RECTIVACIÓN DE LA VIRULENCIA DE Metarhizium anisopliae (Metschn.

)
Sorokin. CEPA CPMa1502 MEDIANTE PASES SUCESIVOS EN ADULTOS DEL
RASPADOR DE LOS FRUTOS DE LA PALMA DE ACEITE Demotispa neivai
(Bondar.) (Coleoptera: Chrysomelidae)

LUIS FERNANDO BUITRAGO BARRETO

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2020
 REACTIVACIÓN DE LA VIRULENCIA DE Metarhizium anisopliae (Metschn.)
Sorokin. CEPA CPMa1502 MEDIANTE PASES SUCESIVOS EN ADULTOS DEL
RASPADOR DE LOS FRUTOS DE LA PALMA DE ACEITE Demotispa neivai
(Bondar.) (Coleoptera: Chrysomelidae)

LUIS FERNADO BUITRAGO BARRETO

Documento final del trabajo de grado presentado como requisito para optar título
de Ingeniero Agrónomo

Director
Luis Guillermo Montes Bazurto
Ingeniero Agrónomo
Asistente de Investigación - CENIPALMA

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2020
 Nota de aceptación:

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Firma del jurado

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Firma del jurado

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Firma del jurado

Barrancabermeja, ____ de ________ 2020

3
Dedico este trabajo principalmente a Dios por brindarme la oportunidad de
desarrollar mi trabajo de grado en el Centro de Investigación de Palma de Aceite
CENIPALMA. Consagro este trabajo a mi Padre Francisco Javier Buitrago Perilla, a
mi Madre Nelcy Barreto Martínez, quienes me enseñaron, educaron y formaron en
la persona que soy hoy. También lo dedico, a mis queridos abuelos José Isaías
Buitrago y María Mercedes Perilla, a mis hermanos, familiares y amigos.

Dedico este trabajo de forma especial, a mi compañera de vida Kelly Johanna

Benavides Velásquez, quien con su amor y apoyo siempre estuvo conmigo en este
reto más para mi vida.

4
Agradecimiento especial a mi director de trabajo de grado Luis Guillermo Montes
Bazurto, ingeniero agrónomo de la Universidad Nacional de Colombia, Asistente de
investigación del área de Entomología de Cenipalma, quien gracias a sus
orientaciones, correcciones y sugerencias logramos culminar exitosamente este
trabajo.

Agradecimiento especial a Paola Emilia Cuartas Otálora Ph.D. Investigadora

doctoral de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Agrosavia;
por la revisión, sugerencias y correcciones de este documento. Además, directora
del proyecto “Formulación y codesarrollo de un bioplaguicida contra el raspador de
los frutos de la palma de aceite Demotispa neivai (Bondar.)” en la cual se desarrolló
el presente trabajo de grado.

Agradecimiento al auxiliar de campo de Cenipalma, Harold Alonso Giordanelly

Cortés, quien apoyo la parte operativa de campo y de laboratorio para este trabajo.
Además, agradecimiento a las diferentes personas que participaron indirectamente
en este trabajo. Igualmente, hacen parte de las diferentes áreas del CEPV de
Cenipalma, quienes me brindaron especial acogida y compartieron sus saberes
conmigo.

Agradecimiento al Instituto Universitario de la Paz y al programa de Ingeniería

Agronómica por permitir la culminación de mi carrera y este gran paso en mi vida
profesional.

Agradecimiento al Centro de Investigación de Palma de Aceite CENIPALMA, a la

Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria AGROSAVIA y al Fondo
del Fomento Palmero Administrado por Fedepalma por la financiación de este
trabajo de grado.

5
 CONTENIDO

pág.

INTRODUCCIÓN 13

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 15

2. JUSTIFICACIÓN 17

3. OBJETIVOS 18
3.1 OBJETIVO GENERAL 18
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 18

4. MARCO REFERENCIAL 19
4.1 MARCO CONCEPTUAL 19
4.1.1 Patogenicidad y virulencia. 19
4.1.2 Germinación y vigorosidad. 19
4.1.3 Modelo Probit. 19
4.2 MARCO TEÓRICO 20
4.2.1 El raspador de frutos. 20
4.2.1.1 Daño. 20
4.2.1.2 Biología. 20
4.2.1.3 Manejo. 20
4.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS 21
4.3.1 Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin. 21
4.3.2 Cepa CPMa1502 de Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin. 21
4.3.2 Proceso infectivo. 22

5. DISEÑO METODOLÓGICO 24
5.1 UBICACIÓN 24
5.2 CONDICIONES DE LABORATORIO 24
5.3 MATERIALES 25
5.4. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN 26
5.5 METODOLOGÍA 26
5.5.1 Adultos de Demotispa neivai. 26
5.5.2 Unidades experimentales. 26
5.5.3 Concentración letal media (CL50) y tiempo letal medio (TL50). 27
5.5.4 Esporulación. 29
5.6 DISEÑO ESTADÍSTICO 30
5.7 VARIABLES EVALUADAS 30
5.7.1 Mortalidad. 30
5.7.2 Eficacia. 30
5.7.3 Esporulación. 30
5.8 COVARIABLES 30

6
5.8.1 Tiempo de mortalidad medio (TL50). 30
5.8.2 Concentración letal media (CL50). 30

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31
6.1 MORTALIDAD DE Demotispa neivai (Bondar.) 31
6.1.1 Eficacia. 35
6.2 CONCENTRACIÓN LETAL (CL50) 36
6.3 TIEMPO DE MORTALIDAD MEDIO (TL50) 36

7. CONCLUSIONES 38

8. RECOMENDACIONES 38

BIBLIOGRAFÍA 40

ANEXOS 45

7
 LISTA DE TABLAS

pág.

Tabla 1. Relación de materiales para el desarrollo de los bioensayos. 25

Tabla 2. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 12 días después

de la inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el
primer bioensayo. 31

Tabla 3. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 15 días después

de la inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el
segundo bioensayo. 32

Tabla 4. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 15 días después

de la inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el
tercer bioensayo. 34

Tabla 5. Concentración letal media (CL50) del hongo M. anisopliae cepa

CPMa1502 luego de tres inoculaciones sucesivas sobre adultos de D.
neivai. 36

Tabla 6. Tiempo letal medio de mortalidad (TL50) del hongo M. anisopliae

cepa CPMa1502 luego de tres inoculaciones sucesivas sobre adultos de
D. neivai. 37

8
 LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1. Campo Experimental Palmar de La Vizcaína, Cenipalma. 24

Figura 2. Racimo sumergido en agua para recolectar adultos de

Demotispa neivai. 26

Figura 3. Tubos de PVC en los que se individualizaron los adultos de D.

neivai en cada bioensayo. 27

Figura 4. Disposición de tratamientos evaluados durante los bioensayos

de pases sucesivos en adultos D. neivai. 27

Figura 5. Suspensiones de conidios de la cepa CPMa1502 de M.

anisopliae en las cinco concentraciones utilizadas en cada bioensayo. 28

Figura 6. Desinfección de adultos de D. neivai para el montaje de

cámaras húmedas. 29

Figura 7. Cámara húmeda de adulto de D. neivai. 29

Figura 8. Esporulación de M. anisopliae CPMa1502 en D. neivai. 33

Figura 9. Comparación de la eficacia de la cepa CPMa1502 de M.

anisopliae en los bioensayos 2 y 3, evaluados mediante la corrección de
la mortalidad con el testigo absoluto. 35

Figura 10. Cámara Neubauer en un objetivo 10X. 48

Figura 11. Cámaras húmedas. 49

Figura 12. Micelación blanca típica de M. anisopliae sobre adultos de D.

neivai. 50

Figura 13. Esporulación de M. anisopliae luego de 10 días en cámara

húmeda sobre adulto de D. neivai. 50

Figura 14. Hongo contaminante sobre adulto de D. neivai. 51

9
 LISTA DE ANEXOS

pág.

Anexo A. Estados fenológicos de E. guineensis seleccionados para

alimento y colecta de adultos de D. neivai. 46

Anexo B. Fotos representativas de escala de daño causado por D. neivai

en racimos cortados de E. guineensis. 47

Anexo C. Protocolo de ajuste de concentraciones para la cepa

CPMa1502 de M. anisopliae. 47

Anexo D. Protocolo de cámaras húmedas utilizado para determinar

signos característicos del hongo entomopatógeno M. anisopliae en
adultos de D. neivai. 48

Anexo E. Análisis de varianza del primer bioensayo (pase 1). 51

Anexo F. Análisis de varianza del segundo bioensayo (pase 2). 51

Anexo G. Análisis de varianza del tercer bioensayo (pase 3). 52

Anexo H. Análisis de varianza de eficacia del segundo bioensayo (pase

2). 52

Anexo J. Análisis de varianza de eficacia del tercer bioensayo (pase 3). 53

Anexo K. Análisis de probabilidad de concentración letal del segundo

bioensayo. 53

Anexo L. Análisis de probabilidad concentración letal del tercer

bioensayo. 54

10
 RESUMEN

Los hongos entomopatógenos conservados en medios de cultivo durante periodos

de tiempo prolongados pueden afectar sus características patogénicas y su
virulencia. En estudios previos llevados a cabo en laboratorio y campo, se
seleccionó la cepa CPMa1502 de Metarhizium anisopliae por su alta virulencia
sobre larvas y adultos del raspador de frutos Demotispa neivai, una de las plagas
más importantes en el cultivo de palma de aceite (Elaeis guineensis y E. oleífera x
E. guineensis). La mortalidad de adultos causada por esta cepa en condiciones de
laboratorio fue del 95%. La cepa CPMa1502 luego de ser aislada se guardó en el
Banco de Microorganismos Entomopatógenos de Cenipalma desde el año 2015.
Posteriormente, durante un proceso de reactivación de los hongos
entomopatógenos del banco se identificó la disminución en la virulencia de la cepa.
Con el fin de recuperar la virulencia de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae, se
planteó la reactivación mediante pases sucesivos utilizando adultos de D. neivai
recolectados en campo y mantenidos en condiciones de laboratorio en el Campo
Experimental Palmar de La Vizcaína (CEPV) de Cenipalma. Para las inoculaciones
de adultos de D. neivai la cepa CPMa1502 se obtuvo a partir de la siembra y
crecimiento en el medio YM + Extracto de papa. Luego a partir de adultos muertos
y esporulados se sembró nuevamente en el medio seleccionado y se inocularon
nuevamente adultos hasta completar tres pases sobre el insecto. Para cada pase
evaluado se prepararon cinco suspensiones con una concentración de entre 1 x 104
hasta 1 x 108 conidias/mL en Tween 80 (0,1%). La inoculación de los adultos se
realizó por inmersión. La mortalidad se registró diariamente durante 15 días. La
mortalidad obtenida luego de la primera inoculación osciló entre 0% y 8% (p =
0,0357). Sin embargo, luego en la tercera inoculación la mortalidad llegó hasta 78 ±
16,9% (p<0,0001) con la concentración más alta (1 x 108 conidias/mL). La
concentración letal media (CL50) disminuyó entre el segundo y tercer pase pasando
de 1,23 x 108 conidias/mL a 9,37 x 106 conidias/mL. Del mismo modo, el tiempo letal
medio (TL50) se redujo de 10,56 días a 6,07 días.

Palabras clave: concentración letal, tiempo letal, patogenicidad, palma de aceite.

11
 SUMMARY

Entomopathogenic fungi preserved in artificial growth media for prolonged periods

of time, may affect their pathogenic characteristics and virulence. In previous studies
carried out in the laboratory and in the field conditions, the fungus Metarhizium
anisopliae strain CPMa1502, was selected for its high virulence against larvae and
adults (95%) of the fruit scraper Demotispa neivai. This insect is one of the most
important pests in oil palm plantations in Colombia (Elaeis guineensis and hybrid E.
oleifera x E. guineensis). This fungus is conserving in the Entomopathogenic
Microorganisms Bank of Cenipalma since 2015. Subsequently, during a process of
reactivation of the entomopathogenic fungi of the bank, the decrease in the virulence
of the strain was identified. To recover the virulence of the CPMa1502 strain, was
proposed does successive passes against adults of D. neivai collected from oil palm
plantations and kept in laboratory conditions at Palmar de La Vizcaína Experimental
Field of Cenipalma. For adult inoculations, the strain CPMa1502 was reproduced in
the artificial medium YM + Potato extract. Then, from sporulated cadavers of adults,
the fungus was isolated and reproduced, and new adults were inoculated. This
procedure was made until complete three passes on the insect. For each inoculation
five suspensions were prepared with a concentration of between 1 x 10 4 to 1 x 108
conidia/mL in Tween 80 (0.1%). Inoculation of adults was performed by immersion.
Mortality was recorded daily for 15 days. The mortality obtained after the first
inoculation oscillated between 0% and 8% (p = 0.0357). However, after the third
inoculation, mortality reached 78 ± 16.9% (p <0.0001) with the highest concentration
(1 x 108 conidia/mL). The average lethal concentration (LC50) decreased between
the second and third pass from 1.23 x 10 8 conidia/mL to 9.37 x 106 conidia/mL.
Similarly, the mean lethal time (TL50) was reduced from 10.56 days to 6.07 days.

Key words: lethal concentration, lethal time, pathogenicity, oil palm.

12
 INTRODUCCIÓN

Uno de los componentes del manejo integrado de plagas (MIP) en el cultivo de

palma es la preservación de la fauna benéfica y el uso de microorganismos
entomopatógenos en lugar de insecticidas de síntesis química. Debido a esto, y a
las buenas condiciones de humedad que registra el cultivo, los hongos
entomopatógenos son una alternativa promisoria para el control de insectos plaga
en el cultivo de palma de aceite1.

El control biológico de insectos plagas mediante la utilización de bioplaguicidas es

considerado como una de las alternativas más deseables y factibles dentro de la
agricultura, porque provee un control adecuado y sostenible de las plagas. Además,
debido a la especificidad de los controladores biológicos solo se afecta la especie
de interés2.

Una de las plagas más importantes del cultivo de la palma de aceite es Demotispa
neivai (Bondar.) (Coleoptera: Chrysomelidae), debido a que el raspado que produce
en el fruto causa pérdidas de extracción de aceite y de racimos por la cosecha
inoportuna de hasta el 8% en campo3. Ante la necesidad de controlar este insecto
se inició la búsqueda y reconocimientos de sus enemigos naturales en donde se
encontró que el hongo Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin. (Hypocreales:
Clavicipitaceae) cepa CPMa1502, podría ser promisorio para el control de este
insecto4.

El hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 aislado de larvas de D. neivai, se encuentra

conservado en la colección de microrganismos entomopatógenos de Cenipalma.
Luego, la reproducción continua de esta cepa en medios de cultivo artificiales, se
evidenció una disminución en su virulencia sobre larvas y adultos de D. neivai. Ante
este hecho, se propuso recuperar la virulencia de la cepa con la reactivación
mediante la inoculación sucesiva del hongo sobre el huésped inicial y reaislamiento
de los insectos esporulados para su posterior reproducción.

Este proyecto de grado fue desarrollado dentro del marco de convenio de

cooperación AV17-03 entre la Corporación Colombiana de Investigación
Agropecuaria AGROSAVIA y el Centro de Investigación de Palma de Aceite

1 BUSTILLO, Alex Enrique. Manejo de insectos plaga de la palma de aceite con énfasis en el control
biológico y su relación con el cambio climático. Revista Palmas. 2014, vol. 35, nro. 4. p. 74.
2 FERRON, P. Biological control of insect pests by entomogenous fungi. Annual Review of

Entomology [en linea]. 1978. vol. 23, nro. 1. p. 417. DOI: 10.1146/annurev.en.23.010178.002205.
3 GENTY, Philippe. Las plagas de la palma aceitera en América Latina. Oleagineux. 1978, vol. 33,

nro. 7. p. 335.
4 MONTES-BAZURTO, Luis Guillermo; YONDA, Yimer Peteche., y BUSTILLO, Alex Enrique. Life

cycle and natural enemies of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of

Entomological Science [en linea]. Agosto 2019 [Consultado el 17 agosto de 2019], vol. 54, nro 3. p.
221. DOI: 10.18474/jes18-61.

13
CENIPALMA, en el proyecto “Codesarrollo de un bioplaguicida contra el raspador
de los frutos de la palma de aceite Demotispa neivai (Bondar.)".

Los resultados de esta investigación son parte del proyecto mencionado

anteriormente son compartidos en estas instituciones, y serán divulgados en
diferentes medios científicos.

14
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El daño causado por el raspador de frutos de la palma de aceite, Demotispa neivai

(Bondar.) (Coleoptera: Chrysomelidae) se registra desde las primeras fases de
formación del racimo5. El daño es causado tanto por las larvas como por los adultos
al alimentarse de la epidermis de los frutos, provocando un secamiento con una
apariencia corchosa en el fruto; lo cual dificulta determinar el grado de madurez del
racimo6. La dificultad para determinar el grado de madurez de los racimos causa
pérdidas de hasta el 8% de racimos en campo, al no cortar los racimos en el
momento óptimo de cosecha. Además, se pierden hasta 2% en la tasa de extracción
de aceite cuando el daño es del 100% de la superficie del fruto7.

Entre los enemigos naturales del raspador de frutos se encuentran depredadores

como Hololepta sp. (Coleoptera: Histeridae), varias especies de Chrysoperla spp.
(Neuroptera: Chrysopidae), hormigas de los géneros Crematogaster y
Odontomachus; ninfas de Alcaeorrhynchus grandis Dallas (Hemiptera:
Pentatomidae) y arañas de la familia Salticidae. Entre los parasitoides se destaca
Tetrastichus sp. (Hymenoptera: Eulophidae) parasitoide de pupas y entre los
microorganismos entomopatógenos se encuentran los hongos Beauveria sp.
(Hypocreales: Cordycipitaceae)8, y M. anisopliae que en condiciones de una
plantación de palma de aceite han mostrado que puede registrar una mortalidad de
larvas de hasta el 68%9.

La conservación de hongos entomopatógenos como Metarhizium anisopliae

(Metschn.) Sorokin., en medios artificiales de cultivo por periodos de tiempo
prolongados, sin inocularlos sobre el hospedero inicial, puede causar una
disminución en la actividad biológica del hongo sobre hospedero. Este efecto ha
sido demostrado en diferentes estudios en los que se menciona la disminución en
la germinación, la reducción de crecimiento de hasta el 50% por efecto de pases

5 MONTES-BAZURTO; YONDA., y BUSTILLO. Op. cit., p. 213.

6 ALDANA, Jorge, et al. Aspectos biológicos y alternativas de control de Imatidium neivai Bondar
(Coleoptera: Chrysomelidae) raspador del fruto de la palma de aceite. Revista Palmas. 2004, vol. 25,
nro. Especial, Tomo II. p. 241.
7 VALENCIA, Carolina, et al. Evaluación de estrategias de control y cuantificación de las pérdidas

causadas por Demotispa neivai Bondar, raspador del fruto de la palma de aceite. Revista Palmas.
2007, vol. 28, nro. 1, p. 50.
8 VALENCIA, Carolina y BENÍTEZ, Edgar. Evaluación del efecto de cuatro aislamientos de hongos

entomopatógenos en el control de Imatidium neivai. Ceniavance 117. 2004, p. 2.

9 MONTES-BAZURTO, Luis Guillermo; BARRAGAN FERREIRA, Angie., y BUSTILLO, Alex Enrique.

43° Congreso Sociedad Colombiana de Entomología - Socolen. En: Selección de cepas de hongos
entomopatógenos para el control de Demotispa neivai Bondar (Coleoptera: Chrysomelidae).
Manizales, 2016. p. 88.

15
sucesivos en el medio de cultivo para Beauveria bassiana (Bals) Villemin.10, y la
reducción de su actividad biológica (Virulencia)11. Debido a esto, es necesario
realizar la reactivación de los hongos entomopatógenos mediante la inoculación del
hospedero inicial y su posterior reaislamiento a partir de insectos muertos y
esporulados12. Además, realizar reactivaciones sucesivas puede incluso mejorar la
virulencia de los hongos entomopatógenos13.

Luego de un periodo prolongado de conservación de la cepa CPMa1502 de M.

anisopliae se evidenció la disminución en su actividad biológica o virulencia sobre
larvas y adultos de D. neivai. Ante ello, es necesario evaluar la recuperación de la
virulencia de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae mediante la inoculación sucesiva
de adultos del raspador de frutos de la palma de aceite D. neivai.

10 GARCÍA, Magda X, et al. Efecto de subcultivos sucesivos de Beauveria bassiana sobre sus
características y actividad contra Premnotrypes vorax. Manejo Integrado de Plagas y Agroecología.
2006, vol. 1, nro. 77. p. 54.
11 ESTRADA-VÉLEZ, María Nancy, et al. Esporulación, germinación y patogenicidad de aislamientos

monospóricos de Beauveria bassiana. Cenicafé. 1999, vol. 50, nro. 1. p. 54.

12 FARGUES, J. F. y ROBERT, P. H. Effects of passaging through scarabeid hosts on virulence and

host specificity of two strains of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae.

Canadian Journal of Microbiology [en linea]. 1983, vol. 29, nro. 5. p. 580. ISBN 0008-4166. DOI:
10.1139/m83-090.
13 FARGUES y ROBERT. Op. cit., p. 576.

16
 2. JUSTIFICACIÓN

Colombia con una producción de más de un millón de toneladas de aceite de palma

y un área sembrada de más de 530.000 ha para el año 201814, ocupa el cuarto lugar
en el ámbito mundial de área cultivada en palma de aceite15.

El cultivo de palma de aceite se ve afectado por diversos insectos plaga que atacan
distintas partes de la palma, disminuyendo los rendimientos del cultivo y afectando
su sostenibilidad y competitividad. Entre las plagas de mayor importancia en el
cultivo de palma de aceite se encuentra, el raspador de frutos Demotispa neivai
(Bondar.) (Coleoptera: Chrysomelidae), que al alimentarse produce una herida en
los frutos que causa la pérdida de hasta un punto en la tasa de extracción de aceite
cuando el 50% de la superficie de los frutos se encuentra afectada y hasta de dos
puntos cuando el 100% de la superficie de los frutos se encuentra afectada16.

Debido a esto, es necesario la búsqueda de alternativas para el control del raspador

de frutos de palma de aceite. Una de las alternativas evaluadas anteriormente fue
el uso de extractos cítricos. Sin embargo, debido a que el producto era artesanal no
fue posible su utilización en campo17. Otra de las alternativas evaluadas fue la
búsqueda de hongos entomopatógenos eficaces para el control del raspador de
frutos. En estos estudios se encontró que la cepa CPMa1502 de M. anisopliae era
promisoria debido a que causó una mortalidad de adultos del 95% en condiciones
de laboratorio18. Sin embargo, luego de un periodo prolongado de conservación en
medios artificiales la cepa redujo su actividad biológica sobre D. neivai. Ante esto
es necesario evaluar si mediante la inoculación sucesiva de adultos de D. neivai en
condiciones de laboratorio se logra recuperar la virulencia de esta cepa.

14 FEDEPALMA. Balance económico del sector palmero colombiano en 2018: Panorama general.
Bogotá D.C : [s. n.], 2014. p. 2.
15 FEDEPALMA. Anuario estadístico statistical yearbook 2018. Bogotá D.C : [s. n.], 2018. p. 114.
16 ALDANA, Jorge, et al. Op. cit., p. 244.
17 MARTÍNEZ CASTRILLÓN, Luis Carlos; ALDANA, Rosa Cecilia., y VALENCIA, Carolina. Efecto

letal y subletal causado por un extracto cítrico sobre Demotispa neivai (Coleoptera : Chrysomelidae).
Revista Palmas. 2008, vol. 29, nro. 1. p. 41.
18 MONTES-BAZURTO, Luis Guillermo, et al. Selection of entomopathogenic fungi for the biological

control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal
of Entomological Science. [S. d.]. s.p.

17
 3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar el comportamiento de la virulencia del hongo Metarhizium anisopliae

cepa CPMa1502 sobre adultos de Demotispa neivai luego de inoculaciones
sucesivas del hongo sobre el insecto.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Determinar la mortalidad de adultos de Demotispa neivai causada por el hongo

Metarhizium anisopliae cepa CPMa1502 luego de inoculaciones sucesivas para
conocer el comportamiento de la virulencia del hongo.

- Determinar la concentración letal media (CL50) de Metarhizium anisopliae cepa

CPMa1502 sobre adultos de Demotispa neivai con el fin de establecer su variación
luego de inoculaciones sucesivas.

- Determinar el tiempo letal medio (TL50) de Metarhizium anisopliae cepa CPMa1502

sobre adultos de Demotispa neivai, con el fin de establecer su variación luego de
inoculaciones sucesivas.

18
 4. MARCO REFERENCIAL

4.1 MARCO CONCEPTUAL

4.1.1 Patogenicidad y virulencia. Son términos usados en muchas disciplinas

científicas incluyendo medicina, epidemiología, ecología evolutiva, microbiología de
la ecología evolutiva y fitopatología19. Aizawa, K. define el concepto de
patogenicidad como la capacidad de una cepa o especie de microorganismo para
producir enfermedades y especifica que el término es usado cualitativamente. La
virulencia es el grado de patogenicidad de un microorganismo sobre una especie
en condiciones controladas y declara que el término se usa cuantitativamente20.

4.1.2 Germinación y vigorosidad. Son características importantes en la

producción y calidad de hongos entomopatógenos. La vigorosidad de las conidias
se refiere a la fuerza o debilidad de la germinación y del crecimiento del tubo
germinativo en un determinado tiempo; se afirma que refleja el estado fisiológico de
las conidias, que se ven influenciadas por el medio de producción en el que se
desarrolle21. La germinación depende del estado nutricional en que se reproduce el
hongo, las condiciones ambientales en el que se adhiere y a los compuestos del
integumento del insecto22.

4.1.3 Modelo Probit. El método de análisis Probit utiliza un modelo de regresión

lineal o logístico, que se usa para estimar por medio de probabilidad la cantidad de
estímulo. Se expresa en concentración o dosis respecto a la mortalidad; en este
sentido el porcentaje de mortalidad se transforma en unidades Probit y la dosis en
unidades que se pueden trazar en líneas rectas. Por lo tanto, permitir el ajuste
mediante la técnica habitual de los mínimos cuadrados, o establecer un modelo de
regresión general en forma lineal23.

19 THOMAS, Stephen R y ELKINTON, Joseph S. Pathogenicity and virulence. Journal of Invertebrate

Pathology [en linea]. 2004, vol. 85, nro. 3. p. 148. DOI: 10.1016/j.jip.2004.01.006.
20 SHAPIRO-ILAN, David I, et al. Definitions of pathogenicity and virulence in invertebrate pathology.

Journal of Invertebrate Pathology [en linea]. 2005, vol. 88, nro. 1. p. 4. DOI:
10.1016/j.jip.2004.10.003.
21 JIN XIXUAN, Christopher; HAYES, Christopher K., y HARMAN, Gary E. Principles in the

development of biological control systems employing Trichoderma species against Soil-Borne plant
pathogenic fungi. En: LEATHAM, Gary F (dir.), Fontiers in Industrial Mycology [en linea]. 1a ed. New
York London : Chapman & Hall, Inc., 1992. p.184. ISBN 9781468471144. DOI: 10.1007/978-1-4684-
7112-0.
22 TANADA, Yoshinori y KAYA, Harry K. Insect Pathology. San Diego, California, Estados Unidos :

[s. n.], 1993. p. 321. ISBN 0-12-683255-2.

23 BLISS, C I. The method of probits. Science [en linea]. 1934, vol. 79, nro. 2037. p. 38. DOI:

10.1126/science.79.2037.38.

19
4.2 MARCO TEÓRICO

4.2.1 El raspador de frutos. Demotispa neivai (Bondar.) (Coleoptera:

Chrysomelidae) es el raspador de frutos de la palma de aceite Elaeis guineensis
Jacq. (Arecales: Arecaceae) y del híbrido interespecífico (E. oleífera (Kunth.) Cortes
x E. guineensis Jacq)24. Se encuentra distribuido en todas las zonas palmiculturas
de Colombia especialmente en la Zona Central25.

4.2.1.1 Daño. D. neivai afecta los racimos durante las fases de desarrollo, llenado
y maduración de los frutos. Los estadíos fenológicos del racimo en donde se
registran las mayores infestaciones son el 703 y 70526, de acuerdo con la escala
BBCH desarrollada para E. guineensis27 (Sistema de codificación numérica
uniforme para identificación fenológica de plantas de clase liliopsida y
magnoliopsida). El daño es causado tanto por las larvas como por los adultos28.

4.2.1.2 Biología. D. neivai es un insecto nocturno holometábolo, que desarrolla todo

su ciclo de vida en los racimos. Los huevos son colocados en su mayoría en el
interior de los racimos, rara vez en la parte superficial y tiene una duración de 7,1 ±
1,2 días. Las hembras ovipositan en la base de las espigas o en las brácteas de los
frutos internos. La larva permanece en la parte más profunda del racimo, en donde
se alimentan de las brácteas de los frutos internos y de la parte carnosa de la espata,
en el área que rodea el pedúnculo del racimo29. La larva dura 21,9 ± 2,0 días y pasa
por 5 instares. El estado de pupa tiene una duración de 19,6 ± 3,0 días. La
longevidad de los adultos es de 268,9 ± 53,1 días. El ciclo completo tiene una
duración de 309,1 ± 54,3 días30.

4.2.1.3 Manejo. Entre las estrategias de control de D. neivai se encuentra la

aplicación de agroquímicos a la corona de la palma31, pero este control afecta a los
insectos polinizadores y a los enemigos naturales del raspador de frutos 32.Otra
alternativa es la aplicación de un extracto cítrico que en condiciones de laboratorio

24 MONTES-BAZURTO, Luis Guillermo; PETECHE YONDA., Yimer y BUSTILLO, Alex Enrique. Ciclo
biológico y enemigos naturales de Demotispa neivai Bondar (Coleoptera : Chrysomelidae) en palma
de aceite. En: XIII Reunión Técnica Nacional de Palma de Aceite. Medellin, 2016, p. 1.
25 ALDANA, Jorge; CATAÑO, Juan E., y CALVACHE, Hugo. Avances en el conocimiento de la

biología y del control de Imatidium neivai Bondar, raspador de los frutos de la palma de aceite.
Ceniavance 107. 2003, nro. 107. p.1.
26 MONTES-BAZURTO; YONDA., y BUSTILLO. Op. cit., p. 219.
27 FORERO, D. C; HORMAZA, P., y ROMERO, H. M. Phenological growth stages of African oil palm

(Elaeis guineensis). Annals of Applied Biology [en linea]. 2012, vol. 160, nro. 1. p. 61. DOI:
10.1111/j.1744-7348.2011.00520.x.
28 ALDANA, et al. Op. cit., p. 244.
29 ALDANA; CATAÑO., y CALVACHE. Op. cit., p 1.
30 MONTES-BAZURTO; YONDA., y BUSTILLO. Op. cit., p. 218.
31 GENTY. Op. cit., p. 335.
32 ALDANA, et al. Op. cit., p. 244.

20
mostró ser promisorio para el control del raspador de frutos33. Sin embargo, este
extracto cítrico no está disponible para su uso actualmente.

4.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

Los hongos entomopatógenos son un factor importante dentro del agroecosistema

de Palma de aceite porque causan un control natural y eficiente de poblaciones de
insectos plagas y pueden ser utilizados en un programa de manejo integrado de
plagas del cultivo de palma de aceite34. Desde 1986 se ha realizado estudios en
reconocimiento de hongos entomopatógenos en palma de aceite encontrando
diferentes géneros de hongos afectando a varios órdenes de insectos plagas de
palma de aceite y distribuidos en todas las zonas de Colombia35.

4.3.1 Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin. Es un hongo anamorfo que

pertenece al filo Ascomycota y Familia: Clavicipitaceae. Se caracteriza por formar
capas de esporulación, fialides sencillas en pares o en ramilletes, con fialoconidias
producidas en cadenas basipetalas, compactadas y en columnas36. También puede
producir estructuras levaduriformes o blastosporas y apresorios a través de la
diferenciación micelial, que a su vez esta puede funcionar como unidad reproductiva
en medios sumergidos y en la hemolinfa de los insectos37.

4.3.2 Cepa CPMa1502 de Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin. Es una

cepa identificada como Metarhizium anisopliae del Banco de Entomopatógenos de
Cenipalma38, obtenida de larvas afectadas del raspador de los frutos D. neivai en
una plantación de palma de aceite de la Zona Central, mostrando ser promisoria
para el control de D. neivai según las pruebas de patogenicidad y virulencia en
laboratorio39.

33 MARTINEZ; VALENCIA., y ALDANA DE LA TORRE. Op. cit., p. 45.

34 ZENNER DE POLANÍA, Ingeborg y POSADA, Francisco Javier. Manejo de insectos, plagas y
beneficos, de la palma africana. Produmedios. Bogotá : ICA, 1992. p. 13. ISBN 9781467375047.
35 CALVACHE, Hugo. El control microbiano, en el manejo de las plagas de la palma de aceite. Revista

Palmas. 1993, vol. 14, nro. 2. p. 18.

36 TIAGO, Patricia Vieira, OLIVEIRA; Neiva Tinti., y LIMA, Elza Áurea de Luna Alves. Biological insect

control using Metarhizium anisopliae: morphological, molecular, and ecological aspects. Ciência
Rural [en linea]. 2014, vol. 44, nro. 4. p. 646. DOI: 10.1590/s0103-84782014000400012.
37 JACKSON, Mark A. y JARONSKI, Stefan T. Production of microsclerotia of the fungal

entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol agent for soil-
inhabiting insects. Mycological Research [en linea]. Elsevier Ltd, 2009, vol. 113, nro. 8. p. 848. DOI:
10.1016/j.mycres.2009.03.004.
38 CONTRERAS ARIAS, Leidy Johanna y BUSTILLO P, Alex Enrique. Caracterización morfológica

de cepas de hongos entomopatógenos de Beauveria bassiana, Cordyceps spp., Metarhizium spp. y

Purpureocillium lilacinum. En: XV Reunión técnica nacional de palma de aceite. Bucaramanga:
Cenipalma. 2019. p. 1.
39 MONTES-BAZURTO, et al. Op. cit., p. s.p.

21
4.3.2 Proceso infectivo. Una vez que los conidios infectivos entren en contacto con
el insecto, existen diversos factores para su desarrollo y culminación, que implican:
factores ambientales, estado fisiológico de los insectos y factores de virulencia
propias de los hongos40.

4.3.2.1 Germinación de conidios. Los hongos entomopatógenos inician su

germinación cuando los conidios viables se encuentran adheridas a la superficie del
integumento del insecto hospedero41, pero estas requieren de condiciones
ambientales favorables como humedad relativa y temperatura; lo que hace posible
la asociación de patógeno y el hospedero42. Para la germinación de los conidios la
humedad relativa debe ser mayor al 70%43. Durante la germinación se produce el
tubo germinativo y el apresorio que permitirán traspasar la cutícula del insecto.

4.3.2.2 Penetración de la cutícula. El tubo germinativo en el extremo términal

forma un abultamiento llamado apresorio44, y este último actúa simultáneamente de
forma mecánica y química en la superficie de la cutícula en el insecto; la primera
ejerce una presión sobre áreas esclerosadas y membranosas, que a su vez actúa
de forma química que consiste en la acción enzimática de proteasas, lipasas y
quitinasas45.

4.3.2.3 Crecimiento del hongo. El crecimiento del hongo dentro del insecto se
desarrolla formando cuerpos hifales secundarios que invaden la procutícula, la capa
epidérmica y se dispersa a través del hemocele46.

4.3.2.4 Producción de toxinas. Se producen en el hemocele causando la muerte

del insecto47. Se ha registrado para Beauveria bassiana y M. anisopliae ácido
oxálico, reportada como factor coadyuvante a la solubilización de la proteína
40 ESPINEL CORREAL, Carlos, et al. Hongos entomopatógenos en el control biológico de insectos
plaga. En: Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: agentes de control biológico
[en linea]. [S. l.] : [s. n.], 2018, p. 341. Disponible EN :
https://repository.agrosavia.co/bitstream/handle/20.500.12324/34071/CB CAPITULO 6 -
WEB.pdf?sequence=4&isAllowed=y.
41 PUCHETA DIAZ, Micaela, et al. Mecanismos de acción de hongos Entomopatógenos. Red de

Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal. 2006, vol. 31, p. 857.
42 ORTIZ-CATÓN, M. et al. Efecto de la temperatura y humedad relativa sobre el desarrollo de los

hongos entomopatógenos. Revista Biociencias. 2011, vol. 1, nro. 2. p. 43.

43 PUCHETA DIAZ, et al., Op. cit., p. 857
44 TIAGO; OLIVEIRA., y LIMA. Op. cit., p. 646.
45 MONZÓN, Arnulfo. Producción, uso y control de calidad de hongos entomopatógenos en

Nicaragua. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) [en linea]. 2001, [consultado el 5 de marzo de
2019]. nro. 63. p. 96. Disponible en:
http://repositorio.bibliotecaorton.catie.ac.cr/bitstream/handle/11554/6723/A2107e.pdf?sequence=1&
isAllowed=y.
46 ROBERTS, Donald W y HUMBER, Richard A. Entomogenous fungi. En: Biology of conidial fungi.

[S. l.] : [s. n.], 1981, p. 211. ISBN 0-12-179502-0.

47 Ibid., p. 205.

22
cuticular en hongos entomopatógenos; también se describen las destruxinas
dimetildetruxina y la protodestruxina, consideradas como un factor importante de
virulencia de M. anisopliae48.

4.3.2.5 Muerte del insecto. Los insectos infectados tienden a perder la movilidad y
coordinación de sus movimientos antes de su muerte, en esta fase el hongo pasa a
un estado de crecimiento saprófito y se esparce a través de los tejidos del insecto
momificándolo49, solo cuando la humedad relativa en el ambiente es alta o saturada
se desarrolla los conidióforos, que van a reproducir las unidades infectivas del
hongo y posteriormente se van a diseminar en el medio50.

48 PUCHETA DIAZ, et al., Op. cit., p. 858.

49 FERRON. Op. cit., p. 416.
50 WILDING, N. Effect of humidity on the sporulation of Entomophthora aphidis and E. thaxteriana.

Transactions of the British Mycological Society [en linea]. 1969, vol. 53, nro. 1. p. 127. DOI:
10.1016/s0007-1536(69)80014-8.

23
 5. DISEÑO METODOLÓGICO

5.1 UBICACIÓN

La evaluación se desarrolló en el Laboratorio de Entomología del Campo

Experimental Palmar de La Vizcaína de Cenipalma, ubicado 6°59'18.6'' latitud norte
y 73°42'45.1'' longitud oeste (Figura 1) con una altitud de 100 m.s.n.m. en el
municipio de Barrancabermeja, Santander, Colombia.

Figura 1. Campo Experimental Palmar de La Vizcaína, Cenipalma.

Fuente: elaboración propia. Imagen de Bing Maps. Editada en QGIS (Versión 3.4.6).

5.2 CONDICIONES DE LABORATORIO

Para los tres bioensayos llevados a cabo la temperatura promedio fue de 28,1 ± 1,6
°C y la humedad relativa promedio fue de 96,2 ± 9,8%. El registro de la temperatura
y humedad relativa se realizó con un equipo Data Logger Watchdog serie A.

24
5.3 MATERIALES

Los materiales utilizados que desarrollaron esta investigación se relacionan en la

Tabla 1.

Tabla 1. Relación de materiales para el desarrollo de los bioensayos.

Materiales de laboratorio Materiales de campo Materiales de apoyo
 Racimos de Palma Cámara Digital
 Tubos de PVC de 3"
de aceite (Sony DSC-TX30)
 Adultos de Lapiceros, lápiz,
 Papel absorbente
Demotispa neivai. marcador
 Palín para corte
 Muselina  Computador
de racimos
 Bandejas plásticas con tapa de 4 L.  Lonas o costales 

 Guantes para
 Segueta de 12”
cosecha de racimo
 Autoclave Model 25X
 Cajas de Petri (90 mm x 16 mm) –
(50 mm x 15 mm)
 Algodón
 Espátulas, Pinzas en acero
 Etanol 70% y 90%
 Hipoclorito de Sodio 15%
 Tween 80®
 Mecheros
 Encendedores
 Agitador vórtex
 Tubos Falcon de 50 mL – 15 mL
 Bandas de caucho
 Silicona líquida
 Microscopio (Olympus CX41)
 Cámara de Neubauer
 Data Logger Watchdog serie-A
 Estereomicroscopio con cámara
(Olympus SZ61)
 Cepa del Hongo CPMa1502
 Micropipetas
 Vaso de precipitados

Fuente: elaboración propia.

25
5.4 HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN

La inoculación sucesiva del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 sobre adultos de

D. neivai aumentará la virulencia de la cepa sobre los adultos de D. neivai.

5.5 METODOLOGÍA

5.5.1 Adultos de Demotispa neivai. Se recolectaron de diferentes plantaciones

comerciales de la Zona Central; racimos en estadios 703 o 70551 (Ver Anexo A) que
tuvieran daño en escala 4 o 5 de acuerdo con la escala de evaluación de daño
desarrollada por Cenipalma52 (Ver Anexo B). Los racimos que cumplieron estos dos
requisitos se cortaron y se llevaron al laboratorio en donde se recuperaron todos los
adultos vivos de cada racimo. Para ello, cada racimo se sumergió en agua y con un
colador se recuperaron los adultos que flotaban (Figura 2). Los adultos recuperados
se dejaron en observación en recipientes plásticos con frutos verdes como fuente
de alimento durante una semana, con el fin de descartar los adultos viejos o
afectados por algún enemigo natural.

Figura 2. Racimo sumergido en agua para recolectar adultos de Demotispa neivai.

Fuente: elaboración propia.

5.5.2 Unidades experimentales. Las unidades experimentales se conformaron con

10 adultos individualizados en tubos de PVC de 8 cm de diámetro por 5 cm de alto,
con muselina pegada con silicona en uno de sus extremos y un trozo de muselina
ajustada con una banda de caucho en el otro para facilitar el acceso para las
evaluaciones y el cambio de alimento. En cada tubo se colocó un trozo de toalla
humedecida con un fruto de palma obtenido de un racimo en estadio 703 o 705 y
un adulto de D. neivai (Figura 3).

51 FORERO; HORMAZA., y ROMERO. Op. cit., p. 60.

52 VALENCIA, et al. Op. cit., p. 45.

26
Figura 3. Tubos de PVC en los que se individualizaron los adultos de D. neivai en
cada bioensayo.

Fuente: elaboración propia.

Finalmente, los tratamientos se dispusieron en dos estantes de forma ordenada

(Figura 4); iniciando desde los testigos y luego las concentraciones evaluadas de
menor a mayor concentración. Sin embargo, el número de la unidad experimental
asignado, previamente fue aleatorizado mediante el programa (SAS V. 9.4);
Inicialmente, se tuvo en cuenta el número de tratamientos y repeticiones por unidad
experimental.

Figura 4. Disposición de tratamientos evaluados durante los bioensayos de pases

sucesivos en adultos D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

5.5.3 Concentración letal media (CL50) y tiempo letal medio (TL50). Para el primer
bioensayo se utilizó la cepa CPMa1502 de M. anisopliae que se encontraba
conservada en el Banco de Microorganismos Entomopatógenos de Cenipalma. De
la colección la cepa se aisló y reprodujo en el medio de cultivo de Yeats Mold (YM)

27
+ Extracto de papa53. Además, se determinó previamente en Agrosavia la
germinación y la vigorosidad de conidios.

Para el segundo bioensayo la cepa CPMa1502 se reprodujo a partir de insectos con

signos de esporulación obtenidos del primer bioensayo. De los adultos con signos
típicos de M. anisopliae se aisló y reprodujo el hongo en el mismo medio de cultivo
utilizado en el primer bioensayo. Del mismo modo se reprodujo el hongo para el
tercer bioensayo solo que partiendo de insectos esporulados obtenidos en el
segundo bioensayo. La reproducción del hongo para todos los bioensayos se realizó
en el Departamento de Bioproductos de Agrosavia.

Para cada bioensayo se prepararon suspensiones de conidios en Tween 80* al

0,1% con concentraciones ajustada en los tratamientos (T1) = 1 x 104, (T2) = 1 x 105,
(T3) = 1 x 106, (T4) = 1 x 107 y (T5) = 1 x 108 conidias/mL (Figura 5). Para el ajuste
de las concentraciones se determinó la concentración de la suspensión madre
utilizando un hemocitómetro y posteriormente con la fórmula C1V1=C2V2 se
ajustaron cada una de las concentraciones (Anexo C).

Figura 5. Suspensiones de conidios de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae en las

cinco concentraciones utilizadas en cada bioensayo.

T1= 1 x 104 - T2 = 1 x 105 – T3 = 1 x 106 – T4= 1 x 107 – T5 = 1 x 108

Conidias/mL

Fuente: elaboración propia.

La inoculación del hongo en las diferentes concentraciones se realizó sumergiendo

los adultos de D. neivai durante un minuto en cada suspensión. Como testigo se
sumergieron adultos de D. neivai en Tween 80 al 0,1% durante un minuto y se tuvo

53 BBLTM & DifcoTM . Manual of microbiological culture media. 2Ed. United States of America : [s. n.],
2009. p. 632. ISBN 0972720715.
* Tween 80®: es un tensioactivo no iónico. Permite la dispersión de propágulos fúngicos con el fin de
una dispersión homogénea y adecuada de las suspensiones de los tratamientos o diluciones en
serie.

28
un testigo absoluto sin inoculación. La evaluación se realizó diariamente durante 12
días en el primer bioensayo y 15 días en el segundo y tercer bioensayo, registrando
la mortalidad de adultos.

5.5.4 Esporulación. Los adultos encontrados muertos en cada evaluación se

desinfectaron sumergiéndolos durante un minuto en una solución de hipoclorito de
sodio (NaClO) al 1%. Luego cada adulto se lavó tres veces con agua purificada
estéril (Figura 6) y se secó utilizando una toalla absorbente estéril.

Figura 6. Desinfección de adultos de D. neivai para el montaje de cámaras

húmedas.

Fuente: elaboración propia.

Finalmente, cada adulto se colocó en una cámara húmeda durante 10 días (Figura
7). En los bioensayos dos y tres, al cabo de los 10 días se cuantificó el porcentaje
de insectos que mostraron signos característicos de M. anisopliae (Anexo D).

Figura 7. Cámara húmeda de adulto de D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

29
5.6 DISEÑO ESTADÍSTICO

Todos los bioensayos se organizaron bajo un diseño completamente aleatorio

(DCA) con cinco repeticiones en todos los tratamientos. La unidad experimental la
conformó 10 adultos de D. neivai. Los tratamientos evaluados en cada bioensayo
fueron cinco concentraciones y dos testigos; un testigo con Tween (0,1%) y uno sin
ninguna aplicación. El análisis de los datos se realizó mediante un análisis de
varianza (ANAVA), una prueba de comparación de medias Tukey (α=0,05)
utilizando el programa estadístico SAS® (Versión 9.4) y un análisis Probit para
determinar la CL50 y el TL50.

5.7 VARIABLES EVALUADAS

5.7.1 Mortalidad. Número de adultos encontrados muertos diariamente en relación

con la cantidad inicial de adultos de cada unidad experimental.

5.7.2 Eficacia. Determinada en los tratamientos evaluados mediante la corrección

con el testigo absoluto con la fórmula Schneider – Orelli54.

5.7.3 Esporulación. Número de adultos con signos de esporulación típicos de M.

anisopliae en relación con el número de adultos muertos de cada tratamiento.

𝐴−𝐵
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑎 = [ ] × 100
100 − 𝐵

En donde A es igual a la mortalidad en el tratamiento y B corresponde a la mortalidad

en el testigo absoluto.

5.8 COVARIABLES

5.8.1 Tiempo de mortalidad medio (TL50). Número de días necesarios en que el

50% de la población de los adultos de D. neivai presentó mortalidad.

5.8.2 Concentración letal media (CL50). Concentración necesaria en conidias/mL

que causó 50% de mortalidad en los adultos de D. neivai.

54ZAR, J H. Biostatistical Analysis [en linea]. 4 ed. Estados Unidos : Prentice Hall, 1999. 663 p.
Disponible en : URL: https://books.google.com.co/books?id=edxqAAAAMAAJ.

30
 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 MORTALIDAD DE Demotispa neivai (Bondar.)

En el primer bioensayo se encontraron diferencias estadísticas entre los

tratamientos evaluados (p = 0,0357; f = 2,67; gl = 6,28) (Ver Anexo E). La mortalidad
de adultos de D. neivai causada por la cepa CPMa1502 de M. anisopliae fue menor
al 8% en las cinco concentraciones evaluadas luego de 12 días de evaluación. Sin
embargo, no se encontraron diferencias estadísticas en la mortalidad del testigo
absoluto, del testigo Tween 80 y en la mortalidad causada por las diferentes
concentraciones excepto la concentración de 1 x 107 conidias/mL (Tabla 2).

Uno de los adultos muertos registró signos de esporulación en cámara húmeda. Por
lo tanto, se envió al Departamento de Bioproductos de Agrosavia para el aislamiento
del hongo y su posterior reproducción.

Tabla 2. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 12 días después de la

inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el primer bioensayo.

Concentración Mortalidad Intervalo de

Hongo
(Conidias/mL) promedio (%) Confianza (α=0,05)
CPMa1502 1 x 104 2 ab 3,92
CPMa1502 1 x 105 8 ab 3,92
CPMa1502 1 x 106 4 ab 4,8
CPMa1502 1 x 107 0b -
CPMa1502 1 x 108 6 ab 4,8
Tween 80 (0,1%) - 2 ab 3,92
Testigo absoluto - 10 a* 6,2

Fuente: elaboración propia.

En el segundo bioensayo se encontraron diferencias estadísticas entre los

tratamientos (p = 0,0002; f = 6,8; gl = 6,28) (Anexo F). La mayor mortalidad de
adultos de D. neivai la registró el hongo inoculado en la mayor concentración y fue
estadísticamente diferente a los dos testigos (Tabla 3). Las demás concentraciones
evaluadas no mostraron diferencias con los testigos. El porcentaje de esporulación
en cámara húmeda de los adultos muertos por el hongo en las dos mayores
concentraciones fue mayor al 70% (Tabla 3). El testigo con Tween 80 (0,1%) no
presentó diferencias con el testigo absoluto y es tolerable la mortalidad que

*Letras iguales en la misma columna indican que no se encontraron diferencias de acuerdo con la
prueba Tukey (=0,05)

31
presentó, debido a que los insectos fueron colectados de campo y confinados en
laboratorio55.
Se presentó esporulación de M. anisopliae en el testigo con Tween 80 (0,1%).
Posiblemente por contaminación cruzada en laboratorio, al manipular los insectos.
Tanada y Kaye menciona que estas infecciones pueden presentarse en insectos de
cría o de confinamiento56 y los conidios de los hongos entomopatógenos como M.
anisopliae pueden permanecer adheridos a diferentes partes del insecto en tiempos
prolongados, hasta encontrar condiciones ambientales favorables para su posterior
infección57. Los adultos esporulados se enviaron al Departamento de Bioproductos
de Agrosavia para el aislamiento del hongo y su posterior reproducción.
Tabla 3. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 15 días después de la
inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el segundo
bioensayo.
Intervalo
Mortalidad Esporulación
Concentración de
Hongo promedio en cámara
(Conidias/mL) confianza
(%) húmeda (%)
(α = 0,05)
CPMa1502 1 x 104 10 b 10,7 0
CPMa1502 1 x 105 18 b 11,4 11,1
CPMa1502 1 x 106 14 b 13,3 28,6
CPMa1502 1 x 107 34 ab 14,7 70,6
CPMa1502 1 x 108 54 a* 10 88,5
Tween 80 (0,1%) - 18 b 7,3 11,1
Testigo absoluto - 10 b 15,2 0

Fuente: elaboración propia.

El hongo utilizado en el primer bioensayo se reprodujo a partir del aislamiento puro

conservado en el Banco de Microorganismos de Cenipalma en el Departamento de
Bioproductos de Agrosavia con vigorosidad evaluada al cabo de 16 h de 90% y
germinación a las 24 h de 100% (Dato suministrado por Agrosavia).

55 VILLAMIZAR R, Laura Fernanda y COTES, Alba Marina. Efecto de las condiciones de cultivo sobre
parámetros del modo de acción de Metarhizium anisopliae. Revista Colombiana de Entomología.
2003, vol. 29, nro. 2. p. 123.
56 TANADA y KAYA. Op. cit., p. 68.
57 IGNOFFO, C M. Environmental factors fffecting persistence of entomopathogens. The Florida

Entomologist [en linea]. 1992, vol. 75, nro. 4. p. 516. DOI: 10.2307/3496133.
* Letras iguales en la misma columna indican que no se encontraron diferencias de acuerdo con la

prueba Tukey (=0,05).

32
La conservación de hongos entomopatógenos durante tiempos prolongados afecta
a los conidios58. Además, la continuidad de pases por el medio de cultivo y sin
pasarlos por el insecto hospedero afecta su virulencia59 lo cual quedó evidenciado
en el primer bioensayo. El segundo bioensayo, se llevó a cabo con el hongo que se
reprodujo a partir de un adulto esporulado registrado en el primer bioensayo. La
mortalidad paso de 8% del primer bioensayo a 54% en el segundo, mostrando un
aumento en la virulencia.

En el tercer bioensayo se encontraron diferencias estadísticas en los tratamientos

(p < 0,0001; f = 11,22; gl = 6,28) (Anexo G). La mayor mortalidad la causó el hongo
inoculado en la concentración mayor (1 x 108 conidios/mL) y fue estadísticamente
diferente con los dos testigos y las demás concentraciones evaluadas. La mortalidad
del tratamiento con Tween 80 (0,1%) no es estadísticamente diferente al testigo.
Por tanto, la mortalidad que presentó no es causada por efecto de la inoculación
con Tween 80®. El mayor porcentaje de adultos con signos de esporulación típicos
de M. anisopliae (Figura 8), en cámara húmeda fue del 87,2% (Tabla 4).

Figura 8. Esporulación de M. anisopliae CPMa1502 en D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

58 RAMÍREZ GARCÍA, Emilio, et al. Patogenicidad de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana

sobre mosca blanca (Bemisia tabaci)*. Revista Mexicana de Ciencias agrícolas. 2013, Especial 6.
p. 1137.
59 FARGUES y ROBERT. Op. cit., p. 582.

33
Tabla 4. Mortalidad de adultos de D. neivai registrada 15 días después de la
inoculación del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 durante el tercer bioensayo.

Intervalo
Mortalidad Esporulación
Concentración de
Hongo promedio en cámara
(Conidias/mL) confianza
(%) húmeda (%)
(α = 0,05)
CPMa1502 1 x 104 4c 4,8 0
CPMa1502 1 x 105 18 bc 7,3 22,2
CPMa1502 1 x 106 24 bc 15,9 41,7
CPMa1502 1 x 107 44 b 23,7 81,8
CPMa1502 1 x 108 78 a* 16,9 87,2
Tween 80 (0,1%) - 28 bc 15,7 0
Testigo absoluto - 14 bc 4,8 0

Fuente: elaboración propia.

En la tercera inoculación y último bioensayo, la mortalidad causada por la cepa

CPMa1502 de M. anisopliae fue de 78% en la máxima concentración; ocasionada
por la recuperación de la virulencia luego de la inoculación continua sobre el
hospedero60; coincidiendo con los trabajos de Cenicafé con B. bassiana sobre la
broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae)61, y
Ferron que aumentó la virulencia de una cepa de M. anisopliae mediante pase por
coleópteros de la familia Scarabaeidae como hospederos62.

La virulencia del hongo puede ser afectada por diversos factores bióticos y abióticos;
entre los cuales se encuentran: las características biológicas de la cepa CPMa1502
de M. anisopliae. Inicialmente desde el medio y el efecto de sus componentes, el
estado de preservación del hongo en tiempos prolongados y otras características
de la virulencia como la adherencia de conidias infectivas sobre el integumento del
insecto, liberación de enzimas (Actividad enzimática de proteasas, lipasas y

* Letras iguales en la misma columna indican que no se encontraron diferencias de acuerdo con la
prueba Tukey (=0,05)
60 TANADA y KAYA. Op. cit., p. 603.
61 GONZÁLEZ-GARCÍA, M T; Posada Flores, F J., y Bustillo P, A E. Desarrollo de un bioensayo para

evaluar la patogenicidad de Beauveria bassiana sobre Hypothenemus hampei. Cenicafé (Colombia)

1993, vol. 44, nro. 3. p. 98. [En línea]. Disponible en: http://www.sidalc.net/cgi-
bin/wxis.exe/?IsisScript=orton.xis&method=post&formato=2&cantidad=1&expresion=mfn=045786.
62 FERRON. Op. cit., p. 582.

34
quitinasas) sobre la cutícula del insecto. Además, los factores ambientales como la
temperatura y la humedad relativa que influyen en la germinación de conidias63.

6.1.1 Eficacia. No se calculó la eficacia en las concentraciones evaluadas del primer

bioensayo, debido a la baja mortalidad que presentó. La eficacia del segundo
bioensayo presentó diferencia estadística en las concentraciones evaluadas (p =
0,0421; f = 3,02; gl = 4,20) (Anexo H). La eficacia máxima, en la concentración más
alta fue de 45% y no presentó diferencias estadísticas con las demás
concentraciones según la prueba Tukey (α=0,05). En el tercer bioensayo se
encontró diferencias significativas en las concentraciones evaluadas (p = < 0,0001;
f = 13,18; gl = 4,20) (Anexo J). La concentración 1 x 108 conidias/mL fue
estadísticamente diferente con relación a las demás concentraciones (Figura 9).

Los resultados de eficacia sugieren la estabilidad biológica de la cepa. En las

concentraciones evaluadas estadísticamente son similares en las concentraciones
menores a 1 x 108 conidias/mL en los dos últimos bioensayos; sin embargo, la
eficacia en la concentración más alta, fue estadísticamente diferente en el tercer
bioensayo.

Figura 9. Comparación de la eficacia de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae en los

bioensayos 2 y 3, evaluados mediante la corrección de la mortalidad con el testigo
absoluto.

100
90
a*
Eficacia (%)

80
70
60
50 a
40 b
a
30
20 a a a b
b
10 b
0
1 x 10e4 1 x 10e5 1 x 10e6 1 x 10e7 1 x 10e8
Concentración conidias/mL
Bioensayo 2 Bioensayo 3

Fuente: elaboración propia.

63 JACKSON, Mark A; DUNLAP, Christopher A., y JARONSKI, Stefan T. Ecological considerations

in producing and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol. The Ecology of
Fungal Entomopathogens [en linea]. 2010, vol. 55, nro. 1. p. 137. ISBN 9789048139651. DOI:
10.1007/978-90-481-3966-8_10.

35
6.2 CONCENTRACIÓN LETAL (CL50)

La concentración letal del primer bioensayo no se determinó debido a la baja

mortalidad registrada en todos los tratamientos.

En el segundo bioensayo la CL50 fue de 1,23 x 108 conidias/mL, con límite inferior
de 2,69 x 107 conidias/mL y límite superior de 2,19 109 conidias/mL evaluando las
diferentes concentraciones durante 15 días (Anexo K).

En el tercer bioensayo la CL50 fue de 9,37 x 106 conidias/mL con límite inferior de
4,48 x 106 conidias/mL y límite superior de 2,35 x 107 conidias/mL (Anexo L). La
CL50 del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502 sobre adultos de D. neivai disminuyó
un 92,4% luego de realizar tres inoculaciones in vivo (Tabla 5).

Tabla 5. Concentración letal media (CL50) del hongo M. anisopliae cepa CPMa1502
luego de tres inoculaciones sucesivas sobre adultos de D. neivai.

CL50 Pr > Límite Límite

Pase
(Conidias/mL)
DF X2 inferior Superior
ChiSq
1 - - - - -
2 1,23 x 108 3 3,94 0,243 2,69 x 10 2,19 x 109
7

3 9,37 x 106 3 3,48 0,324 4,48 x 106 2,35 x 107

Fuente elaboración propia.

La CL50 en la virulencia de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae en los bioensayos

2 y 3 se redujo un 92,4% y el tiempo letal en 4,5 días. Las diferencias de la cepa
pueden estar originada a factores como: el estado de conservación de la misma
para el primer bioensayo, y la inoculación continúa sobre el hospedero64. La
mortalidad varió en cada una de las concentraciones en los diferentes bioensayos,
debido que a concentraciones más altas existe una mayor exposición de conidias
infectivas sobre el insecto65.

6.3 TIEMPO DE MORTALIDAD MEDIO (TL50)

El tiempo letal medio en el bioensayo uno no se determinó debido a la baja

mortalidad registrada durante el bioensayo. El TL50 en el segundo bioensayo fue de
10,56 días con límite inferior de 9,46 días y superior de 12,03 días.

64 FARGUES y ROBERT. Op. cit., p. 582.

65 MARCUS, R y EAVES, D M. Bioassays of entomopathogenic microbes and nematodes. En:
NAVON, A y ASCHER, K.R.S (dir.), Statistical and computational analysis of bioassay data [S. l.] : [s.
n.], 2000, p. 278. ISBN 0851994229.

36
El TL50 en el tercer bioensayo fue de 6,07 días, con límite inferior de 5,48 y superior
de 6,67 días (Tabla 6). Los resultados indican una disminución de 4,5 días para
causar una mortalidad igual al 50% en adultos del raspador de los frutos.
Tabla 6. Tiempo letal medio de mortalidad (TL50) del hongo M. anisopliae cepa
CPMa1502 luego de tres inoculaciones sucesivas sobre adultos de D. neivai.

Límites de confianza
Pr >
Pase TL50 (Días) DF X2 TL50
ChiSq
Inferior Superior
2 10,56 13 16,11 0,243 9,47 12,04
3 6,07 13 9,71 0,718 5,48 6,67

Fuente: elaboración propia.

El tiempo letal medio TL50 se determinó en los dos bioensayos en la concentración

más alta, debido a que presentó diferencias significativas estadísticamente.
Además, es recomendable determinar el tiempo letal para cada concentración o
dosis utilizada en los bioensayos, relacionando la mortalidad ocurrida diariamente66.

66ROBERTSON, Jacqueline, et al. Bioassays with arthropods [en linea]. 3ra. ed. [S. l.] : Taylor y
Francis Group, 2017. 213 p. DOI: 10.1201/9781315373775.

37
 7. CONCLUSIONES

La inoculación sucesiva de adultos de D. neivai con la cepa CPMa1502 de M.

anisopliae es eficaz para recuperar la virulencia del hongo.

La concentración letal media (CL50) y el tiempo letal medio (TL50) disminuyeron

luego de las inoculaciones sucesivas del hongo sobre los adultos de D. neivai
mostrando una recuperación de la actividad biológica del hongo.

38
 8. RECOMENDACIONES

Evaluar la cepa CPMa1502 de M. anisopliae en estados inmaduros del raspador de

frutos D. neivai con el fin de conocer la actividad biológica (Virulencia) en otros
estados de desarrollo y determinar su virulencia luego de la reactivación.

Determinar la actividad biológica (Virulencia) de los pases sucesivos en medio de

cultivo de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae con el fin de determinar cuándo es
necesario la reactivación en el insecto.

Determinar la virulencia de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae en condiciones de

campo con el fin de conocer su virulencia, y posteriormente poder adquirirse en un
programa de manejo integrado de este insecto en el cultivo de palma de aceite.

39
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44
ANEXOS

45
Anexo A. Estados fenológicos de E. guineensis seleccionados para alimento y
colecta de adultos de D. neivai.

Estadío 709 Estadío 705

Estadío 709: es la última fase de desarrollo y
llenado) comienza 79 días después de la
antesis, y el fruto alcanza el 90% de su
tamaño final y el endospermo es totalmente
endurecido.

Estadío 705: 59-61 días después de la

antesis, el fruto alcanza el 80% de su tamaño
final y tiene mesocarpio verde; el endospermo
se encuentra en estado gelatinoso.

Estadío 703: 28-31 días después de antesis.

Alcanza el 30% de tamaño del fruto, el
endospermo se encuentra de forma líquida.
Estadío 703

Fuente: elaboración propia. Basado en: FORERO, D.C, HORMAZA, P. y ROMERO, Hernán
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46
Anexo B. Fotos representativas de escala de daño causado por D. neivai en racimos
cortados de E. guineensis.

Escala 3 Escala 4

Escala 3: Daño de 41% hasta 60% en

los racimos.

Escala 4: Daño de 61% hasta 80% en

los racimos.

Escala 5: Daño de 81% hasta 100% en

los racimos.

Escala 5

Fuente: elaboración propia. Basado en: VALENCIA, Carolina, et al. Evaluación de estrategias de
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de la palma de aceite [imagen]. Revista Palmas. Bogotá D.C. 2007. vol. 28, nro. 1. 45 p

Anexo C. Protocolo de ajuste de concentraciones para la cepa CPMa1502 de M.

anisopliae.
Se realizó a partir de un medio de cultivo totalmente esporulado de la cepa
CPMa1502 de M. anisopliae reproducido en el Departamento de Bioproductos de
Agrosavia. Para ello, se preparó una suspensión de Tween 80 (0,1%) de 100 mL,
se removieron las esporas con una espátula y posteriormente se agitaron con el
vórtex durante 1 min. A partir de esta suspensión se extrajo 1 mL de la suspensión
inicial (Solución madre) y se agregó a una muestra de 9 mL de solución de Tween
80 (0,1%), considerada como la submuestra 10-1, se repite el procedimiento
extrayendo 1 mL de la dilución (10-1) y se adiciona nuevamente de la misma manera

47
de (10-2) hasta llegar a obtener la dilución 10-3. Para el conteo de conidios se agitó
con el vórtex el tubo de la dilución utilizada (10-3) por 1 min y se extrajo 10 µL con
la ayuda de una micropipeta y se depositó en la cámara Neubauer de manera que
pueda entrar por capilaridad. Posteriormente se dejó reposar un momento y se
ajustó el objetivo a 10X en el microscopio observando nítidamente el cuadrante
central, luego se pasó al objetivo 10X (Figura 10).
Figura 10. Cámara Neubauer en un objetivo 10X.

Fuente: elaboración propia.

Se procedió al conteo de conidios; el recuento se determinó sumando el total de

conidios en los 25 cuadrantes de la zona central de la cámara conformada por 16
cuadros. A cada submuestra se le realizó el mismo procedimiento. Para la
determinación de la concentración de conidios por mililitro (Conidios/mL), se
multiplicó el promedio de conidios observados con el factor inverso de la dilución
utilizada (10-3=103) por el factor de la cámara1.
Para ajustar las concentraciones de los diferentes tratamientos en los bioensayos
se utilizó la fórmula:

𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2
C1= Concentración inicial.
V1= Volumen inicial (Solución madre).
C1= Concentración que deseamos obtener.
V2= Volumen desconocido.

Anexo D. Protocolo de cámaras húmedas utilizado para determinar signos

característicos del hongo entomopatógeno M. anisopliae en adultos de D. neivai.

1Fuente: VÉLEZ A, Patricia, et al. Técnicas para el control de calidad de formulaciones de hongos
entomopatógenos. Cenicafé. Chinchiná Caldas (Colombia): Cenicafé, 1997, nro. 17. p. 8.

48
La cámara húmeda la conformó dos cajas de Petri, de dimensión 90 mm x 16 mm y
una caja de 50 mm x 15 mm, un algodón tipo odontológico. La cámara húmeda se
envolvía con papel aluminio y luego se esterilizó en autoclave, durante 15 min a una
presión de 15 psi (Figura 11).

Figura 11. Cámaras húmedas.

Fuente: elaboración propia.

Con el fin de determinar la patogenicidad de la cepa CPMa1502 de M. anisopliae

sobre adultos de D. neivai, se colectaron los adultos muertos de cada tratamiento
evaluado diariamente. Para ello, los insectos muertos se manipularon con ayuda de
un pincel (nro. 00) y se dispusieron 2 mecheros encendidos con etanol (96%)
durante todo el proceso de la cámara húmeda. Los insectos se sumergieron durante
un minuto en hipoclorito de sodio (NaClO) ajustado al 1% y luego se lavaron tres
con agua purificada estéril (APE). Finalmente, cada adulto se secó con una toalla
estéril y pasado a la cámara húmeda acompañado del algodón previamente
humedecido.

Se registraron los signos de infección por observación, después de 10 días de estar

el insecto en la cámara húmeda, se caracterizó de acuerdo con las características
de otros autores del hongo entomopatógeno de M. anisopliae2. Se describió:
micelación blanca sobre el integumento del insecto (Figura 12).

2OBANDO B, Johanna Andrea, et al. Selección de cepas de Metarhizium anisopliae para el control
de Aeneolamia varia (Hemiptera: Cercopidae). Revista Colombiana de Entomología [en línea]. 2013,
vol. 55, n 1, p. 41‑46. DOI: 10.1016/0022-2011(90)90030-A.

49
Figura 12. Micelación blanca típica de M. anisopliae sobre adultos de D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

Liberación de conidios: esporas de color verde oliva u opaco del hongo (Figura 13)

Figura 13. Esporulación de M. anisopliae luego de 10 días en cámara húmeda sobre

adulto de D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

Los insectos que no presentaron las características mencionadas se registraron

como contaminación (Figura 14).

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Figura 14. Hongo contaminante sobre adulto de D. neivai.

Fuente: elaboración propia.

Anexo E. Análisis de varianza del primer bioensayo (pase 1).

Sistema SAS
Procedimiento GLM
Variable dependiente: Mortalidad
Fuente DF Suma de Cuadrado de la F-Valor Pr > F
cuadrados media
Modelo 6 388.571429 64.761905 2.67 0.0357
Error 28 680.000000 24.285714
Total 34 1068.571429
corregido

Fuente: elaboración propia.

Anexo F. Análisis de varianza del segundo bioensayo (pase 2).

Sistema SAS
Procedimiento GLM

Variable dependiente: Mortalidad

Fuente DF Suma de Cuadrado de la F-Valor Pr > F
cuadrados media
Modelo 6 7748.57143 1291.42857 6.80 0.0002

51
Fuente DF Suma de Cuadrado de la F-Valor Pr > F
cuadrados media
Error 28 5320.00000 190.00000
Total 34 13068.57143
corregido

Fuente: elaboración propia.

Anexo G. Análisis de varianza del tercer bioensayo (pase 3).

Sistema SAS
Procedimiento GLM

Variable dependiente: Mortalidad

Fuente DF Suma de Cuadrado de la F- Pr > F
cuadrados media Valor
Modelo 6 18080.00000 3013.33333 11.22 <.0001
Error 28 7520.00000 268.57143
Total 34 25600.00000
corregido

Fuente: elaboración propia.

Anexo H. Análisis de varianza de eficacia del segundo bioensayo (pase 2).

Sistema SAS
Procedimiento GLM
Variable dependiente: Eficacia
Fuente DF Suma de Cuadrado de la F- Pr > F
cuadrados media Valor
Modelo 4 4232.18272 1058.04568 3.02 0.0421
Error 20 6999.80448 349.99022
Total 24 11231.98720
corregido

Fuente: elaboración propia.

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Anexo J. Análisis de varianza de eficacia del tercer bioensayo (pase 3).

Sistema SAS
Procedimiento GLM
Variable dependiente: Eficacia
Fuente DF Suma de Cuadrado de la F- Pr > F
cuadrados media Valor
Modelo 4 18210.36162 4552.59041 13.18 <.0001
Error 20 6907.94264 345.39713
Total 24 25118.30426
corregido

Fuente: elaboración propia.

Anexo K. Análisis de probabilidad de concentración letal del segundo bioensayo.

Sistema SAS

Procedimiento Probit
Análisis Probit en Concentración
Probabilidad Concentración 95% Límites fiduciales
0.01 20.20332 0.01516 565.39213
0.02 126.04654 0.28008 2196
0.03 402.71849 1.77146 5223
0.04 964.92862 7.06381 10069
0.05 1964 21.68031 17235
0.06 3597 56.12266 27327
0.07 6114 128.80344 41066
0.08 9830 270.14781 59326
0.09 15142 528.17346 83161
0.10 22535 975.89216 113850
0.15 116897 11795 439261
0.20 432541 77153 1423303
0.25 1328958 337038 4474548
0.30 3641554 1087706 14577350

53
 Análisis Probit en Concentración
Probabilidad Concentración 95% Límites fiduciales
0.35 9267256 2830473 49561677
0.40 22484692 6424579 172820343
0.45 53004995 13450731 610856889
0.50 123265604 26917611 2188331553

Fuente: elaboración propia.

Anexo L. Análisis de probabilidad concentración letal del tercer bioensayo.

Sistema SAS

Procedimiento Probit
Análisis Probit en concentración
Probabilidad Concentración 95% Límites fiduciales
0.01 865.67564 53.95271 4813
0.02 2571 226.11723 11714
0.03 5129 559.57240 20659
0.04 8624 1104 31724
0.05 13159 1916 45043
0.06 18856 3058 60787
0.07 25848 4603 79160
0.08 34282 6629 100392
0.09 44321 9228 124745
0.10 56142 12500 152510
0.15 149410 43302 355339
0.20 325260 113630 711993
0.25 633982 253718 1324380
0.30 1154432 508405 2374065
0.35 2011716 941955 4190599
0.40 3407536 1646310 7380807

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 Análisis Probit en concentración
Probabilidad Concentración 95% Límites fiduciales
0.45 5673857 2757092 13080032
0.50 9371425 4483780 23462267

Fuente: elaboración propia.

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