otra parte, “si las partículas bombardeadas son atrapadas en el
núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas
mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como un
evento de transformación estable.” 4 Dicha transformación estable es de baja
frecuencia, por lo que se utilizan medios de selección in vitro que permiten
distinguir células transformadas y no transformadas. Recordemos que en este
trabajo, los brotes obtenidos de los explantos utilizados serían expuestos a
medios de cultivo con el herbicida glufosinato, por lo que sólo sobrevivirían
aquellos que efectivamente presentan la construcción génica transferida. Estos
brotes enraizarían en el medio de selección y luego serían pasados a tierra en
un invernadero.
Método de Control
Como se mencionó anteriormente, la transformación de una célula puede
ser transitoria o estable por lo que, una vez obtenido el organismo
genéticamente modificado, se debe analizar si realmente hubo inserción del
transgén, si existen una o más copias de dicho transgén en el genoma, si este
efectivamente se está expresando y si la proteína de interés está presente.
Southern Blotting
Este método permite conocer si existen copias del transgén 2HIS en el
genoma. Recordemos que Phaseolus vulgaris ya posee este gen naturalmente
pero lo que se desea conocer es si ha aumentado la cantidad de copias por lo
que debería realizarse un Southern Blotting en una muestra de planta no
modificada y luego otro en la planta transgénica para comparar los resultados.
El Southern Blotting supone los siguientes pasos:
1. Extraer ADN genómico del organismo en estudio.
2. Digerir al azar el ADN extraído, mediante enzimas de restricción
que generen fragmentos de un largo apropiado para su
visualización en gel de agarosa.
3. Realizar una corrida electoforética en gel de agarosa.
4. Desnaturalizar los fragmentos presentes en el gel. El ADN doble
cadena no permanece retenido en membranas.
5. Transferir, por capilaridad o vacío, los fragmentos de ADN desde el
gel de agarosa hasta una membrana de nylon o poliacrilamida.
6. Hibridar los fragmentos presentes en la membrana con una sonda
marcada. La secuencia de la sonda es complementaria al gen de
interés.
7. Revelar la membrana por autoradiografía. De esta forma, se
detectan las cadenas que son complementarias a las de la sonda
empleada.
Western blotting

4
Idem.
 Permite confirmar la presencia y calidad de la enzima 2-
hidroxiisoflavanona sintetasa. Debido a lo antes mencionado anteriormente,
sería conveniente hacer una doble prueba, una utilizando un especimen no
transgénica y otra con un espécimen modificado.
La técnica supone las siguientes etapas:
1. Preparación de la muestra: Se toman muestras del tejido en el que
se encuentre una cantidad de proteínas suficiente. Se introducen
en un buffer de extracción para proseguir con la purificar y estudio
de las proteínas.
2. Electroforesis en acrilamida: se separan las proteínas según el
peso molecular, punto isoeléctrico y/o carga eléctrica.
3. Transferencia de las proteínas a una membrana: puede hacerse
por difusión o por vacío.
4. Hibridación de anticuerpos: se utiliza un anticuerpo específico
unido a una enzima que reaccione al antígeno presente en la
proteína buscada (en este caso 2HIS). La reacción puede
observarse por ejemplo, con el uso de tinciones.
Pruebas con Phaseolus modificado
Los métodos anteriores permiten comprobar la presencia del trasgen, el
número de copias que existen de él y la presencia y calidad de las proteínas
que se están sintetizando, sin embargo, para comprobar el efecto de estas
últimas, es necesario realizar pruebas en presencia del patógeno, Rhizoctonia
solani. Para esto, se tomarán especímenes de Phaseolus no modificado y otros
de Phaseolus transgénico y a ambos grupos se los pondrá en contacto con el
hongo bajo condiciones óptimas para su crecimiento durante una semana para
evaluar su evolución.

Discusión
Se espera que las muestras de Phaseolus vulgaris modificado, muestren
mayor resistencia que las de poroto no transgénico, debido a la mayor cantidad
de genisteína producida.
Se ha estudiado el efecto inhibidor de la ginesteína presenta sobre
Sclerotium rolfsii y se ha comprobado su efectividad. Además, la 2-
hidroxiisoflavanona sintetasa que inicia la síntesis de dicha ginesteína, también
controla la síntesis de otro isoflavonoide, la daidzdeína, con efectos tóxicos
sobre Fusarium culmorum, por lo que se puede observar que el efecto
antimicótico no se encuentra restringido a una sola especie.
La ginesteína, por su parte, está siendo elemento de diversos estudios en
relación con sus posibles efectos hacia la salud humana. En algunos casos se
le ha llegado a otorgar capacidades antitumorales y como posible fuente de
estrógenos para las mujeres menopáusicas.
 Sin embargo, sería conveniente evaluar si la sobreexpresión del gen 2HIS
y el aumento de la enzima asociada, no llevaría a una reacción de
hipersensibilidad descontrolada en la planta a la hora de enfrentar el ataque de
microorganismos, causando efectos mayores de necrosis por muerte celular
progamada asociada a su sistema de defensa inducido.
 Bibliografía
Agrobiotecnología. Curso 2011. Sistemas de transformación vegetal.
Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular. Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales. UBA: Buenos Aires. [Disponible en:]
http://www.academia.edu/6462094/Agrobiotecnolog
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Apuntes: Unidad 2 y 4. Taller de Biotecnología. Profesorado de Biología.
JVG. CABA.
Cotes, A. M. Biología y manejo de Rhizoctonia solani. Laboratorio de
Control Biológico. Centro de Biotecnología y Bioindustria. Las Palmas,
Bogotá. [Disponible en:] https://es.scribd.com/doc/69023272/Biologia-
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Leicach, S. (2006). Alelopatía: interacciones químicas en la comunicación
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Vargas, l. L. (2015). Inducción de resistencia como estrategia defensiva
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[Disponible en:] https://rdu.unc.edu.ar/handle/11086/1981
Sistema argentino de vigilancia y monitoreo de plagas. Phaseolus
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Sistema argentino de vigilancia y monitoreo de plagas. Thanatephorus
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