GENÓMICA II

Genómica
SISTEMAS DE ADN RECOMBINANTE

Conjunto de técnicas que Replicación

de virus y
plásmidos
permiten aislar un gen de un
organismo, para su posterior Replicación y
reparación de
ADN
manipulación e inserción en
otro diferente. EC
restricción

Síntesis
química
 ADN RECOMBINANTE
Unión artificial de dos fragmentos de ADN

Vectores
1. Plásmidos.
2. Virus Producción de proteínas,
3. Transformaciones químicas enzimas

CAMINOS DE
INVESTIGACIÓN Se realiza por Inserción por métodos
transferencia del gen de físico químicos
interés
Producido por bacterias 4) la síntesis
para degradar ADN 3) la replicación de
extraño Mecanismos para química de
corregir errores
virus y plásmidos
1) Enzimas de secuencias de
durante la
restricción, replicación del ADN nucleótidos.

2) la replicación y
reparación de ADN,
 Mutaciones
Es un cambio en la secuencia del ADN

Genómica
Génicas o moleculares Cromosómicas
los cambios que alteran la Son alteraciones en el numero de genes o en
secuencia el orden de los cromosomas
de nucleótidos del ADN.
Sustitución de bases
1. Inserción de bases
Cambio de posición de bases Aneuploidial, 5. Poliploidal
2. Inversión
cuando un par de bases es
sustituido por su alternativa del 3. Deleccion o duplicación
Se producen al cambiar en mismo tipo.
una posición de un par de
4. Translocaciones
bases por otro
Transición

Trasnversion
 VECTORES
1. Plásmidos: Son elementos genéticos que se
replican independientemente del cromosoma
hospedador.
• No generan daño celular, diferente de los virus
• Pueden presentarse varios en un mismo
individuo y expresarse frente a la necesidad.
• Replicación extra cromosómica
Elemento Descripción
Procariota Eucariota

Plásmidos Corto, normalmente circular, DNA Corto, lineal o circular DNA

bicatenario bicatenario
2. VIRUS.
 MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN
DE ADN RECOMBIANTE
Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes:
• Transformación: es un tratamiento fisico-químico para bacterias. Se produce una variación de
la permeabilidad de la membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya
que pueden penetrar los ADN recombinantes en el interior celular. Las células se hacen
competentes cuando en un cultivo celular a 0ºC, con presencia de Ca++, se produce un brusco
cambio de temperatura, llegando a 37º-43ºC.
• Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el
interior celular con una micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de
asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, sólo es
utilizado sobre ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector e introducir
directamente el ADN seleccionado.
• Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas
fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su
interior se introduce en la célula.
• Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante
es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la
membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.
• Transfección: método físico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus
introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de infección viral.
• Microproyección o biobalística: método físico activo en el que se utiliza una micropistola que
dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. Se utiliza sobre suspensiones
celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre órganos como piel, hojas, etc.
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
• Las enzimas implicadas son las endonucleasas, las
cuales destruyen ADN extraño, para no ser destruidas
el ADN bacteriano se metila.
• Ellas pueden identificar secuencias para hacer los
puntos de corte, los cortes no están sujetos a
correcciones.
• Se presentan mecanismo de acción donde se tiene:
restricción (proteger el DNA bacteriano de otros
individuos) y modificación (se metilan ciertas beses).
• Las enzimas funcionan siendo especifica en un punto
de corte que son las tipo II y la I la cual no especifica,
requiere energía y los cortes son asimétricos
 Modelo de enzimas de restricción
• Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de
restricción:
• Modelo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades)
tiene actividad de restricción (corta) y
modificación (metila). Al reconocer la secuencia
específica de DNA corta al azar en sitios distintos
al sitio de reconocimiento, ya sea río arriba o río
abajo. El corte deja extremos cohesivos.
Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde
el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte
(unas 1000 pares de bases aproximadamente),
además de SAM (S-adenosil-metionina) y
Mg++ como cofactor
 Modelo de enzimas de restricción

• Modelo 2: Solo tienen actividad de restricción.

Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El
corte es efectuado en el sitio de
reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que
el corte es resistente y predecible. Por esta
característica es que son muy utilizadas para
clonación de genes, ya que al cortar en sitios
específicos se pueden recuperar secuencias
conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor,
no necesitan de ATP.
 Modelo de enzimas de restricción
• Modelo 3: Se utiliza una enzima oligomérica
que realiza todas las actividades enzimáticas.
Tienen función de restricción y modificación.
Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio
de reconocimiento, dejando extremos
cohesivos. Requieren dos secuencias de
reconocimiento en orientación opuesta en la
misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y
SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.
 Nomenclatura
• 1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del
microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus
influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del
nombre se escriben en cursiva.
• 2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la
cepa "RY13" de E. coli )
• 3º. En números romanos, un número para distinguir si hay
más de una endonucleasa aislada de esa misma especie.
No confundir con el tipo de enzima de restricción.
• 4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un
M de metilasa según la función de la enzima, pero
generalmente se omite.
Eco RI à E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
 Replicación y reparación de ADN
La ADN polimerasa (intervienen en el proceso de
replicación del ADN) comprueba el
emparejamiento de bases.
Transición: Las dos bases púricas son adenina Transversion: la sustitución del par AT
(A) y guanina (G), y las dos pirimídicas son por TA o por CG.
citosina (C) y timina (T).
La sustitución de un par AT, por ejemplo, por
un par GC
 Mutaciones
1. Molecular (génicas o puntuales): Son mutaciones a nivel
molecular y afectan la constitución química de los genes, es
decir a la bases o “letras” del DNA.
2. Cromosómico: El cambio afecta a un segmento de
cromosoma (de mayor tamaño que un gen), por tanto a su
estructura. Estas mutaciones pueden ocurrir porque grandes
fragmentos se pierden (deleción), se duplican, cambian de
lugar dentro del cromosoma.
3. Genómico: Afecta al conjunto del genoma, aumentando el
número de juegos cromosómicos (poliploidía) o reduciéndolo
a una sola serie (haploidía o monoploidía) o bien afecta al
número de cromosomas individualmente (por defecto o por
exceso), como la trisomía 21 o Síndrome de Down.
 Revisión.
La mayoría de las ADN
polimerasas pueden "revisar
su trabajo" con cada base
que añaden.
Si la polimerasa detecta que
ha agregado un nucleótido
equivocado (apareado
incorrectamente), lo quita y
reemplaza enseguida, antes
de continuar con la síntesis
de ADN
 Reparación de mal apareamiento

La reparación de mal
apareamiento también
puede detectar y
corregir pequeñas
inserciones y
deleciones que
suceden cuando las
polimerasas "se
resbalan" y pierden su
lugar sobre el molde
 Reparación por escisión de base

• Es un mecanismo que se
usa para detectar y
eliminar ciertos tipos de
bases dañadas. Un grupo
de enzimas llamadas
glicosilasas tiene un papel
clave en la reparación por
escisión de bases. Cada
glicosilasa detecta y
elimina un tipo específico
de base dañada.
 Reversión del daño químico

En algunos casos, una célula puede reparar daños en el ADN

al simplemente revertir la reacción química que los causó.
Para entender esto, necesitamos darnos cuenta que el "daño
al ADN" suele implicar solo un grupo extra de átomos que se
unen al ADN mediante una reacción química.

Si no se corrige, la guanina que contiene metilo

formará pareja con timina (T) en lugar de citosina (C)
durante la replicación del ADN.
Reparación por escisión de nucleótidos
La reparación por escisión de
nucleótidos es otra vía que se
usa para eliminar y reemplazar
bases dañadas. La reparación
por escisión de nucleótidos
detecta y corrige tipos de daño
que distorsionan la doble hélice
del ADN.

Por ejemplo, esta vía detecta

bases que han sido modificadas
con grupos químicos
voluminosos, como los que se
unen a tu ADN cuando se
expone a las sustancias
químicas del humo de
cigarrillos, o daño que causa la
radiación UV, como cuando te
quemas con el sol.
Reparación de rotura de la doble cadena
En la recombinación homóloga,
se utiliza la información del
cromosoma homólogo que
coincide con la del dañado (o de
una cromátida hermana si el ADN
se ha copiado) para reparar la
fragmentación. En este proceso
se acercan los dos cromosomas
homólogos y se utiliza la región
sin daños del homólogo o la
cromátida como molde para
sustituir la región dañada del
cromosoma roto.

La recombinación homóloga es
"más limpia" que la unión de
extremos no homólogos y no
suele causar mutaciones
En la unión de extremos no
homólogos, los dos extremos
rotos de un cromosoma
simplemente se vuelven a
pegar. Este mecanismo de
reparación es "desordenado" y
por lo general resulta en la
pérdida, o a veces adición, de
unos cuantos nucleótidos en el
sitio de corte. Por lo tanto, la
unión de extremos no
homólogos tiende a producir
una mutación, pero eso es
mejor que la alternativa (la
pérdida de un brazo entero del
cromosoma