Control de calidad de medios de Cultivos

Bermudez, E. Adrián; Mantilla, D. Naysha; Salazar, S. Sarima.

Aseguramiento de la calidad, grupo A, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de

Microbiología
Universidad de Pamplona.
07 de octubre del 2019

Objetivos generales.
- Aplicar el método ecométrico para la evaluación de los medios de cultivo propuestos en el laboratorio.
Objetivos específicos.
- Hallar e interpretar los resultados obtenidos referentes al ICA.
- Evaluar la preparación de los medios de cultivo, obteniendo valores que demuestren la esterilidad de estos.
- Observar el grado de contaminación microbiana en el espacio de trabajo o laboratorio y de esto contemplar
posibles alteraciones del control de calidad realizado.
Resumen
Es necesario crear nuevas formulaciones y tipos de medios de cultivo que permitan la recuperación y aislamiento de
cepas de interés. Por esto, existen métodos que permiten verificar el rendimiento y la selectividad en un medio de
cultivo, o por controlar y verificar la calidad de los medios comerciales y su preparación a la hora de utilizarlos. En
esta práctica de determinó el índice de crecimiento absoluto (ICA) para los medios EMB, Salado manitol y Agar
nutritivo, por medio de la utilización del método ecométrico. También se verificó la esterilidad de los mismos y se
evaluó el ambiente del laboratorio en función a los niveles aceptables que indican las normas.
Resultados:

INDICE DE CRECIMIENTO ABSOLUTO (ICA) PARA PRODUCTIVIDAD EN MEDIO AGAR

NUTRITIVO
S. aureus E. coli
CUADRANT
ESTRIA PRUDUCTIVIDAD CUADRANTE ESTRIA PRUDUCTIVIDAD
E
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 CRECIMIENTO
Cuadrante 1 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 1 Estría 3 CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 CRECIMIENTO
Cuadrante 2 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 2 Estría 3 CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 CRECIMIENTO
Cuadrante 3 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 3 Estría 3 CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 CRECIMIENTO

1
 Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 CRECIMIENTO
Cuadrante 4 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 4 Estría 3 CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 CRECIMIENTO
Estría central CRECIMIENTO Estría central CRECIMIENTO

Total de
Total de estrías Calculo y resultado Calculo y resultado
estrías
ICA 20*0,2= 4,0 ICA 20 estrías más 20*0,2= 4,0
20 estrías más 1
1*1= 1 1 estría 1*1= 1
estría central
ICA =5,0 central ICA =5,0
Tabla 1. Reporte de productividad para agar nutritivo

INDICE DE CRECIMIENTO ABSOLUTO (ICA) PARA PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD DEL

MEDIO EMB
TARGET E. coli NO TARGET S. aureus
CUADRANTE ESTRIA PRUDUCTIVIDAD CUADRANTE ESTRIA PRUDUCTIVIDAD
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 1 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 1 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 2 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 2 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 3 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 3 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 4 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 4 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría central CRECIMIENTO Estría central NO CRECIMIENTO
Total de
Total de estrías Calculo y resultado Calculo y resultado
estrías
ICA 20*0,2= 4,0 ICA 0 estrías más
20 estrías más 1
1*1= 1 0 estría ICA=0
estría central
ICA =5,0 central
Tabla 2. Reporte de productividad y selectividad para medio EMB

INDICE DE CRECIMIENTO ABSOLUTO (ICA) PARA PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD DEL

MEDIO SALADO MANITOL
TARGET S. aureus NO TARGET E. coli

2
 CUADRANT
CUADRANTE ESTRIA PRUDUCTIVIDAD ESTRIA PRUDUCTIVIDAD
E
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 1 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 1 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 2 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 2 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 3 Estría 3 CRECIMIENTO Cuadrante 3 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría 1 NO CRECIMIENTO Estría 1 NO CRECIMIENTO
Estría 2 NO CRECIMIENTO Estría 2 NO CRECIMIENTO
Cuadrante 4 Estría 3 NO CRECIMIENTO Cuadrante 4 Estría 3 NO CRECIMIENTO
Estría 4 NO CRECIMIENTO Estría 4 NO CRECIMIENTO
Estría 5 NO CRECIMIENTO Estría 5 NO CRECIMIENTO
Estría central NO CRECIMIENTO Estría central NO CRECIMIENTO
Total de
Calculo y resultado Total de estrías Calculo y resultado
estrías
ICA 15 estrías más 15*0,2= 3,0 ICA
0 estrías más 0
0 estría 0*1= 0 ICA=0
estría central
central ICA =3,0
Tabla 3. Reporte de productividad y selectividad para medio Salado manitol

TIPO DE AGAR/TARGET-NO ICA

TARGET
A. nutritivo/ target 5.0
A. nutritivo/ target 5.0
A. EMB/ target 5.0
A. EMB/ no target 0
A. salado manitol/target 3
A. salado manitol/no target 0
Tabla 4. Cálculo del índice de crecimiento absoluto.

Medio de cultivo Resultado

Medio de Informe
Agar EMB No crecimiento cultivo
Agar Salado manitol No crecimiento EMB <1UFC/placa/15 min
Agar nutritivo No crecimiento Agar nutritivo 14UFC/placa/15 min
Tabla 5. Resultados sobre esterilidad en medio de cultivo. Tabla 6. Resultados de control de ambientes.
Análisis de resultados: El caldo tripticasa de soya tiene componentes como la
tripteína y la peptona de soya que aportan nutrientes
Composición de los medios
3
ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y
pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya
contiene alta cantidad de hidratos de carbono que
estimulan el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico. El fosfato dipotásico otorga
capacidad buffer y la glucosa es la fuente de energía.1
El medio de cultivo EMB combina las fórmulas de
Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener
un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram
negativos.2
Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece
el desarrollo microbiano. La diferenciación entre
organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa,
y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por
los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen
un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de
bacterias Gram positivas.
El agar es el agente solidificante muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un
característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la
lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
El agar nutritivo es un medio no selectivo, en el cual la
pluripeptona y el extracto de carne constituyen la
fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para
el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el
agente solidificante.3
En el medio de cultivo salado manitol, el extracto de
carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales
que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es
el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio
(que se encuentra en alta concentración) es el agente
selectivo que inhibe el desarrollo de la flora
acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el
agar es el agente solidificante.
Se trata de un medio altamente selectivo por la alta
concentración salina y diferencial debido a la
capacidad de fermentación del manitol por los
microorganismos.
4
Las bacterias que crecen en un medio con alta
concentración de sal y fermentan el manitol, producen
ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira
el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los
estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y
pueden o no fermentar el manitol.4
Verificación de la productividad y selectividad de
los medios sólidos por medio ecométrico
Para verificar la productividad de los medios de
cultivo, en este caso Eosina azul de metileno, Agar
salado manitol y Agar nutritivo, se realizó una división
en 4 cuadrantes, los cuales contenían 5 líneas donde se
sembraron microrganismos tales como Eschericia coli
(target para EMB) y Staphylococcus aureus (target
para Agar salado manitol). Para evaluar la selectividad de
los medios EMB y Agar salado manitol, se realizó el mismo
procedimiento, pero esta vez se invirtieron los
microorganismos, es decir, se sembraron los
microorganismos no target de los medios. Se inoculo cada
cepa en agar nutritivo de igual forma. Los resultados se
encuentran registrados en las tablas 1, 2 y 3.
Para cada uno de los medios se les realizó su respectivo
cálculo de índice de crecimiento absoluto (ICA),
multiplicando el número de estrías que presentaron
crecimiento por 0.2 y en caso de crecimiento en la
estría central +1. Es decir, para los resultados en la
tabla número 1, se obtuvo 20 estrías y crecimiento
positivo de la estría central, las 20 fueron multiplicadas
por 0.2 y se sumó el 1 de la estría central, como se
muestra a continuación.
20 ∗ 0.2 + 1.0 = 5,0
Todos los resultados del ICA se encuentran
consignados de manera resumida en la tabla número 4.
En base a la ISO sobre control de medios de cultivo, la
productividad de los medios de cultivos no selectivos,
en este caso Agar nutritivo, debe tener un ICA mayor
o igual a 3.5 para que este sea aceptable. Como se
puede observar en la tabla 4, el ICA obtenido para el
Agar nutritivo, con ambos microorganismos, superó el
valor aceptable por la norma, con un dato de 5.0. Esto
indica que el medio es suficientemente bueno respecto
a su productividad.
En cuanto a los medios selectivos, en esta ocasión Evaluación de medios líquidos selectivos.
Agar EMB y Agar salado manitol, el ICA de la cepa
target debe ser mayor o igual a 3. Para la cepa target
en el medio EMB se obtuvo un ICA de 5.0, mostrando INICIO
una excelente productividad, ya que sobrepasó el valor
aceptable, caso contrario al ICA de la cepa target en el
Agar salado manitol, el cual fue de 3, siendo este un
valor apenas aceptable por la norma. Ambos medios
Seleccionar 3 tubos del lote a evaluar que
cumplen con su papel de productividad, a pesar de que contengan en 3-5 ml
el EMB fue mucho más eficiente.
Ahora, para la selectividad de los medios, se considera
que un medio presenta una selectividad aceptable
cuando el ICA es superior a 3 para la cepa target y las Suspender en caldo tripticasa de soja 3-5
cepas no target tienen un ICA igual o menor a 2. colonias del microorganismo no target
Observando los valores consignados en la tabla 4, el
medio EMB presenta buena selectividad, ya que la
cepa target presenta un ICA de 5.0 y la cepa no target
un ICA de 0. En cuanto al medio Salado manitol, su Incubar a los requerimientos del
selectividad no es muy buena, porque a pesar de que la organismo de 24-48 horas
cepa no target tuvo un ICA de 0, cumpliendo con la
norma, el ICA para las cepas target no alcanza el valor
aceptable.
Control de esterilidad de los medios Ajustar suspension con espectofotometro,
evaluar tubo sin inocular
Para evaluar la esterilidad de los medios, se incubaron
a 37°C sin haber inoculado en ellos. Los resultados
obtenidos se encuentran registrados en la tabla 5.
Inocule los 3 medios a evaluar con la
Como se puede observar en la tabla 5, los 3 medios suspension ajustada e incube segun
examinados se encontraban totalmente estériles, requerimientos
presentando buenas condiciones para su uso,
permitiendo obtener resultados confiables libres de
contaminación. Sembrar por agotamiento en caja agar no
Por último, para el control de ambientes, se ubicó una selectivo con ayuda de una asa desechable
calibrada e incubar segun requerimientos
caja de agar nutritivo y EMB abierta durante 15
minutos y se pasó a incubar a 37°C durante 24 horas.
Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla 6.
Teniendo en cuenta la guía de Control microbiológico Verificar ausencia en cajas y reportar lo
observado
de ambientes y superficies el límite permisible para
cuartos de siembra y repique debe ser <1UFC, el
laboratorio donde se realizó la práctica excede los
valores permitidos, por lo tanto, se recomienda realizar
procedimientos de limpieza y desinfección en las áreas FIN
afectadas y evaluar nuevamente la misma.5

5
Conclusiones 2. Holt-Harris and Teague. 1916. J. Infect. Dis.
18:596 Recuperado de:
Los medios analizados, EMB y Agar nutritivo, cuentan
https://www.britanialab.com/back/public/uplo
con una buena productividad y selectividad, para el
ad/productos/upl_5a28240e1c004.pdf
caso de EMB, obteniendo valores del ICA superiores
a lo aceptable, por lo tanto, estos medios son muy
3. Downes and Ito (ed.). 2001. Compendium of
productivos y selectivos presentándose óptimos para el
methods for the microbiological examination
crecimiento de microorganismos deseados. Por otro
of foods, 4th ed. American Public Health
lado, el medio Salado manitol es un medio productivo
Association, Washington, D.C Recuperado de:
porque cuenta con un nivel del ICA aceptable, pero no
https://www.britanialab.com/back/public/uplo
es muy selectivo, ya que no alcanzó el valor aceptable
ad/productos/upl_5a28446b169d8.pdf
del ICA.
Por otra parte, los medios se encontraban totalmente 4. Farmacopea Nacional Argentina, Codex
estériles, indicando buenas prácticas por parte del Medicamentarius Argen- tino, Séptima
personal encargado a la hora de prepararlos. Edición, volumen 1. 2003. Control
Microbiológico de Productos no
Finalmente, el laboratorio no se encontraba en Obligatoriamente Estériles. Recuperado de:
condiciones óptimas para la realización de prácticas https://www.britanialab.com/back/public/uplo
microbiológicas, ya que presentó una contaminación ad/productos/upl_5a2ed6c53aed1.pdf
en el ambiente, pudiendo este alterar resultados a la
hora de realizar un estudio. 5. CONTROL MICROBIOLOGICO DE
AMBIENTES Y SUPERFICIES (10 de
noviembre, 2015) Recuperado de:
1. MacFaddin. 1985. Media for isolation- https://www.meta.gov.co/web/sites/default/fil
cultivation-identification maintenance of es/adjuntos/I-SA-
medical bacteria, vol. 1. Williams & Wilkins, 04%20CONTROL%20MICROBIOLOGICO
Baltimore, Md. Recuperado de: %20DE%20AMBIENTES%20Y%20SUPER
https://www.britanialab.com/back/public/uplo FICIES%20V1.pdf
ad/productos/upl_5a297c2b7a49c.pdf