Obketivos

Marco teorico

FIJACIÓN DEL NITRÓGENO

BACTERIAS NITRIFICANTES EN RAICES LEGUMINOSAS

Rhizobium, sido considerado siempre sólo desde el punto de vista de la bacteria fijadora en simbiosis
mutualista con su leguminosa correspondiente se conoce de su naturaleza microsimbionte. Sin embargo, los
diferentes estudios realizados a lo largo del tiempo han proporcionado datos sobre aspectos desconocidos,
algunos de los cuales con interesantes implicaciones en patología animal y vegetal.

Rhizobium, como se ha visto recientemente, es capaz de deslizarse de una forma organizada por una
superficie semisólida como algunos patógenos de animales o plantas, Proteus o Peudomonas,
respectivamente. Este caracter se ha asociado en estas últimas bacterias a una mayor capacidad invasora,
mejor adhesión o a la facilidad para la formación de biopelículas.

Otro aspecto a considerar es la relación que existe entre simbiosis mutualista, como la establecida entre
Rhizobium y su leguminosa, y patogénesis. Toda planta manifiesta una respuesta defensiva, de semejante
naturaleza, frente a cualquier estrés biótico o abiótico. Ante la presencia de un agente, como pueda ser
Rhizobium, y otro patógeno, la planta inicialmente no distingue, pero no tarda en responder para
defenderse de este último o para poner en marcha mecanismos que permitan la infección controlada por el
primero. Relacionado con defensa, pero indirectamente, Rhizobium ha sido reconocido ampliamente como
un agente de biocontrol.

En cuanto a los nódulos, dentro de ellos por actividades enzimáticas se desarrolla la fijación del nitrógeno. El
nitrógeno, es uno de los factores más importantes que limitan el crecimiento de las plantas y representa
más del 70 % de los costos por fertilizantes en los países en desarrollo. En la atmósfera el nitrógeno está
estado gaseoso (N2) y no puede ser aprovechado por los organismos superiores. La capacidad de las
leguminosas eficientemente noduladas de tomar aquel elemento de la atmósfera, la independizan total o
parcialmente de la absorción de nitrógeno. La fijación biológica del nitrógeno en la naturaleza es una
propiedad única que tienen unos pocos organismos provistos de información genética para la síntesis de la
enzima Nitrogenasa, la cual Ésta cataliza la conversión de nitrógeno molecular (N2) a amoníaco, a
temperatura ambiente y presión atmosférica normal.

La bacteria entra en la planta por intermedio de un pelo radicular, a través de un hilo de infección (rápida
multiplicación de los Rhizobium) llega así a una célula interna de la raíz, se transforma en bacteroide y
comienza su multiplicación. Son efectivas hasta una temperatura de 35ºC por encima de la cual pierden
totalmente la capacidad de infectar y fijar N.

La formación de los nódulos en las raíces de las leguminosas, es una de las etapas de la fundamental
importancia en el proceso de fijación biológica de nitrógeno. Ya que la simbiosis entre la planta y la bacteria
(Rhizobium) es altamente exitosa. Y consiste en que el rhizobium entrega a la planta nitrógeno en forma
asimilable para la misma, y a su vez, la planta suministra las sustancias nutritivas que necesita el Rhizobium
para cumplir sus funciones vitales.
Una de las características importantes de estas bacterias es la especificidad, debido a que la leguminosa de
frijoles, no producirán nodulación en soja. Con excepción de Rhizobium Leguminusarum, que nodula tanto
en lenteja, como en arveja y vicia.

Rhizobium Leguminusarum

La efectividad se relaciona la producción de amoníaco, como compuesto fundamental incorporado a los

compuestos orgánicos del torrente circulatorio de las leguminosas. En este proceso intervienen la enzima
Nitrogenasa que cataliza la reacción química fundamental (la transformación de nitrógeno atmosférico en
amoníaco). Para su máxima eficiencia debe trabajar a muy bajas tensiones de oxígeno.
Es importante señalar que cuando más temprano ocurre el proceso de formación de nódulos, estos tendrán
mayor período de vida activa, por lo que entregarán mayor cantidad de nitrógeno a las plantas, como así
también, habrá mayor cantidad de nitrógeno en los sectores radiculares.
Otro factor a tener en cuenta es la ubicación de los nódulos en la raíz. Los de mayor eficiencia son aquellos
situados en el cuello de la raíz, y los ubicados en el tercio superior de la misma. Nódulos ubicados por debajo
del tercio superior de la raíz o en raíces secundarias, normalmente son poco eficientes y son característicos
de infecciones tardías, producidas por flora naturalizada del suelo.
No se puede inferir que a mayor cantidad de nódulos, mayor fijación de nitrógeno. Pueden existir nódulos
abundantes y grandes a simple vista, pero al efectuar el corte de los mismos, se observa una corteza gruesa
y una diminuta superficie activa, lo cual puede deberse al empleo de cepas ineficientes o a que los nódulos
han sufrido condiciones adversas en algún período de sus vidas.

FACTORES EXTERNOS: El máximo potencial de fijación se logrará siempre que las condiciones del medio
sean las apropiadas. Para su mejor interpretación, a estos factores externos los dividimos en factores de
naturaleza física, química y biológica.

FACTORES DE NATURALEZA FÍSICA:

Oxígeno Nitrógeno

Humedad edáfica: Luz

Temperatura edáfica:

FACTORES DE NATURALEZA QUÍMICA:

Nitrógeno Fósforo

Potasio Microelementos

MATERIALES

TSA, Balanza, Erlenmeyer, Agua destilada, Espátula, Probeta, Cajas Petri, Autoclave, Cámara de flujo, Vaso
de precipitación, Algodón, Alcohol, Papel aluminio, Mechero, Varilla de vidrio.

PROCEDIMIENTOS

Procedimiento para medio de cultivo

Procedemos a pesar 10gr de TSA.

ponemos10gr de TSA en un Erlenmeyer de 100ml.
Medimos 250ml de agua destilada en una probeta.
Colocamos los 250ml de agua destilada en el Erlenmeyer con el TSA
Calentamos agua en un vaso de precipitación para disolverel TSA
Hacemos un tapón de algodón y colocamos en el erlenmeyer cubriéndolo también con papel
aluminio.
Colocamos el erlenmeyer con el TSA en el autoclave.
Luego de autoclavar el medio pasamos a la cámara de flujo para pasar el medio a las cajas petri.
Dejamos secar el medio y ya podemos trabajar con las cajas

Procedimiento para Aislamiento de RHIZOBIUMA partir de nódulos:

1. Lavar al grifo la raíz.

2. Seleccionar los nódulos grandes y rosados.
3. Esterilizar la superficie de los nódulos con HgCl2 al 2,5 % durante 2 min.
4. Lavar cinco veces con agua estéril.
5. Machacar los nódulos con una varilla de vidrio en una placa estéril.
6. Sembrar con la misma varilla sobre placas con agar nutritivo TSA.
7. Incubar las placas 5 días a temperatura ambiente.

8. Aislar las colonias por agotamiento en estría sobre placas con agar nutritivo en este caso en el TSA que
preparamos con anterioridad

Procedimiento para tinción de gram

Se toma una muestra de la bacteria en la placa y utilizamos los colorantes de la tinción

Tinción: cristal violeta, 1 minuto.

Enjuague
Mordiente: Yodo o lugol, 1 minuto.
Enjuague
Decoloración: alcohol acetona.
Enjuague.
Tinción de contraste: Safranina , 1 minuto.
Enjuague

Resultados

En las placas tomadas, observamos que las bacterias eran cocos y bacilos

eran grampositivos y gramnegativos es decir mixtas

La morfología de la bacteria era la siguiente:

Según el tamaño: pequeña

Según el borde: irregular.

Según el elevamiento: es plana o en disco.

Según la consistencia: es viscosa y pegajosa.

Según la superficie: mate.

Pigmento: es de color crema amarilleto