TEMA 10

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE
PATÓGENOS VIABLES
 ÍNDICE DE CONTENIDOS

Introducción
Preparación de medios artificiales
Condiciones para el aislamiento de patógenos
Microorganismos y oxígeno
Incubación en condiciones anaerobias
Incubación de microorganismos capnófilos
Temperatura de incubación, pH, humedad

Medios artificiales. Ejemplos.

Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento)
Medios de enriquecimiento
Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios cromogénicos

Cultivo de patógenos intracelulares obligados

 Introducción

Regla de oro de la microbiología
Cultivo y
aislamiento de identificación
microorganismos
Muestra Cultivo puro

Realización
pruebas
susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del

diagnóstico microbiológico
 Medios de cultivo

Qué es un medio de cultivo

Medios deshidratados
Cientos de formulaciones
Empresas del sector farmacéutico
dedicadas a la producción y control de
calidad de los medios
Placas de petri y tubos con todos los
medios necesarios
EXISTEN CIENTOS DE
FORMULACIONES
DISPONILES EN EL
MERCADO
Preparación de medios de cultivo artificiales

Preparación

Esterilización

Autoclave

Tindalización

Filtración

Luz UV

Estufas a 180 ºC

Óxido de etileno

Adición de sustancias termolábiles

Vertido en placas de petri (medios sólidos) o
tubos (medios líquidos o medios sólidos)
Condiciones para el desarrollo de patógenos

Medio de cultivo

No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampón)

Exigentes (ídem. + sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas)

Condiciones ambientales adecuadas

Atmósfera adecuada

Temperatura adecuada

Humedad

Tiempo de incubación

pH

Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del
crecimiento
 Relaciones de los microorganimos
con el oxígeno

Aerobios

Anaerobios facultativos

Anaerobios

Estufas para anaerobios

Bolsas para anaerobios
(generan H2 y CO2) (Gas-Pak)

Microaerófilos

Frascos con vela

Agar semisólido

Capnófilos

Atmósfera de CO2

Sistemas Gas Pak, Bio Bag
(bicarbonato y ácidos)

Utilización de estufas de CO2
Sistemas para anaerobiosis
 Sistemas para incubación de
microorganismos capnófilos

Jarra con vela

Estufas CO2

Sistemas Biobag, Gas

Pak (bicarbonato y
ácidos)
 CONDICIONES DE INCUBACIÓN

 Temperatura de incubación
 35-37 ºC
 30 ºC
 Otras temperaturas
 Elevadas (42 ºC)
 Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío
 Intermedias (22 ºC)

 Tiempo de incubación

 pH
Clasificación de los medios de cultivo

 Medios de aislamiento primario (medios de

crecimiento y medios enriquecidos)

 Medios de enriquecimiento

 Medios diferenciales

 Medios selectivos

 Medios cromogénicos
Ejemplos de medios de aislamiento primario o
medios de crecimiento y medios enriquecidos

Agar nutritivo

Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)

Agar triptona soja (TSA)

Agar sangre

Agar chocolate

Agar CLED (urocultivo)

Agar de Múeller-Hinton

Caldo de carne picada

Caldo tioglicolato
Agar BHIA (Infusión de cerebro y corazón )

Componentes Cantidad Propiedad

Extracto de cerebro 7,8 g/l Fuente de nutrientes
Extracto de corazón 9,7 g/l Fuente de nutrientes
Peptona 10 g/l Fuente de proteínas
Dextrosa 2 g/l Hidrato de carbono
Tampón fosfato 2,5 g/l Regulación pH
NaCl 5 g/l Sales
Agar 15 g/l Agente solidificante
Objetivo
Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de
microorganismos no exigentes
Ausencia de agentes inhibidores
CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos

Componentes Cantidad

Digerido pancreático de gelatina 4 g/L

Digerido pancreático de caseína 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar 15 g/L

Medio rico y selectivo

Específico para urocultivo
Deficiencia de electrolitos inhibe la
movilidad de Proteus
Características y usos de algunos medios más
frecuentemente utilizados

Agar sangre

Triptona

Hidratos de carbono

NaCl

Tampón

Agar

5% sangre desfibrinada

Medio enriquecido y selectivo

Permite ver distintos tipos de

hemolisis, es diferencial
Recuento de patógenos mediante
la técnica de estría en placa

También se utiliza para cuantificación

de resultados:

Estimación del número de

microorganismos en la muestra
original en función del crecimiento:
Crecimiento escaso
Crecimiento moderado
Crecimiento abundante
Recuento de patógenos mediante el uso del
asa calibrada (u.f.c.)

Y también se utiliza para recuento de microorganismos

mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades
formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL)
 Caldo con carne picada para
cultivo de anaerobios

Es un medio rico , pero es un caldo, un

medio líquido

Caldo con carne picada fuente de
proteínas y nutrientes, potencial redox
bajo (ambiente reductor)

Añadido o no de glucosa

Anaerobios (parafina líquida)
Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Son medios líquidos que llevan una concentración baja de agentes

inhibidores
Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la
microbiota
Permiten enriquecer la muestra en un determinado patógeno que era
menos abundante respecto al resto de la microbiota

Caldo selenito Salmonella

Caldo tetrationato Salmonella y Shigella

Caldo Gram negativos Salmonella y Shigella

Subcultivar en medios más selectivos al cabo de 6-8 horas

 Caldo selenito

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 5 g/l Fuente de proteínas
Lactosa 4 g/l Hidrato de carbono
Selenito de sodio 4 g/l Agente inhibidor de la mayoría de Enterobacterias,
incluyendo muchas especies de Shigella
Tampón
Fosfato de sodio 10 g/l

Objetivo
Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces,
aguas fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (agar SS o
agar sulfito de bismuto)
 Medios selectivos

Llevan una concentración alta de agentes inhibidores

Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben

el crecimiento de otros

Los agentes inhibidores son sustancias de diferente

naturaleza química

Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde

brillante, eosina), antibióticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida,
alcoholes (alcohol feniletílico), cloruro sódico a alta concentración
 Ejemplos de medios selectivos

Moderadamente selectivos

MacConkey

EMB

Altamente selectivos

Agar salino manitol

Medio SS

Agar Hektoen

Agar sulfito de bismuto

Agar xylosa-lisina-dexosicolato

Agar PEA

Agar Columbia CNA
Staphylococcus
Salmonella y Shigella
Salmonella y Shigella
Salmonella y Shigella
Salmolella y Shigella
Gram positivos
Gram positivos
 Agar MacConkey

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 17 g/l Fuente de proteínas
Polipeptona 3 g/l Fuente de proteínas
Lactosa 10 g/l Azúcar fermentable
Sales biliares (conc. moderada) 1,5 g/l Inhibidor de gram positivos
Cristal violeta 0,001 g/l Inhibidor de gram positivos
NaCl 5 g/l sales
Rojo neutro Indicador de pH
Agar 13,5 g/l Agente solidificante
Objetivo
Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram
negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa
 Agar MacConkey

Diferenciación de bacilos entéricos gram negativos

fermentadores y no fermentadores de lactosa

Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patógenos (E. coli, Klebsiella,
Citrobacter)

Colonias transparentes
No fermentan la lactosa
Patógenos (Pseudomonas,
Salmonella, Shigella, Yersinia,
Proteus)
 Agar entérico Hektoen

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 12 g/l Fuente de C y N
Extracto de levadura 3 g/l Fuente de N
Sales biliares (alta conc.) 9 g/l Inhibidor de gram positivos
Lactosa 12 g/l Azúcar fermentable
Sacarosa 12 g/l Azúcar fermentable
NaCl 5 g/l Sales
Tiosulfato de sodio 5 g/l Fuente de azufre e inhibidor
Citrato férrico amónico 1,5 g/l Producción sulfuro
Salmonella/ inhibidor
Indicador de pH
Azul de timol 0,04 g/l
Agente solidificante
Agar 14 g/l
Objetivo: Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella
de otros bacilos entéricos gram negativos en muestras fecales
 Propiedades diferenciales del medio
Agar entérico Hektoen

Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven

amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un
punto negro central por la producción de sulfuro. La mayoría de las
especies de Shigella no producen sulfuro.
Medio agar salino manitol (agar de Chapman)

Agente inhibidor

NaCl al 7,5% sólo crecen

Staphylococcus y Microccocus

Incluye manitol y rojo fenol como

indicador (medio diferencial)

Los microorganismos que fermentan el

manitol se observan como colonias
amarillas

Los que no fermentan el manitol se
observan blancos o del color del medio
 Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Componentes Cantidad Propiedad

Extracto de carne 3 g/L Fuente de C y N
Triptosa 10 g/L Fuente de N
Feniletanol 2,5 g/L Inhibidor de Gram negativos
Cloruro de sodio 5 g/L Estabilizador osmótico
Agar 15 g/L Agente solidificante
Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente
estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota
mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el
crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN.
Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.
El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que
también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y
perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.
Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se

convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias
anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una
microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram
negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.
 Medios diferenciales

Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento

bioquímico (p.e., fermentación o no de la lactosa, fermentación del manitol,
producción o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.).

Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos

 Ejemplos de medios diferenciales

MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial)

EMB (moderadamente selectivo y diferencial)

Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial)

Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial)

SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales)

Agar sangre, CLED

Agar XLD,
EMB, MacConkey;
SS; HE; ADC

Agar SM
 Medios cromogénicos

Medios diferenciales
Incorporan sustancias cromogénicas
Detección de actividades enzimáticas características
de determinados géneros o especies de bacterias
β- galactosidasa
β- glucosidasa
β- glucuronidasa

Producción de un color característico identificación

β- galactosidasa
ONPG ONP + galactosa
Incoloro amarillo
 Ejemplos de medios cromogénicos

CPS ID3

Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario)

ChromAgar Orientation

UriSelect 4 (urocultivos)

Identificación bacterias en infecciones urinarias

Tres tipos de enzimas

Se puede añadir triptófano (prueba del indol o TDA)
se incrementa el número de microorganismos que se
pueden identificar
 Medios diferenciales cromogénicos para la
identificación de bacterias en muestras de orina

E. coli Klebsiella pneumoniae

Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa

MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA LEVADURAS

Un ejemplo de medio
cromogénico
ChromAgar Candida
Permite diferenciar e
identificar tres especies
de este género
(colonias verdes,
azules y transparentes)
 Medios específicos

BCYE (agar tamponado con carbón

y extracto de levadura) Legionella
Bordet-Gengou Bordetella pertussis
Regan-Lowe Bordetella pertussis
Thayer-Martin Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae
New York City Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas
genitales
Lowestein-Jensen Mycobacterium tuberculosis
CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) Yersinia
TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) Vibrio cholerae
Pico de flauta de Loeffler Corynebacterium difteriae
Diamond Trichomonas vaginalis
Sabouraud Hongos
CCF, CCYE Clostridium difficile
 Patógenos intracelulares obligados

Crecen sólo dentro de las células

No se ha encontrado un medio
completamente artificial para su
desarrollo

Treponema pallidum No se pueden cultivar

Mycobacterium leprae en medios artificiales

(Legionella pneumophila BCYE)

Cultivos de tejidos en el laboratorio

 Cultivos celulares

Cultivos primarios nº Cromosomas=2n

Células de riñón

Fibroblastos

Líneas celulares continuas aberraciones en
el nº de cromosomas aneuploidía

Hep-2, HeLa, Vero efecto citopático de la

toxina de Clostridium
difficile

McCoy Clamidias

A-549, RD, MDCK Virus