Resumen

Los venenos de animales han evolucionado muchas veces. Las especies venenosas son
especialmente comunes en tres de los cuatro grupos principales de artrópodos (Chelicerata,
Myriapoda y Hexapoda), que en conjunto representan decenas de miles de especies de arañas
venenosas, escorpiones, ciempiés e himenópteros. Sorprendentemente, a pesar de su gran
diversidad de planes corporales, no hay evidencia inequívoca de que ningún crustáceo sea
venenoso. Proporcionamos la primera evidencia concluyente de que los crustáceos acuáticos,
ciegos y que habitan en cuevas son venenosos y que los venenos evolucionaron en los cuatro
grupos principales de artrópodos. Produjimos una reconstrucción tridimensional del aparato
de administración de veneno de la remezcla Speleonectes tulumensis, lo que demuestra que
los remedos pueden inyectar veneno de manera controlada. Un perfil transcriptómico de sus
glándulas de veneno muestra que expresan un cóctel único de transcripciones que codifican
toxinas de veneno conocidas, incluida una diversidad de enzimas y una probable neurotoxina
paralítica muy similar a la descrita a partir del veneno de araña. Examinamos una biblioteca
transcriptómica obtenida de animales enteros e identificamos un paralogas sin toxinas de la
neurotoxina remipeda que no se expresa en las glándulas del veneno. Esto nos permitió
reconstruir su probable origen evolutivo y subraya la importancia de incorporar datos
derivados del tejido de la glándula no venenosa para dilucidar la evolución de las proteínas
candidatas del veneno.

Palabras clave: veneno, evolución del veneno, agatoxina, EST, artrópodos venenosos.

Introducción

Los venenos han evolucionado muchas veces en el reino animal, y juegan papeles importantes
en la depredación, defensa, competencia, comunicación y defensa contra microorganismos
dañinos ( Fry et al. 2009 ; Hölldobler y Wilson 2009 ; dos Santos Pinto et al. 2012 ; Casewell et
al.2013 ). Los venenos generalmente se distinguen de los venenos por ser principalmente
productos secretores proteicos sintetizados en glándulas especializadas y por su modo activo
de entrega a través de heridas infligidas por estructuras especializadas ( Fry et al. 2009 ;
Casewell et al. 2013) Las actividades específicas de un veneno están determinadas en gran
medida por la combinación específica de sus componentes peptídicos y proteicos, que se
denominan individualmente toxinas. El estudio de la composición del veneno, que está muy
asistido por los recientes avances en tecnologías transcriptómicas y proteómicas ( Casewell et
al. 2013 ), es, por lo tanto, un primer paso crítico para comprender el papel biológico del
veneno y los posibles usos aplicados ( King 2011 ). El estudio de las toxinas del veneno también
ha demostrado ser valioso para generar información sobre cuestiones biológicas
fundamentales, como el papel de la duplicación de genes en la producción de novedades
evolutivas, los procesos involucrados en la generación de grandes familias multigénicas y las
bases moleculares de las adaptaciones ecológicas ( Casewell et al. 2011 ;Sunagar y col. 2012 ;
Brust y col. 2013 ). Sin embargo, las ideas generales solo son posibles en la medida en que
comprendamos los aspectos específicos de los taxones de la biología y evolución del veneno.
Por lo tanto, es importante ampliar nuestra comprensión de la diversidad de venenos más allá
de los taxones mejor estudiados (principalmente serpientes, arañas, escorpiones y caracoles
cónicos).

Artrópodos es un clado especialmente rico en especies venenosas. Tres de los cuatro grupos
principales (Chelicerata, Hexapoda y Myriapoda) juntos representan decenas de miles de
animales venenosos que habitan en una amplia gama de ecosistemas principalmente
terrestres. Sin embargo, a pesar de su incomparable diversidad de planes corporales ( Martin y
Davis 2001 ), no existe evidencia inequívoca de que ningún crustáceo sea venenoso.

Los remiendos se describieron en 1981 ( Yager 1981 ) y son crustáceos ciegos que habitan en
sistemas de cuevas submarinas anclas ( Koenemann et al. 2007 ; von Reumont y Burmester
2010 ). La perspectiva anterior de que los remiperos tienen uno de los planes corporales de
crustáceos más primitivos ( Schram y Hof 1998 ), con un tronco largo segmentado de forma
homónima con extremidades de natación birramas similares, ha sido cuestionada en estudios
recientes, que en cambio sugieren que los remides son crustáceos más derivados que están
estrechamente relacionados con los hexápodos ( Ertas et al. 2009 ) dentro de un clado
Pancrustacea (crustáceos + hexápodos) ( Fanenbruck et al. 2004 ; Ertas et al. 2009 ; Regier et
al. 2010; von Reumont y col. 2012 ). Curiosamente, el primer estudio filogenómico que incluyó
datos sobre los repelentes ( von Reumont et al. 2012 ), respalda firmemente la hipótesis de
que los repelentes son los parientes más cercanos a los crustáceos de los hexápodos. Se
sospecha, principalmente en base a la morfología, que los repelentes son venenosos ( van der
Ham y Felgenhauer 2007a , 2007b ), pero en ausencia de datos sobre la composición de su
supuesto veneno, su estado como organismos venenosos es tentativo.

Presentamos en este estudio la primera evidencia concluyente de que los remedos son de
hecho crustáceos venenosos. El perfil transcriptómico de la expresión del gen de la toxina
muestra que las glándulas venenosas del remipedo expresan una mezcla única de toxinas
venenosas conocidas. Complementamos estos datos con la reconstrucción 3D más detallada
de la morfología funcional del aparato de suministro de veneno remipedo producido hasta la
fecha para mostrar que los animales pueden inyectar veneno de manera controlada. Teniendo
en cuenta la información reciente ( Casewell et al. 2012 ) de que los estudios sobre la
evolución de la toxina del veneno pueden estar sesgados al restringir los análisis al tejido de la
glándula del veneno, utilizamos un transcriptoma animal completo para identificar los
registros de no toxinas, lo que nos permitió reconstruir el probable origen evolutivo de una
neurotoxina remipeda única.

Resultados y discusión

Los remiendos inyectan su veneno a través de un aparato de administración de veneno

altamente desarrollado

Los remiendos tienen un hábito superficialmente parecido a un ciempiés, con cuerpos largos y
segmentados homónimamente, con la mayoría de los segmentos equipados con patas de
natación birramas. La cabeza, o cefalón, en contraste, presenta un par de patas robustas
(maxilares) que en la mayoría de las especies terminan en una punta afilada.

Utilizamos la tomografía por microordenador por radiación sincrotrón (SR-µCT) para preparar
la primera reconstrucción tridimensional del aparato de administración de veneno del
Speleonectes tulumensis remipede . Nuestros resultados muestran un aparato de suministro
de veneno altamente adaptado. El tronco anterior de S. tulumensis contiene dos glándulas de
veneno de igual tamaño, que se conectan a través de conductos a depósitos ubicados en los
segmentos terminales de los maxilares ( fig. 1 ). Dos músculos grandes (am y vm en la figura 1 c
y d) se oponen estrechamente a los lados anterior y posterior del depósito. Se insertan solo en
la parte mediodistal del segmento subterminal del maxilar, lo que indica que no pueden
funcionar en el movimiento de las extremidades, pero que la contracción de estos músculos
expulsará el veneno del reservorio. El movimiento punzante del maxilar, que impide el empleo
en la presa ( Carpenter 1999 ), resulta de la contracción de cuatro músculos aductores
ubicados en el segmento subterminal, que al mismo tiempo evita pasivamente el flujo de
retorno del veneno al comprimir el conducto. Esta disposición muscular en S. tulumensis
representa claramente un sistema eficaz de administración de veneno. Estos hallazgos amplían
nuestro conocimiento de la morfología funcional de los maxilos remipedos ( van der Ham y
Felgenhauer 2007a) al mostrar que el movimiento de las extremidades y la inyección de
veneno se pueden separar funcionalmente.

Reconstrucciones tridimensionales de Speleonectes tulumensis (Crustacea: Remipedia) a partir

de datos de alta resolución SR-µCT. ( A ) Vista ventral y ( B ) lateral que muestra el curso del
sistema de administración de veneno (VDS), (púrpura) y su posición dentro del cuerpo. ( C )
Vista anterior y ( D ) posterior enfocada en el maxilar y el equipo muscular relacionado con el
VDS. 4 seg, 4to segmento; 5-7 seg, 5–7º segmento; ab, secuestradores; anuncio, aductores;
am, músculo apodemal anterior; br, cerebro; cep, cephalon; dc, ductus; gl, glándula; mxu,
maxilar; phx, faringe; rv, depósito; t, tentorio; vm, músculo ventral apodemal; vnc, cordón
nervioso ventral. Las imágenes no se escalan entre sí, las partes de la boca y otras estructuras
no se muestran.

Composición y evolución molecular del veneno Remipede

Nuestro análisis transcriptómico basado en secuenciación de próxima generación reveló que
1.052 contigs únicos se expresaron en las glándulas venenosas de S. tulumensis . De estos, 191
son proteínas secretoras y 108 pueden asignarse a clases conocidas de toxina del veneno (
figuras suplementarias. S1 , S2 a y S2 b , Material complementario en línea). Para todas las 191
proteínas, se encontraron resultados de InterProscan, excepto una (el isotig00521 de baja
expresión, ver tabla suplementaria S1 , Material complementarioen línea). Solo seis contigs no
recibieron Blast-hits en absoluto, aunque sí recibieron resultados de datos InterProscan.
Curiosamente, las secuencias de neurotoxinas del remipedo se encontraban entre ellas (ver
tabla complementaria S1 , Material complementario en línea). Este pequeño número de
transcripciones no identificables contrasta notablemente con lo que se encuentra en otros
artrópodos venenosos, como escorpiones, ciempiés y avispas parásitas. En estos taxones, más
de un tercio a más de la mitad de todas las transcripciones de glándulas venenosas son únicas
y no identificadas ( Vincent et al. 2010 ; Morgenstern et al. 2011 ; Liu et al. 2012 ).

Los tres tipos de toxinas más diversos y abundantes expresados por las glándulas venenosas
son las proteinasas, las quitinasas y una neurotoxina putativa, que juntas comprenden más del
90% de la diversidad de transcripción de toxinas y más del 95% de las lecturas de secuencias
de toxinas ( fig.2 ). Cabe señalar, por supuesto, que en ausencia de datos funcionales sobre
proteínas, nuestros resultados solo pueden designar secuencias como toxinas putativas. Esta
advertencia debe tenerse en cuenta al interpretar nuestros resultados. Dado que los remixidos
son muy difíciles de recolectar y ocurren en poblaciones pequeñas, será un desafío realizar el
trabajo proteómico necesario para confirmar la presencia y las actividades de las toxinas
putativas identificadas en el veneno secretado de repemipede.

Perfil transcriptómico de genes de toxinas expresados en las glándulas venenosas remipedas. (

A ) Distribución de la diversidad de contigs para cada tipo de toxina. ( B ) Distribución de la
abundancia de lecturas de secuencia por tipo de toxina. Los números totales se dan seguidos
de porcentajes que se muestran entre paréntesis. El código de color se da en la figura. Véanse
las figuras suplementarias S2 a y S2 b , Material complementario en línea, para conocer los
perfiles transcriptómicos de todas las proteínas secretadas expresadas tanto en la glándula del
veneno como en las bibliotecas completas de animales.

Peptidasa S1

La familia de serina proteasas de peptidasa S1 (PS1) es una gran familia de peptidasa, y sus
miembros tienen muchas funciones biológicas diferentes, que van desde la digestión hasta las
respuestas inmunes. Las proteínas de esta familia de genes se han reclutado de forma
independiente en los venenos de varios taxones, incluidos los cefalópodos, himenópteros,
reptiles y mamíferos ( Aminetzach et al. 2009 ; Fry et al. 2009 ; Whittington et al. 2010 ; Ruder
et al. 2013) En algunos de estos, los PS1 son diversos y abundantemente expresados, como en
las glándulas venenosas posteriores de varias especies de cefalópodos y las glándulas crurales
de los ornitorrincos masculinos. Dependiendo del tipo, las serina proteasas de veneno tienen
una variedad de actividades, como la prevención de la coagulación de la sangre y la causa de
vasodilatación, contracción del músculo liso, dolor e inflamación. Las PS1 representan el
componente dominante de las transcripciones de las glándulas venenosas de la remempeda en
términos de gran diversidad y cobertura ( fig. 2 ). Más del 66% de las transcripciones de toxina
de la glándula venenosa y más del 73% de las lecturas de toxina de la glándula venenosa (en 37
isogrupos) son PS1. Prácticamente todas las PS1 de la glándula del veneno contienen la tríada
catalítica de His-Asp-Ser que es característica de esta familia de peptidasas (posiciones 69, 160
y 458; verfig. suplementaria S3 a , material complementario en línea y datos de alineación), y
10 residuos de cisteína conservados. Toda la biblioteca de animales también muestra la
expresión de una gran diversidad de PS1. Sin embargo, la mayoría de las PS1 de la glándula del
veneno están restringidas a un solo clado de PS1 específicas de remipede ( figura
complementaria S3 b , Material complementarioen línea). Aunque los datos cuantitativos
comparables derivados de la secuencia transcriptomica profunda aún no están disponibles
para muchos taxones, la extraordinaria diversidad y nivel de expresión de PS1 que se
encuentra en las glándulas venenosas remipedas son, según nuestro conocimiento, únicos en
el reino animal. Los análisis transcriptómicos de las glándulas de veneno de escorpión, araña,
ciempiés e himenópteros muestran que las serina peptidasas en su conjunto representan solo
una pequeña proporción de las transcripciones de toxinas ( Vincent et al. 2010 ; Morgenstern
et al. 2011 ; Almeida et al. 2012 ; Liu et al. 2012 ).

Varias de las secuencias de PS1 remipedas contienen inserciones cortas dentro de la región
abarcada por la tríada catalítica. Curiosamente, las inserciones encontradas en esta región de
PS1 de tipo calicreína expresadas en las glándulas salivales de la musaraña Blarina brevicauda
han sido hipotetizadas para asociarse con una posible actividad enzimática ( Aminetzach et al.
2009 ). Sin embargo, una inserción similar informada a partir de una toxina de calicreína
expresada en las glándulas venenosas del monstruo de Gila ( Heloderma horridum ) fue
posteriormente un artefacto de secuenciación ( Fry et al. 2010) La alta expresión de los
diversos PS1 remipede sugiere que las actividades proteolíticas juegan un papel importante en
el envenenamiento remipede, posiblemente ayudando tanto a la inmovilización de presas
como a la digestión. El último papel parece particularmente relevante dado que en una de las
pocas observaciones de campo de la alimentación por repempedes se observó que ingieren el
tejido interno de un presa crustáceo, dejando atrás una cutícula ahuecada ( Schram y Lewis
1989 ).
Quitinasas

Las quitinasas son el segundo tipo de toxina más diverso y abundante expresado en las
glándulas venenosas de S. tulumensis , representando más del 16% de los contigs de toxina y
más del 22% de las lecturas de toxina. Las quitinasas son un grupo ampliamente distribuido de
enzimas hidrolíticas que catalizan la descomposición de la quitina, y hasta ahora se ha
encontrado que se expresan en las glándulas venenosas de los cefalópodos octopodiformes,
las arañas sicariidas y terafósidas, los himenópteros parasitoides, las secreciones de las
garrapatas suaves hematófagas y nematocistos de hidrozoos ( Chen et al. 2008 ; Fernandes-
Pedrosa et al. 2008 ; Fry et al. 2009 ; Vincent et al. 2010 ; Balasubramanian et al. 2012 ; Ruder
et al. 2013) pero nunca como un componente tan importante como el que se encuentra en el
remipede. A modo de comparación, aunque las quitinasas se clasifican entre las
"transcripciones de alta abundancia" en el veneno de la araña sicariida Loxosceles laeta (
Fernandes-Pedrosa et al. 2008 ), representan menos del 3% de las toxinas conocidas o posibles
encontradas en su veneno. . De manera similar, las quitinasas representan menos del 5% de las
etiquetas de secuencia expresadas en toxinas expresadas en la glándula venenosa de la avispa
parasitoide Chelonus inanitus ( Vincent et al. 2010 ). No se sabe que las quitinasas se expresen
en las glándulas venenosas de los ciempiés y los escorpiones.

Como se puede ver en la figura complementaria S2 b , Material complementario en línea, la

diversidad de las transcripciones de quitinasa representa una proporción sustancialmente
mayor de genes de toxinas secretadas y putativas en la biblioteca de glándulas de veneno que
en la biblioteca completa de animales. El análisis filogenético revela que las quitinasas
remipedas se distribuyen en tres clados supuestos. Las quitinasas expresadas en la biblioteca
de glándulas de veneno están restringidas a un clado específico de remipede (clado I en la
figura 3 ). Los otros dos clados solo contienen secuencias derivadas de toda la biblioteca
animal. La conservación de los nueve sitios activos (posiciones de alineación 133–141 en la
figura 4) en las glándulas quitinasas del veneno remipedo sugiere que el veneno remipede
tiene una actividad quitinasa sustancial. Especulamos que esto ayuda a repensar el
ablandamiento y la descomposición de los exoesqueletos quitinosos de las presas de los
crustáceos, especialmente los apodemas internos que proporcionan anclajes para sus tejidos
blandos. Esta hipótesis es coherente con las observaciones de campo disponibles, lo que
sugiere que los crustáceos son probablemente un componente importante de la dieta
remipede ( Carpenter 1999 ; Koenemann et al. 2007 ; van der Ham y Felgenhauer 2007b ).

Árbol filogenético de las secuencias de quitinasa. El árbol se reconstruye con RAxML (

Stamatakis y Alachiotis 2010 ), -fa, PROTGAMMAWAG, 10,000 bootstraps. Los nodos admitidos
por debajo del 10% de los valores de arranque están representados por líneas discontinuas.
Los Chelicerates son de color verde, ciempiés en marrón, insectos en azul y crustáceos en rojo.
Los taxones no venenosos y no hematófagos están indicados por asteriscos. Los números de
clado se dan en números romanos. Las transcripciones de las glándulas venenosas y las
transcripciones completas del tejido animal se indican mediante las abreviaturas VgT y BVgT
entre paréntesis después del nombre de la secuencia, respectivamente. Las secuencias de
remixes se ilustran con imágenes en miniatura de remipedos, y los pictogramas de las
glándulas venenosas resaltan las secuencias de las glándulas venenosas.

Fracción de la región del dominio alineado de las secuencias de quitinasa que presentan los
sitios activos. Las particiones excluidas de la alineación se indican entre paréntesis. La región
del dominio está sombreada en verde y los sitios activos en rojo. Para restante descripción y
código de color véase la figura 3 . Las transcripciones de las glándulas venenosas y las
transcripciones completas del tejido animal se indican mediante las abreviaturas VgT y BVgT
entre paréntesis después del nombre de la secuencia, respectivamente.

Remipede Veneno Neurotoxina

La actividad enzimática de las peptidasas y quitinasas probablemente juega un papel

importante en la licuefacción de las presas. Sin embargo, es poco probable que causen la
inmovilización rápida de la presa. Este papel importante podría ser cumplido por la quinta
toxina de la glándula venenosa remipeda más altamente expresada. Esta toxina está
representada por dos contigs distintos que tienen el patrón de cisteína conservado
característico de las agatoxinas ß / ∂ con un espaciado prácticamente idéntico [Cx (6) -Cx (6) -
CCx (4) -CxCx (6) -CxC] ( fig. 5 ) Las agatoxinas ß / ∂ son un tipo de neurotoxina de veneno de
araña recientemente descrito ( Billen et al. 2010), que hace que los canales de sodio
presinápticos dependientes de voltaje se abran en los potenciales de membrana en reposo de
los insectos. La liberación del neurotransmisor resultante genera una corriente de potenciales
de acción en las neuronas motoras, lo que resulta en una parálisis espástica irreversible de la
víctima. La predicción de la presencia de enlaces disulfuro sugiere que las dos secuencias de
neurotoxinas de la glándula venenosa remipeda pueden adoptar dos tipos diferentes de
plegamiento, uno con dos enlaces disulfuro y uno con cuatro como en las agatoxinas ß / ∂ de
araña ( figura 5 ).
Alineación de la neurotoxina remipeda. El código de color es idéntico al de la figura 3 . Los
péptidos de señal están sombreados en azul, los propéptidos en rojo y la región de dominio en
verde. Los enlaces disulfuro se representan con líneas negras y el esqueleto del residuo de
cisteína por cuadrados amarillos. Los círculos rojos representan secuencias de taxones no
venenosos que carecen de enlaces disulfuro como se predijo usando el servidor web DBCP ( Lin
y Tseng 2010 ). Los círculos amarillos muestran taxones no venenosos y secuencias de
repeticiones que se predice que tienen de uno a tres enlaces disulfuro menos probables (<65%
de probabilidad), y las líneas negras punteadas indican estos enlaces menos probables. Las
transcripciones de las glándulas venenosas y las transcripciones completas del tejido animal se
indican mediante las abreviaturas VgT y BVgT entre paréntesis después del nombre de la
secuencia, respectivamente.

La biblioteca de animales completa también expresa una secuencia de neurotoxinas putativa

que es prácticamente idéntica a una de las secuencias de glándulas de veneno. Sospechamos
que esta secuencia deriva del tejido de la glándula del veneno que era parte de los animales
completos a partir de los cuales se preparó esta biblioteca. Curiosamente, la biblioteca animal
completa también produjo dos secuencias diferentes con fuertes similitudes de secuencia con
las agatoxinas ß / ∂, conservando el mismo patrón y el espaciado de los residuos de cisteína, y
con la capacidad prevista para formar enlaces disulfuro. Estas secuencias, que probablemente
se expresan en el tejido de la glándula no venenosa que domina la biblioteca completa de
animales, difieren de las que se encuentran expresadas en las glándulas venenosas remipedas
al tener péptidos señal distintos y una región de péptido supuesta más grande.
Curiosamente,Daphnia ) secuencias con un patrón de cisteína idéntico y espaciamiento como
las secuencias de neurotoxinas repetitivas putativas. Estas secuencias son notablemente
similares a las secuencias remipedas obtenidas de la biblioteca animal completa, con fuertes
similitudes de secuencia en la cadena madura y con la mayoría de las cuales posee un
supuesto péptido supuestamente grande ( figura 5 ).

Los resultados de nuestro análisis filogenético ( fig. 6 y suplementaria fig. S4 , Material

complementarioen línea) muestran un patrón intrigante. Hasta donde sabemos, muestran por
primera vez que las agatoxinas araña pueden estar relacionadas con homólogos en personas
que no son arañas. El árbol de genes que incluye secuencias tanto de artrópodos venenosos
como no venenosos muestra que la neurotoxina supuesta de la glándula venenosa remipeda
está claramente separada en una rama larga de su paralogas de glándulas no venenosas, que
en cambio es parte de un grupo de ramas cortas que comprende secuencias derivadas de
glándulas no venenosas de otros crustáceos e insectos. Esta separación de la neurotoxina
supuesta de la glándula venenosa remipeda de las secuencias pancrustáceas restantes es
independiente de dos posibles posiciones de la raíz del árbol. Una posición de enraizamiento
es entre los pancrustaceos y el ciempiés más las arañas, lo que refleja la topología de consenso
de la filogenia de artrópodos de nivel superior (Giribet y Edgecombe 2012 ; von Reumont y col.
2012 ), mientras que la alternativa, que hemos elegido, es enraizar el árbol con una de las
secuencias pancrustáceas de las glándulas no venenosas, como la de Tribolium . En ambos
casos, nuestros resultados son consistentes con la hipótesis de que la neurotoxina de la
glándula venenosa remipeda representa un diálogo de lo expresado en el tejido de la glándula
no venenosa (véase también la figura complementaria S4 , Material complementarioen línea).
Esto sugiere que el origen de la neurotoxina de la glándula venenosa remipeda se asocia con
cambios sustanciales en todas las regiones de la secuencia primaria de la proteína, con
probables consecuencias para el nivel y la ubicación de la expresión génica, así como el
plegamiento y la bioactividad de la toxina madura.

Árbol filogenético de agatoxinas y la neurotoxina remipeda. El árbol de probabilidad RAxML de

la Agatoxina (RAxML-HPC PHTREADS-SSE3-7.2.6, 10,000 Bootstraps, -fa, PROTGAMMAIWAG,
ver Materiales y Métodos). Los taxones no venenosos y no hematófagos están indicados por
asteriscos. Para descripciones y código de color ver figuras anteriores. Las transcripciones de
las glándulas venenosas y las transcripciones completas del tejido animal se indican mediante
las abreviaturas VgT y BVgT entre paréntesis después del nombre de la secuencia,
respectivamente. Las secuencias de remixes se ilustran con imágenes en miniatura de
remipedos, y los pictogramas de las glándulas venenosas resaltan las secuencias de las
glándulas venenosas.

Estas ideas subrayan la importancia de comparar las transcripciones expresadas en las

glándulas venenosas de las especies con las expresadas en su tejido de glándulas no venenosas
( Casewell et al. 2012 ). Para ampliar y confirmar estas ideas en el trabajo futuro, será
necesario perfilar la expresión de homólogos de agatoxina en tejido de glándulas no venenosas
en arañas y ciempiés, así como la expresión de homólogos putativos en las glándulas de
veneno de los himenópteros venenosos incluidos en nuestro árbol.
Dado que las neurotoxinas expresadas en las glándulas del veneno de la araña y el ciempiés
funcionan como moduladores de los canales iónicos ( Billen et al. 2010 ; Liu et al. 2012 ),
especulamos que la neurotoxina de la glándula venenosa remipede tiene una actividad similar,
causando la inmovilización de la presa. El valor adaptativo de una neurotoxina paralizante en
el veneno de un depredador ciego que vive en cuevas submarinas pobres en nutrientes sería
significativo.

Toxinas de veneno restantes y modo de alimentación de Remipede

Las toxinas restantes expresadas en las glándulas venenosas remipedas ( fig. 2 ) incluyen
metaloproteasas, serina carboxipeptidasas de veneno, inhibidores de la serina proteasa
(serpina y kunitz) y proteínas secretoras ricas en cisteína relacionadas con el alérgeno 5 del
veneno (antígeno 5), un alergeno importante en veneno de himenópteros ( Moreau 2012 ).
Estas toxinas pueden aportar una mezcla de actividades que modulan la actividad del canal
iónico y el daño tisular al veneno remipedo. Para una discusión más detallada de estas toxinas,
remitimos al lector al material complementario , Material complementario en línea.

Un estudio de laboratorio sobre la alimentación por remipedos sugirió que pueden

alimentarse predominantemente con pequeñas partículas filtradas de la columna de agua (
Koenemann et al. 2007 ) y que los repelentes no son carnívoros obligatorios. No podemos
descartar que los restos silvestres se alimenten de pequeñas partículas suspendidas, pero la
sofisticada morfología funcional de su sistema de administración de veneno y la expresión de
una potente mezcla de enzimas que dañan los tejidos y neurotoxinas moduladoras de la
actividad del canal iónico son adaptaciones predatorias inconfundibles. Por otra parte, las
observaciones de laboratorio ( Koenemann et al., 2007 ) muestran que remipedios pueden
coger y domina varios tipos de presas de crustáceos. Esta combinación de rasgos junto con la
presencia de un esófago muy muscular ( Schram y Lewis 1989 ;Felgenhauer y col. 1992 )
respaldan la sugerencia, respaldada por una observación de campo ( Schram y Lewis 1989 ), de
que los remiperos pueden alimentarse de forma aracnoidea, succionando el tejido licuado de
la presa de su cutícula ( Schram y Lewis 1989 ). Los rememides se producen conjuntamente
con una diversidad de presas, principalmente crustáceos, presas, incluidos ostracodes,
decápodos, anfípodos, isópodos, mysids, termosbaenáceos y copépodos ( Neiber et al. 2011 ),
y se les ha observado portando ostracodes y consumiendo camarones carideos ( Schram y
Lewis 1989 ; Carpenter 1999 ; Koenemann et al.2007 ).

Las ideas anteriores sobre Remipede Venom son probablemente erróneas

Nuestros resultados sugieren que la única evidencia previamente reportada sobre el

maquillaje y los efectos del veneno remipede es probablemente errónea ( van der Ham y
Felgenhauer 2007a , 2007b) van der Ham y Felgenhauer propusieron que el veneno remipedo
tiene actividad fenoloxidasa. Ellos plantearon la hipótesis de que las glándulas venenosas
remipedas expresan una gran cantidad de hemocianina y un componente desconocido que
podría convertir la hemocianina en subunidades con actividad fenoloxidasa. No encontramos
evidencia de expresión de fenoloxidasa ni en la glándula del veneno ni en la biblioteca animal
completa, y aunque la glándula del veneno expresa una transcripción de hemocianina, se
expresa en un nivel extremadamente bajo (15 lecturas). En contraste, la biblioteca completa
de animales muestra una diversidad de transcripciones de hemocianina, lo que es consistente
con su papel como pigmento respiratorio en los remedos ( Ertas et al. 2009) Por lo tanto,
sugerimos que la actividad fenoloxidasa observada por van der Ham y Felgenhauer
probablemente representa la contaminación por hemolinfa de sus homogenados de glándulas
de veneno.

Ir:

Conclusiones

Nuestros resultados constituyen la primera evidencia concluyente de que los remedos son
crustáceos venenosos. La reconstrucción en 3D del aparato venenoso de S. tulumensis revela
un sistema eficaz de administración de veneno que es capaz de separar el movimiento de las
extremidades y la inyección de veneno por los maxilares. Nuestro estudio también muestra el
gran valor de los perfiles transcriptómicos para identificar organismos supuestamente
venenosos y generar datos sobre la composición del veneno. El perfil transcriptómico de las
glándulas venenosas de S. tulumensis muestra que el cóctel inyectado de toxinas está
dominado por enzimas y que incluye una probable neurotoxina paralítica.

Este estudio agrega un nuevo grupo de animales importantes a la lista de animales venenosos
conocidos y proporciona los primeros datos sobre la composición del veneno en un linaje de
artrópodos primitivamente acuáticos. Los resultados indican que el veneno remipedo es
notablemente diferente del de otros artrópodos artrópofagos como las arañas, los ciempiés y
los escorpiones. Los venenos de estos tres grupos son generalmente mucho más ricos en
péptidos neurotóxicos con masas mucho más pequeñas que las enzimas grandes que dominan
el veneno remipedo ( Liu et al. 2012 ; King y Hardy 2013 ). En términos del predominio de las
enzimas, especialmente las proteinasas, el veneno remipedo en realidad recuerda más al
veneno de las serpientes viperídicas (por ejemplo, Casewell et al. 2009 ; Rokyta et al. 2012 ).

Nuestros análisis filogenéticos subrayan la importancia de incluir secuencias derivadas de

glándulas no venenosas de taxones venenosos y secuencias de taxones no venenosos para
reconstruir los orígenes evolutivos y la dinámica de las toxinas venenosas ( Casewell et al. 2012
). Sin incluir datos derivados de una biblioteca transcriptómica completa de animales, hubiera
sido imposible inferir la diversidad y las relaciones completas de los parálogos no toxínicos
expresados en el tejido de las glándulas no venenosas, o inferir el probable origen evolutivo de
la neurotoxina expresada en las glándulas venenosas remipedas.

Esta contribución para aumentar nuestro conocimiento de la composición de toxinas de los

venenos evolucionados independientemente es crucial para lograr el objetivo final de los
venenos de desenredar los factores filogenéticos, ecológicos y de otro tipo que dan forma a la
biología y la evolución de los venenos de animales. Además, nuestros resultados son de
importancia general para futuros estudios sobre la evolución del veneno de artrópodos. Los
remixes son el linaje de ramificación más temprano de los pancrustáceos venenosos y, como el
posible grupo hermano de Hexapoda, representan el grupo externo venenoso más cercano a la
gran diversidad de insectos venenosos.

Ir:

Materiales y métodos

Colección y preservación de especies

Los especímenes de S . Se recolectaron tulumensis en varias expediciones de buceo en cuevas

a Yucatán, México. Las glándulas maxilares de 30 muestras se diseccionaron en condiciones
estériles en RNAlater (figuras suplementarias. S1 y S5 , material complementarioen línea) y se
utiliza para generar las transcripciones específicas del tejido de la glándula del veneno (VgT) en
una plataforma 454 Titanium (Roche). Se incluyeron muestras de diferentes tamaños en la
biblioteca de transcriptomas VgT, que por lo tanto representa diferentes etapas y condiciones
de las glándulas venenosas. Para recuperar posibles secuencias de paralogas no toxínicas en
tejido de glándula no venenosa, analizamos un transcriptoma secuenciado previamente de
muestras que comprenden principalmente tejido corporal de glándula no venenosa (BVgT). Se
generó BVgT secuenciando una biblioteca de ADNc normalizada en la plataforma 454 Titanium
(Roche), generada a partir de 10 muestras completas que se molieron en RNAlater.

Reconstrucción de biblioteca

El ARN total del tejido de la glándula venenosa disecada solamente (VgT) se extrajo con el
método Trizol-GTI-LiCl y la síntesis de ADNc, y la amplificación se realizó con el kit Mint
(Evrogen) en LGC Genomics, Berlín, Alemania. Después de la digestión con ADNc, los
fragmentos se seleccionaron por tamaño en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (LMP).
Para evitar la exclusión de secuencias de toxinas más cortas, el tamaño de los fragmentos
seleccionados se redujo a 200 pb. Los fragmentos purificados (kit de extracción MinElute Gel,
Qiagen) se ligaron a un vector pDNR-lib (Clontech) usando el kit de ligadura rápida (NEB). La
mitad de aproximadamente 2 millones de clones en placa se usaron para la preparación de
ADN plasmídico siguiendo métodos estándar (Qiagen). Los insertos de ADNc se purificaron con
gel de agarosa LMP (kit de extracción de gel MinElute) y se ligaron a ADN de alto peso
molecular usando un enlazador Sfi patentado. La generación de la biblioteca se realizó de
acuerdo con los protocolos estándar del fabricante (Roche 454 Life Sciences, Branford, CT),
cortando insertos concatenados al azar por nebulización. Los fragmentos cortados finalmente
se agregaron a los extremos del fragmento mediante ligadura. La biblioteca de fragmentos
resultante se secuenció en 1/4 placa de picotiter en el GS FLX usando la química de titanio
Roche 454 obteniendo un total de 260,172 lecturas de secuencia.

Para toda la biblioteca animal, se extrajo el ARN total de 10 muestras completas, incluidas las
glándulas de veneno (BVgT), con el kit absolutamente ARN (Stratagene) y su ADNc
correspondiente sintetizado con el kit Mint (Evrogen) en el Instituto Max Planck de Genética
Molecular (MPIMG), Berlín, Alemania. Se realizó una ejecución completa de 454 FLX Titanium
(Roche) produciendo 1,000,000 de lecturas. Para más detalles sobre el procesamiento de
secuencias, ver von Reumont et al. (2012) .
Asamblea de secuencia

Antes del ensamblaje, las lecturas de la secuencia VgT se seleccionaron para el enlazador Sfi
que se usó para la concatenación, las secuencias del enlazador se recortaron de las lecturas y
las lecturas recortadas se ensamblaron en transcripciones individuales usando el software
Roche 454 Newbler en la configuración predeterminada (454 Life Sciences Corporation,
versión de software: 2.3), las secuencias vectoriales se identificaron y eliminaron usando
VecScreen. El BVGT dice estaban reunidos como se describe en von Reumont et al. (2012) .

Anotación e identificación de secuencias de proteínas de veneno

Para identificar las proteínas candidatas al veneno, desarrollamos una tubería bioinformática
personalizada (ver la figura complementaria S1 , Material complementarioen línea). Primero,
las secuencias del transcriptoma se tradujeron en aminoácidos para los seis marcos de lectura.
Esto es necesario para cubrir posibles variantes de proteínas en diferentes cadenas o en
diferentes marcos de lectura. Las secuencias de proteínas traducidas de seis cuadros se
formatearon en una base de datos Blast local para buscar diferentes proteínas conocidas. Se
sabe que las proteínas de veneno generalmente están representadas por proteínas secretadas,
por lo que eliminamos todas las proteínas secretadas de UniProt (location_sl_0243) contra
nuestras bases de datos de ADNc traducidas. Los resultados de la búsqueda de Blast se
analizaron en un archivo de secuencia de aciertos, incluidas todas las secuencias con aciertos
de Blast para proteínas secretoras, que se utilizaron en todos los análisis adicionales para
identificar proteínas de veneno putativas.Conesa y Götz 2008 ). Este software permitió un
InterProscan final automatizado para sitios y motivos activos ( Hunter et al. 2012 ), que
utilizamos además de los procedimientos estándar de Blast para predecir las proteínas de
veneno putativas. La anotación de secuencia general se realizó con Blasthits (nr), anotación de
término InterProscan y Gene Ontology de Blast2GO (ver tablas suplementarias S1 y S2 ,
Material suplementario en línea).

Reconstrucción filogenética de árboles de proteínas de veneno

Las secuencias se alinearon utilizando Mafft E-INS-I27 confiando, donde esté disponible, en
restricciones de estructura de proteínas de veneno curadas manualmente revisadas por
Uniprot ( Jungo et al. 2012 ). En general, las secuencias en las que los codones de parada
interrumpieron los marcos de lectura abiertos (que potencialmente representan artefactos de
secuenciación o pseudogenes) se eliminaron de las alineaciones finales. A menos que se
indique lo contrario, la mayoría de estas alineaciones excluyeron las regiones prepro que
codifican el péptido señal y los propéptidos que se eliminan postraduccionalmente de la
proteína madura (región de dominio). Las regiones prepro en su mayoría eran demasiado
diversas para una alineación inequívoca. Después de elegir el modelo de mejor ajuste con
ProtTest 328, se realizó un análisis de máxima verosimilitud con RAxML-HPC PTHREADS-SSE3-
7.2.6 ( Stamatakis y Alachiotis 2010) para cada una de las alineaciones de proteínas utilizando
el modelo de proteína de mejor ajuste para reconstruir árboles filogenéticos (ver figura
leyendas de árboles reconstruidos para el modelo elegido para cada proteína). El soporte de
Bootstrap se estimó a partir de 10,000 pseudoreplicates. A menos que se mencione lo
contrario en las leyendas de las figuras, todos los árboles se enraizaron con una variante de
transcripción no venenosa de un vertebrado no venenoso.

Secuencias adicionales de taxones venenosos y no venenosos se obtuvieron

predominantemente de UniProt para maximizar el número de secuencias anotadas en
nuestros análisis. Cuando fue posible, se incluyeron especies de artrópodos no venenosos de
los cuatro grupos principales.

Reconstrucción tridimensional de datos SR-µCT

Dos muestras conservadas en Bouin se transfirieron a etanol al 70% y posteriormente se

secaron en un punto crítico (Modelo E4850, BioRad, Hercules, CA) para reducir los artefactos
inducidos por fluidos durante el proceso de escaneo. Posteriormente, las muestras se pegaron
en soportes de muestras para SR-µCT ( Betz et al. 2007 ). SRµ-CT tiene un alto poder de
penetración y permite visualizar muestras grandes sin necesidad de seccionar. El escaneo se
realizó en el acelerador alemán de sincrotrón electrónico (DESY, Hamburgo, Alemania; la
estación de tomografía BW2 / DORIS III operada por Helmholtz-Zentrum Geesthacht HZG,
Geesthacht, Alemania), que está optimizada para realizar una microtomografía de resolución
de alta densidad ( Beckmann et al. 2008) La instalación proporciona datos de coma flotante,
así como archivos de imagen TIFF de 16 bits y archivos de datos de volumen (formato .vgi)
listos para su análisis. Los datos de volumen proporcionados (archivos .vgi) se analizaron con el
visor gratuito myVGL 2.0 de 64 bits (Volume Graphics, Heidelberg, Alemania). La segmentación
y la representación de estructuras individuales se logró con Reconstruct ( Fiala 2005 ) y Blender
( http://www.blender.org , último acceso el 4 de noviembre de 2013). Las figuras finales
fueron editadas con GIMP, Inkscape y Scribus (todas GPL).