CÓDIGO FO-DOC-81

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

VERSIÓN 02
FECHA 20/10/2019
PLAN DE LABORATORIO
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CURSO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA Y CIENCIAS AGRICOLAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES
LABORATORIO Nº 3.

Tema: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIÓN DE PROTEASAS

Objetivo general.

Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus thuringiensis

Objetivos específicos

 Establecer el grado de relación entre la producción metabólica secundaria y las diferentes

fases de una curva de crecimiento microbiano.

Palabras claves.

 Crecimiento: incremento en el número de células.

 Crecimiento Exponencial: crecimiento de un microorganismo cuyo número de
células se duplica en un período constante de tiempo.
 Cultivo Tipo Batch o Monofásico: cultivo microbiano que funciona como un
sistema cerrado de volumen constante.
 Fase Estacionaria: período que sigue al crecimiento exponencial cuando la
velocidad de crecimiento de la población es cero.
 Fase Lag. Período anterior a la fase de crecimiento exponencial cuando las células
pueden tener un metabolismo activo, pero aún no crecen.
 Proteasas: enzimas que degradan proteínas por hidrólisis.

Marco contextual.

El incremento poblacional que resulta de la multiplicación celular, es un componente

esencial de la función microbiana, y con él se asocian, tanto el crecimiento, como la
generación metabólica; de hecho, las bacterias son máquinas de duplicación constante en
las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formación de las macromoléculas
necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de sus descendientes.
Como en la mayoría de los procariotes, el desarrollo de una célula individual es continuo
hasta la división en dos células nuevas (fisión binaria), el conocimiento de las
características de crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se
pueden reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los
procesos generadores de metabolitos.
En cultivos de producción por lotes (sistema batch), el aumento en la masa celular como
consecuencia del cambio en el número de células o absorbancia (Abs) por unidad de tiempo
(Velocidad de crecimiento), permite establecer una curva típica de crecimiento (Figura 1)
en la que se pueden observar las diferentes fases de la misma: latencia (a), exponencial
(b), estacionaria (c) y muerte celular (d), y el grado de asociación de estas con la generación
de metabolitos primarios y secundarios, pues los primeros son aquellos que se forman
durante el crecimiento exponencial, mientras que los segundos, como las proteasas objeto
de la práctica, se producen casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son
compuestos que no hacen parte del metabolismo energético de la célula.
El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en donde la
Velocidad de crecimiento, es el cambio en el número de células o absorbancia (Abs),
experimentado en unidad de tiempo.
Durante el crecimiento de los microorganismos, se generan una serie de productos,
llamados metabolitos, que pueden clasificarse como primarios y secundarios. Los primarios
son aquellos que se forman durante la fase de crecimiento exponencial y además se forman
como parte del metabolismo energético de las células, mientras que los metabolitos
secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos
que no hacen parte del metabolismo energético de la célula. Como ejemplos de metabolitos
se encuentran etanol, proteasas, entre otras.

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva, con flagelos periticos, forma
esporas, productoras de cristales proteicos con acción insecticida, productora de proteasas
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que habita en el suelo, y que se utiliza comúnmente como una alternativa biológica al
plaguicida.

REACTIVOS Y EQUIPOS

 Microorganismo Bacillus thuringiesis

 caldo nutritivo,
 solución de ácido tricloroacético,
 caseína (leche),
 espectrofotómetro,
 agitador orbital,
 centrífuga,
Ttubos de ensayo (3),
 pipetas estériles de 1 y 5 mL,
 papel milimetrado.

PROCEDIMIENTO.

 Como blanco usaremos el medio de cultivo sin crecimeinto.

 Recuerde usar agua destilada para la limpieza de la celda y secar con paño suave para
evitar rallarla.
 Intensdad de luz (550 - 600 nm),

Proceso Condicion de evaluacion de Descripcion de la evaluacion.

crecimiento microbiano
1. Cultivo El microorganismo se Realicen tincion para determinar la naturaleza del
madre encuentra en suspension en microorganismo.
sustrato natural
2. Tome Suspenda 1 ml en un tubo de Tome la pimera lectura de turbiedad
inoculo ensayo
3. Incubacion Incubar a 36°C x 20 minutos Relice la segunda lectura, cada grupo tendra una
Incubar a 36°C x 10 minutos variable distinta
Incubar a 40°C x 20 minutos
Incubar a 40°C x 10 minutos
4. Incubacion Incubar a 36°C x 20 minutos Relice la tercera lectura, cada grupo tendra una
Incubar a 36°C x 10 minutos variable distinta
Incubar a 40°C x 20 minutos
Incubar a 40°C x 10 minutos
5. Incubacion Incubar a 36°C x 20 minutos Relice la cuarta lectura, cada grupo tendra una
Incubar a 36°C x 10 minutos variable distinta. En este punto se realiza
Incubar a 40°C x 20 minutos centrifugacion (4.000 rpm, 10 minutos) y se almacena
Incubar a 40°C x 10 minutos el sobrenadante.
6. Realice Evaluar la variables obtenidas La informacion obtenida sera graficada para mostrar
curva de en la evaluacion de la cinetica de crecimiento teniendo encuenta las
evaluacion absorbancia variables extrincecas. Es necesario compartir la
informacion obtenida.

EVALUACIÓN DE PROTEASAS

Proceso Descripción.
Tubo 1 + 1 mL de agua (blanco)

Se llenan 3 tubos de ensayo con 1 mL Tubo 2 + 1 mL de sobrenadante

de solución de caseína o leche muy
diluida Tubo 3 + 1 mL, de sobrenadante
y se agregan según el caso: previamente sometido durante 2 minutos a 100ºC.

Se llevan los tres tubos a baño de agua (30ºC) durante30 minutos

y se adiciona un mililitro de ácido tricloroacético.

Registre los resultados teniendo

en cuenta las variables que
influenciaron en la actividad
enzimática.

7. BIBLIOGRAFÍA
Jagnow, G., David, W. Bitecnología. Introducción con experimentos. 1991. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 251p.
Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biología de los Microorganismos. Décima edición. Pearson Education S.A.
Madrid. 1011p