De la Torre, A. Universidad Autónoma de Aguascalientes.

Licenciatura en
biotecnología. 7° semestre. Genómica y bioinformática. 30/11/2016.

Estudio bioinformática de un gen sintético anti

fúngico/antiviral como mecanismo de defensa de plantas.
De la Torre Rodríguez Alejandra. Profesor a cargo de la materia, Dr. José francisco morales
Domínguez, laboratorio de tecnología de plantas. UAA (Universidad Autónoma de
Aguascalientes).
RESUMEN
Mediante un estudio bioinformática se caracterizó la proteína putativa del gen
sintetico -- realizando un análisis con la información encontrada en el artículo ---
obteniendo un porcentaje de identidad del 95.58% y los dominios conservados a
través de un alineamiento múltiple con 10 secuencias homologas. Se encontró que
en ambas proteínas se encontraban un dominio inhibidor de xilanasa (TAXI-I) y un
inhibidor de Xilanasa C-terminal.
INTRODUCCIÓN
El constante ataque de patógenos sobre las plantas produce pérdidas muy elevadas para
los agricultores, quienes han tenido que recurrir tradicionalmente al uso intensivo de
pesticidas. Sin embargo, su utilización presenta grandes problemas, ya que al no ser
específicos contra una clase particular de organismos, y dado que su toxicidad abarca una
amplia variedad de organismos, han generado daños considerables tanto a la ecología,
como a los organismos superiores, debido a que éstos también son blanco de su toxicidad
Blanco, A., & Mancilla, C. A. (2000).
Muchas proteínas presentes en plantas son capaces de unirse a quitina, un polímero de
enlaces β-1,4 de N-acetilglucosamina presente en exoesqueletos de insectos y nemátodos
así como en pared celular de hongos, excluyendo Oomycetes. Esta unión resulta de la
secuencia conservada de 30-43 aminoácidos, llamado dominio de “Unión a Quitina”
(Raikhel et al; 1993). Tal dominio está presente en quitinasas clase I de Amaranthus
caudatus (Ac-AMP1 y Ac-AMP2). También está presente en lectinas y una clase de
proteínas tipificadas como heveína. Las lectinas se unen a quitina y otros glicoconjugados
conteniendo N-acetilglicosamina o ácido N-acetilneuráminico y también causan la
aglutinación de los glóbulos rojos de mamíferos. Un gran número de lectinas han sido
caracterizadas de especies de cereales, leguminosas y solanáceas. Éstas, varían
ampliamente en estructura y secuencia, pero todas contienen el dominio de unión a quitina.
Algunas de ellas han mostrado tener propiedades antimicrobianas (Raikhel et al; 1993).
Un péptido antifúngico (lectina), con una masa molecular de 11 kDa, a partir de semillas
secas de lenteja roja (Lens culinaris) fue aislado por Wang, H. X., & Ng, T. B. (2007) usando
un procedimiento que implicaba cuatro etapas cromatográficas. El péptido antifúngico
inhibió el crecimiento micelial en Mycosphaerella arachidicola y también exhibió actividad
antifúngica contra Fusarium oxisporum (causante de la enfermedad de Panamá en los
bananeros y de más de un centenar de enfermedades en otras tantas especies vegetales).

La infección sistémica de la planta huésped por virus, requiere del movimiento de grandes
distancias del virus a través de tejidos del floema (Hull, R. 1989).
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Balasaraswathi, R; et al (1998) identificó una proteína antiviral activa contra la transmisión
mecánica del virus de la marchitez de tomate en los tejidos radiculares de Bougainvillea
spectabilis Willd. La proteína antiviral Bougainvillea I (BAP I) se purificó hasta
homogeneidad aparente a partir de las raíces de Bougainvillea mediante precipitación con
sulfato de amonio, cromatografía CM- y DEAE-Sepharose y HPLC de fase inversa. BAP I
es una proteína altamente básica (pI valor> 8.6) con un Mr de 28.000. La secuencia N-
terminal de BAP I tiene homología con otras proteínas antivirales de plantas.
OBJETIVOS
Realizar el análisis bioinformático de un gen sintetico anti fúngico/antiviral obtenido de Lens
culinaris [GenBank: CAC42124.2] y Bougainvillea spectabilis [GenBank: AAR97371.1].
Para obtener sus características teóricas a través de programas bioinformáticas desde
predecir su estructura terciaria hasta sus parámetros, para su posterior comparación con la
proteínas originales de los artículos Wang, H. X., & Ng, T. B. (2007) y Balasaraswathi, R; et
al (1998).
METODOLOGÍA
Se obtuvo la secuencia de la proteína mencionada en Wang, H. X., & Ng, T. B. (2007) y
Balasaraswathi, R; et al (1998) en la página de NCBI con el número de acceso en GenBank
CAC42124.2 (antifungico) y AAR97371.1 (antiviral). En esta misma página se realizó un
BLAST para localizar los dominios presentes en la proteína.
Introduciendo primeramente la secuencia BAB89707.1 en el programa editseq, se
elaboró un PCR virtual en el programa primerselect, seleccionando los oligos que
permitieran obtener un producto de PCR con los dominios de la proteína obtenida en
Wu, J; et al. (2013), con un porcentaje de guaninas y citosinas mayor al 50%; y un
dTM menor a 4. El producto de PCR obtenido se tradujo con ayuda de la página de
Expasy
(http://web.expasy.org/translate/) para ubicar el marco de lectura abierta.
En la página protparam, se obtuvieron los parámetros de la proteína putativa
(producto de la PCR que se elaboró), se realizó un BLAST en la página de NCBI para
confirmar la presencia de los dominios de la proteína original y un BLAST en uniprot
para copiar los primeros 10 homologos en formato FASTA.
Se elaboró un alineamiento múltiple con la pagina MUSCLE que permitió la
comparación entre los 10 homologos encontrados en uniprot, junto con una
secuencia ancla (collagen [Oryctes borbonicus]) y el producto de PCR en formato
FASTA. Realizando igualmente en MUSCLE con el programa java el árbol
filogenético.
En la página de web logo se realizó el web logo de las secuencias homologas, que
nos permite las regiones conservadas, la secuencia ancla (collagen [Oryctes
borbonicus]) y el producto de PCR de una manera gráfica.
Para ver el modelado de la proteína original OsCLP y el producto de PCR diseñado
en este artículo. Comparándolas en el programa UCSF Chimera, en donde se observa
gráficamente la estructura terciaria de ambas, sus dominios y un empalme. Además
se realizó un alineamiento múltiple entre las dos secuencias y el porcentaje de
identidad entre ambas.
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Se realizó otro modelado de la proteína putativa en swissmodels, en donde se
visualizó su estructura terciaria.
RESULTADOS
Secuencia obtenida de NCBI lectina [Lens culinaris] con número de acceso CAC42124.2
maslqtqmis fyliflsill ttifffkvns tettsfsitk fspdqknlif qgdgyttkgk
ltltkavkst vgralystpi hiwdrdtgnv anfvtsftfv idapssynva dgftffiapv
dtkpqtgggy lgvfnskeyd ktsqtvavef dtfynaawdp snkerhigid vnsiksvntk
swnlqngera nvviafnaat nvltvtltyp nsleeenvts ytlnevvplk dvvpewvrig
fsattgaefa ahevhswsfh selggtsssk qaada

Figura 1. Resultado del BLAST realizado arroja la presencia de la familia de las lectinas de
tipo L (leguminosas) y un sitio especifico de lectinas de leguminosas, quinasas receptoras
de tipo lectina, arcelina, concanavalina A y inhibidor de alfa-amilasa.
El producto de PCR elaborado en el
programa primer select contenia 363
pares de bases con primer Upper:
CCTTCTACCTGATCTTCCTGTCCA y
lower: GCCCGCTCGCCATTCTG cuya
traducción con 120 aminoácidos se
encontraba en el marco de lectura 3.
Figura 1 (Izquierda). Caracteristicas de
los primers para el PCR virtual de lectina
[Lens culinaris], con un dTM de 1.9 menor
a 4, señalado con un recuadro rojo y un
porcentaje de guaninas y citosinas mayor
al 50%.

Parámetros
obtenidos del
programa de proparam este programa nos permitió el cálculo de
parámetros fisicoquímicos de secuencias de proteínas tales
como composición de aminoácidos, pI, coeficiente de
extinción, composición atómica, vida media estimada

Figura 2. Parámetros obtenidos en protparam de lectina [Lens

culinaris] se observa que la proteína tiene 120 aminoácidos, un peso
molecular de 13278.10 y un punto isoeléctrico de 8.94. También se
especifica debajo de los parámetros antes mencionados, la
composición en porcentaje de los aminoácidos que contiene.
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Total number of negatively charged Ext. coefficient 12950
residues (Asp + Glu): 8 Abs 0.1% (=1 g/l) 0.975
Total number of positively charged Estimated half-life:
residues (Arg + Lys): 10
The N-terminal of the sequence
Atomic composition: considered is F (Phe).

Carbon C 621 The estimated half-life is: 1.1 hours

Hydrogen H 933 (mammalian reticulocytes, in vitro).
Nitrogen N 145 3 min (yeast, in vivo).
Oxygen O 178 2 min (Escherichia coli, in vivo).
Sulfur S 0 Instability index:

Formula: C621H933N145O178 The instability index (II) is computed to be

Total number of atoms: 1877 20.35
This classifies the protein as stable.
Extinction coefficients:
Aliphatic index: 79.58
Extinction coefficients are in units of M-1
cm-1, at 280 nm measured in water. Grand average of hydropathicity
(GRAVY): 0.129

Figura 4. Secuencia homologas del PCR virtual obtenidas de un BLAST de lectina [Lens
culinaris] en uniprot.

Figura 5. Alineamiento múltiple del producto de PCR junto con un ancla (collagen [Oryctes
borbonicus]) y 10 homologos encontrados con un BLAST de la figura 4. En donde se
observa en color azul las zonas donde hay mayor porcentaje de identidad.
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Figura 6. Árbol filogenético de las secuencias mostradas en la figura 5, se muestra las

relaciones evolutivas entre varias secuencias homologas de la figura 4 y el producto de
PCR que tienen ascendencia común, mientras la secuencia de (collagen [Oryctes
borbonicus]) como se esperaba no tiene relación con las demás.

Figura 7. Web logo de las secuencias homologas encontradas, la secuencia ancla (collagen
[Oryctes borbonicus]) y el producto de PCR. Visualizamos así las regiones conservadas
más conservadas y el aminoácido que predomina en estas.

A b c d e)

Figura 8. De izquierda a derecha se ve en color rojo a) la proteína OsCLP (N° acceso

BAB89707), b) el producto de PCR virtual de OsCLP (en color azul) en esta figura se ve en
color gris c) el dominio TAXI-I inhibits degradation of xylan in the cell wall; Xylanase
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inhibitorI, d) el empalme de ambas en rojo y azul respectivamente, e) Xylanase inhibitor C-
terminal; The N- and C-terminal y e) modelado de la proteína putativa en swissmodels, en
donde se visualizó su estructura terciaria

Figura 9. Alineamiento múltiple realizado en el programa chimera de la secuencia OsCLP

(N° acceso BAB89707), el producto de PCR virtual de OsCLP, en donde se observa de
color crema las zonas donde hay mayor porcentaje de identidad.

Figura 9. Porcentaje de identidad entre la secuencia OsCLP (N° acceso BAB89707) y el

producto de PCR virtual de OsCLP.
CONCLUSIÓN
La proteína OsCLP obtenida del artulo Wu, J; et al. (2013), mostro mediante un estudio
bioinformática una identidad del 95.58% con el producto de PCR diseñado en este trabajo
de la antes secuencia mencionada. Además se mostró en ambas la presencia de los
dominios inhibidor de xilanasa (TAXI-I) y un inhibidor de Xilanasa C-terminal.
BIBLIOGRAFIA
Balasaraswathi, R; Sadasivam, S; Ward, M; & Walker, J. M. (1998). An antiviral protein from
Bougainvillea spectabilis roots; purification and characterisation. Phytochemistry, 47(8),
1561-1565.

Blanco, A., & Mancilla, C. A. (2000). Proteínas involucradas en los mecanismos de defensa
de plantas. Red Acta Universitaria.

Hull, R. (1989). The movement of viruses in plants. Annual Review of Phytophatology 27,
213-240.

Raikhel N. V; Lee H. I; Broekaert W. F. (1993). Structure and function of chitin-binding

proteins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44, 591-615.
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Wang, H. X., & Ng, T. B. (2007). An antifungal peptide from red lentil seeds. Peptides, 28(3),
547-552.