G.P. Microbiologia Médica 2020-0 - 20200106092551

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA
IV CICLO
PROGRAMA DE PREGRADO DEMEDICINA-PPM

GUÍA DE PRÁCTICA
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
2020-0
1
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL MEDICINA HUMANA
PROGRAMA MOPRE
PROGRAMA DE PREGRADO DE
MEDICINA-PPM
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL

CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas, mandil,
plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores.
2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que se
tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
 Nombre o iniciales de los estudiantes

 Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra
 Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias
 Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas
 Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC
11. Al finalizar el trabajo:
 Limpiar con papel lente los objetivos del microscopio

 Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden láminas sobre la platina
 Limpiar la mesa de trabajo
2
 Comprobar que la llave de gas este cerrada
 Lavarse prolijamente las manos con jabón.
12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.
El Profesor Responsable del Curso
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PRÁCTICA N° 1
BIOSEGURIDAD
INTRODUCCION
La seguridad en el laboratorio se puede definir como: "La situación carente de riesgo o con un
riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un conjunto de normas y prácticas para lograr
este fin"
1. Medidas generales de seguridad Barrera La seguridad como prevención viene definida

por una serie de barreras. Si estas fallan y ocurre un accidente, es preciso efectuar un
tratamiento precoz y adecuado para evitar un daño mayor y posteriormente hacer un
diagnóstico del fallo.
Las barreras se rompen por fallos humanos y/o errores mecánicos.
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: -
Contenedores, equipo e instrumental correcto y "buena práctica” (la técnica de trabajo
ordenada v rigurosa es probablemente la mejor protección que existe) - Uso de
desinfectantes y cabinas de seguridad.
Barreras secundarias: Localizadas en el círculo del operador, incluirán:

 La higiene personal rigurosa.
 La vacunación
• Programas de salud laboral.
 Vestimenta: uso de ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
 No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
 No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugación, la sedimentación o el
derrame de cultivos líquidos.
 Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lápiz a la boca.
 No sufrir inoculación percutánea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
 No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos.
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 No colocarse o quitarse lentes de contacto.
 No pipetear con la boca.
 Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros
patógenos transportados por la sangre.
 Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a
la infección. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente
al agua.
 Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
 Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
 Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
 Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para
desechos contaminados.
 Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
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DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ESTERILIZACIÓN Existen muchos agentes químicos o
físicos para eliminar los microorganismos podemos distinguir tres grupos:
 Agentes antisépticos: son germicidas químicos para la utilización en la piel como por
ejemplo; alcohol, iodóforos, etc.
 Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos en superficies e instrumentos, como

por ejemplo: soluciones fenólicas al 3 o 5%, hipocloritos.
 Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo:
los sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
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 Eliminación de residuos peligrosos Todos los materiales contaminados son agentes

potencialmente infecciosos que deben ser descontaminados antes de su eliminación. Esto
implica porciones no utilizadas de las muestras de los pacientes, cultivos de las muestras
cultivos almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo,
escalpelos y jeringas con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante
autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos métodos alternativos de tratamiento de
residuos.
II. OBJETIVO
1. Conocer las medidas de bioseguridad necesarias que se debe cumplir en el laboratorio para
disminuir el riesgo biológico.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, de las medidas de barrera necesarias para
trabajar en bioseguridad.
III. MATERIALES
 Contenedores de descarte de punzocortante.

 Guantes, gorros,mandilones, lentes
 Autoclave (visita al laboratorio donde está el equipo)
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IV.CUESTIONARIO:
1. Definición de seguridad en el laboratorio.

2. Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y terciarias.
3. ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización? (ejemplo de
c/u).
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PRÁCTICA N° 2
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio

compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
III. PARTES DEL MICROSCOPIO
Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio
PARTE MECANICA
 Tubo portalentes y cremallera

 Condensador
 Tornillos macro y micrométrico
 Brazo y Pie
 Revolver
 Charnela
PARTE OPTICA
 Ocular
 Lentes de condensador
 Objetivos
 Diafragma
 Espejo
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.
2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de
4x, 10, 20x, 40, y 100x.
V.CUESTIONARIO
1. Cuantos tipos de microscopios hay? Y cuales son?
2. ¿Esquematiza los tipos de microscopios?
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10
PRÁCTICA N° 3
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES Y ESPECIALES.
INTRODUCCIÓN
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes
ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina
(ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de

metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los
colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes
que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -

Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora)
,Albert,etc.
1. REALIZACIÓN DE LA EXTENSLÓN
 Producto lÍquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del

producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de
modo que la extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede
ser diluido antes ligeramente.
 Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua ó solución
salina estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener
un frotis fino y homogéneo.
 Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar sobre el primer
tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequeña gotita de sangre. Hacer
contactar con la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinará 45 °C.
La sangre alcanza por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia
la parte libre del primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un
solo movimiento, sin detener ni volver atrás.
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 Órganos: seccionar un pequeño fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con ésta porción una
extensión o una serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se obtengan
preparaciones finas.
2. SECADO
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
3. FIJACIÓN Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas
coloraciones especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de la misma es
hacer adherir el frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por
coagulación rápida de las proteínas.
Puede ser por:
 Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas

gotas de alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo
mejor posible e inflamar después el alcohol restante.
 Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte
inferior de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe
rechazarse para los productos patológicos puesto que altera la morfología de los
elementos celulares.
 Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
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EXAMEN DE LAS PREPARACIONES TEÑIDAS
Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar
cubreobjetos. Depositar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. Descender primero el
objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x sumergiéndolo en la gota, comprobar
el enfoque microscópico con el tornillo micrométnco.
OBJETIVO
 Realizar coloraciones: simples, diferenciales y especiales

 Diferenciar que tipos de muestras se utilizan para cada coloración.
 interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en tas distintas
coloraciones y discernir si la coloración fue bien realizada.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
MATERIAL
 Muestra con mezcla bacteriana
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 Láminas portaobjetos
 Laminillas cubreobjeto
 Asa bacteriológica de Kolle en aro
 Colorante Azul de metileno
 Colorante Tinta China
 Colorante Azul de lactofenol
 Mechero de Bunsen
 Varillas para coloración
 Aceite de cedro
 alcohol isopropilico
 Papel lente
 Microscopio de luz con objetivo de inmersión
COLORACIÓN AZUL DE METILENO:
1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor
2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lámina portaobjetos
2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo

colorante es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de
Gram y la de Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente
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COLORACIÓN DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas
la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del Gram,
una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
 Muestra con mezcla de bacterias

 Solución fisiológica al 0.85%
 Asa bacteriológica de Kolle en aro
 Pipetas pauster de plástico
 Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff: Violeta de genciana o Cristal violeta
(colorante primario) Bicarbonato de sodio Lugol (mordiente) Alcohol- acetona
(decolorante) Fucsina básica (colorante de contraste)
 Mechero de Bunsen
 Varillas para coloración
 Microscopio de luz con objetivo de inmersión
 Aceite de cedro
 Alcohol isopropilico
 Papel lente
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del
frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la
llama débil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución
de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta
que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con
agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
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RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color
rosado.
CUESTIONARIO:
1. ¿Porqué la Escherichia coli puede adquirir el color de la Fucsina?¿De qué está
compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
2. ¿Porqué el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
Fucsina? ¿De qué está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
PROTOCOLO:
Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.
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PRÁCTICA N° 4
COLORACIÓN DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCIÓN
Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado

contenido de lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también
ácido-alcohol resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina
básica fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es
forzado a penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
 Láminas con frotices de bacilo tuberculoso

 Set de coloración Ziehl-Neelsen: Fucsina fenicada al 5% (colorante primario) Alcohol
ácido (alcohol etílico con 3% de HCl) Azul de metileno (colorante de contraste)
 Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento
por tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
7. Secar y observar con lente de inmersión.
RESULTADO Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol
resistentes se tiñen de color azul.
CUESTIONARIO:
1. ¿Porqué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno?
¿De qué está compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
2. ¿Qué otros microorganismos son considerados dentro de la clasificación de ser BAAR?
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
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PRÁCTICA N° 5
COLORACIÓN ESPECIAL
INTRODUCCIÓN
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con
los colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de
microorganismos presentes en la sangre.
COLORACIÓN DE LEISHMAN
Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de

microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
 Frotis de sangre con Bartonella o bacterias variadas

 Solución de colorante Leishman
 Agua destilada tamponada
 Microscopio con lentes de 100X
 Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.
2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIÓN DE VAGO
Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el

método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.
MATERIALES
 Lámina portaobjetos
 Palito mondadientes
 Set de coloración de Vago: Mercurio cromo al 2% y Violeta de genciana
 Asa de siembra en aro
 Microscopio con lentes de 100X
PROCEDIMIENTO
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1. En una lámina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en
capa fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercurio cromo durante 3 minutos
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro
Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando

parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersión
RESULTADOS
Hiss : El cuerpo bacteriano de Bacillus anthracis se observa de color púrpura y la cápsula de

color claro o incoloro.
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5

minutos (adicionar colorante cada vez que falte) 3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar
RESULTADO
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Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano de Bacillus sp. se observa de color rosado y la espora de
color verde
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COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se
tiñen de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
RESULTADO
En la coloración Albert observar la bacteria Corynebacterium sp. color verde y los gránulos de
color azul oscuro
PROTOCOLO:
Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
21
PRACTICA N° 6
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES,
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios

especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser:
simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
De acuerdo a su consistencia
Líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El
medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto
de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una
suspensión bacteriana de una determinada concentración.
Semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente

solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la
investigación de la movilidad de las bacterias
Sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante , el agar.
Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula
insoluble en agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme
entre 32 y 39ºC y no se funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido
alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos
indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un
microorganismo. Especialmente útiles para el aislamiento de bacterias y observación de
colonias, contienen de 2 a 3 % de agar
SEGÚN SU UTILIZACIÓN.
1) Medios Simples: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio
más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar
al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar triplicase de soja, el agar
Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos
(sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores.
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3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en
facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de
medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas
y frenar el del resto de enterobacterias.
MATERIALES
 Tubos con Caldo nutritivo

 Placas con Agar simple o Agar nutritivo
 Caldo peptonado
 Agar Mac conkey
 Agar Sangre
 Agar chocolate
 Agar Manitol salado
 Agar SS
 Agar TCBS
 Agar TSI
 Agar SIM
 Agar Citrato de simons
 Agar Urea
 Agar LIA
 Agar MR VP
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A. Los medios de cultivo que se vieron en la práctica
B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C. Materiales que se usan para la preparación.
D. Indicar cuál es su indicador e inhibidor según sea el caso.
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PRACTICA N° 7
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima
a las 24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan

cultivos y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por el
cual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen
varias técnicas de siembra, siendo las más usadas :
La siembra por estría, por dispersión agotamiento, por inoculación y por puntura.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO : Diámetro en milímetros.
CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.
CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
 Tubos con suero fisiológico estéril

 Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
 Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
 Placas con Agar nutritivo
 Placas con Agar Mac Conkey
 Placas con Agar hipertónico de Chapman
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PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
 Tubos con Agar Sabouraud

 Tubos de 16x150 con medio Caldo nutritivo
 Agar hipertónico de Chapman
 Agar TSI,LIA,CITRATO,UREA
 Agar Mac conkey
 Asas de siembra en aro y punta
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra
bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en
aro. Ejemplo agar urea, citrato, TSI, LIA
Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad

de la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos
45º y continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra
en aro. Ejemplo Agar manitol ,Agar SS
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con
ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Ejemplo SIM, MIO ,TSI, LIA
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del
tubo. Ejemplo los medios en caldo MR VP,PEPTONA,NUTRITIVO
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B) LECTURA:
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos

sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
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PRACTICA N° 8
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las

características de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin
embargo, la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a
nivel de género y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos
para cada especie y sirvan como marcadores de identificación.
En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la

colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos
específicos e indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de
subproductos específicos.
I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un

medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor
final de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de
hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de
ácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por
el cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas
(CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de
hidrógeno (H2S).
27
El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH
que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos
presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres: 1. Fermentación de glucosa
únicamente.
2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentación de carbohidratos.
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia
arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales
de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso
(FeS).
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado. Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe
la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que

se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la
cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados
por la utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados. Estos procesos, que
son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en
contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.
3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la

glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo
que el tubo permanece amarillo.
28
4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización
oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
29
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,
fórmico) a partir de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación
de ácidos mixtos frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación
prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador
rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.
2 PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la

glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil-
metilcarbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol. La prueba se basa en
la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del KOH y Oxígeno
atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción catalítica del Alfa naftol
y Creatinina.
MATERIALES
 Cepa bacteriana MR positivo y negativo

 Cepa bacteriana VP positivo y negativo
 Reactivo Rojo de metilo
 Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
 Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y

negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C. 2.
Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo
nombre, cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo).
La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo-
naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y
0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15
minutos. Es importante añadir los reactivos en el orden específico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una
30
hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa
positiva. En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
I. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco(NH3). El indol puede
detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en forma
de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p-
dimetilaminobenzaldehido
MATERIALES
 Cepa indol positivo y negativo.

 Medio líquido peptonado y/o Medio SIM
 Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).
 Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que
no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta una
prueba negativa.
III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia

Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de
los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su
metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta
característica no debe contener proteínas ni carbohidratos. El citrato de sodio es una sal del
ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de
Krebs.
PRINCIPIO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato
con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio,
un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio,
con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en hidróxido
31
de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol
cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES
 Cepa control citrato positivo y negativo.

 Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría en cada tubo la cepa
citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Prueba positiva: Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)
Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa
que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:
El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una

alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
 Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

 Medio Agar urea según Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el
fondo. 2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio. Prueba negativa:
El medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
32
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias. El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa
convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:
La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa)

de los estafilococos (catalasa positiva).
MATERIALES
 Cepas Control: S. aureus, Streptococcus ó Enterococcus

 Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%
 Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados
falsos positivos.
PRUEBA EN LÁMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia bien
aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede
resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder su
actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que
ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE
AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son

indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que
33
descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30’, éstas no son catalasa
positivas.
VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la
cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de agua. El
sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos,
permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En
el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o
tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa).
MATERIAL
 Cepa control: sembrada en Agar nutritivo

 Reactivo de oxidasa
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos
o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIÓN Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan

inmediatamente un intenso color azul oscuro.
AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)
Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina

descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de gases
(CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).
Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la

superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH
del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al
color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo
del tubo es amarillo y la superficie alcalina
Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta la glucosa:

superficie purpura/fondo amarillo.
34
b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie
violeta/fondo amarillo).
c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
d) Producción de gas: ruptura del medio.
e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.
VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias tóxicas
que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre,
produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en
tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
 Cepa bacteriana
 Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C
INTERPRETACIÓN
Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio
debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos
del tipo de la biliverdina
Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara
alrededor de la colonia
35
VIII. PROTOCOLO
36
PRACTICA N° 9
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:
 Método de dilución
 Método de Difusión en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los

antibióticos.
2. Interpretar los resultados del método utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la

concentración inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el
crecimiento “in vitro” bacteriano.
Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en

medio agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24
horas, se puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento
macroscópico bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o

quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en
sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego
discos de papel filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24
horas, se observan las zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de
antibiótico presente en el disco difiere para los distintos fármacos.
37
MATERIALES
 Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya

 Tubos con caldo nutritivo
 Tubos con Agar semisólido
 Tubos con cultivo bacteriano
 Asas de siembra
 Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).
 Pinzas
 Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm. 4.
Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano

alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si
el microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados. Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos
susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis altas del antibiótico.
c) La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su
capacidad de difusión en el Agar.
d) Anotar e interpretar los resultados.
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PROTOCOLO
 Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en

la práctica desarrollada
 Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en
la práctica desarrollada
39
PRACTICA Nº 10
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO

STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u

ovales, agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y
Grampositivos en los cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca,
piel e intestinos, pero como patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que
van desde forúnculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales.
De las tres especies conocidas S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos
tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S. aureus produce una enzima
llamada coagulasa.
MATERIALES
 Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado
 Placas Petri con Agar sangre (AS)
 Tubos con Caldo plasma
 Set de colorantes para Gram
 Asa de platino en aro
 Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar
sangre, por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a
37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus,
estudiando las características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar
Hipertónico de Chapman (tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una
colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba
de la coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al
6.5% y como indicador de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
40
RESULTADOS:
1. Características macroscópicas de la muestra:

2. Resultado de la coloración realizada
3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus
coagula el plasma.
4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la
aparición de burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita
positivas) de S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S
.epidermidis.
6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es
sensible y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
 Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo,

tamaño de la colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras
características que crea conveniente.
 Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.
41
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación

de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej.
Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae
(no pertenece a ningún grupo). Con la coloración de Gram se comportan como positivos
adoptando formas de cadenas. Algunos son patógenos para el hombre y los animales,
otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son
saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que

permite diferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo
es incompleta, los glóbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero
no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio
debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es
oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolíticos
se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en presencia
o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las
especies de Streptococcus.
MATERIAL
 Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI
 Placas con Agar sangre de carnero
 Torunda estéril y bajalengua
 Tubos con Thioglicolato
 Tubos con caldo Inulina
 Discos de Bacitracina
 Discos de Optochin
 Solución de Desoxicolato al 2%
 Tubo con ClNa al 6.5%
 Set de colorantes de Gram- Kopeloff
 Asas de Kolle, pinzas
 Microscopio, aceite de inmersión.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento

produce turbidez o sedimento.
42
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de
dispersión y agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la
lámina portaobjetos y colorear por Gram.
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina
y el disco de Optochin,
4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.
5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
7. Realizar la prueba de la catalasa
8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas
bacterias de lisarse en presencia de sales biliares
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S.
pneumoniae son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la
Bacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la
placa de Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se
observa que las colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para
determinar el efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo),
contiene Agar 0.075% y ácido tioglicolato que actúa como agente reductor
disminuyendo aun más el potencial de oxido-reducción del medio.
6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D) 7.
Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
 Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada
43
44
PRACTICA Nº 11
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en

pares, con los lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende
varias especies, entre éstas N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente
enfermedad significativa en el hombre. En muestras clínicas del tracto urogenital u
otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de metileno, observándose las
Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar

chocolate, que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente
alta y una tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a
37°C y un pH de 7.2 a 7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos
de otros microorganismos morfológicamente similares.
La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de
carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el

laboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recolección correcta de la muestra.
b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.
c) Selección del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
 Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria
 Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
 Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
 Reactivo de Citocromo- oxidasa
 Reactivo de catalasa
 Set de coloración de Gram
 Colorante de Azul de metileno
 Microscopio
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 Asas de siembra en aro y punta
 Solución de alcohol yodado
 Algodón y alcohol isopropilico
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas,

circulares de bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente
opacas si corresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de
borde entero, circulares, translúcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2-
3 minutos el cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una
prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar
con la lámina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el
azul de metileno.
PROTOCOLO
46
PRACTICA Nº 12
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de

esporas y que pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies
causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis causante de la
enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son
saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se
presenta como un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los
cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de
cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo
envejece forman esporas.
MATERIALES
 Placas Petri con Agar nutritivo
 Placas Petri con Agar sangre
 Tubos con Agar semisólido
 Tubos con gelatina
 Láminas para frotices
 Set de coloración de Hiss para cápsula
 Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
 Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y

gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30
segundos 3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
47
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5
minutos (adicionar colorante cada vez que falte) 3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies
patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se observan
bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina:
sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.
EN LAS LÁMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se

ubican en el centro del bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o
incoloro.
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color
verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
48
49
PRACTICA Nº 13
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

LISTERIA
INTRODUCCION
El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no

esporulados, móviles y presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en
grupos de dos en cadena o en forma de V ó de Y. Esta ampliamente distribuido en
la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo, en las heces de los
portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual
compromete los ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis
aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las
heces, desarrolla bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL
 Tubos con medios semisólidos (Motilidad)
 Placas Petri con Agar sangre
 Placas Petri con Agar nutritivo
 Tubos de 13x100 con:
 Agar urea de Christensen
 Citrato de Simmons
 Caldo rojo de fenol con glucosa
 Caldo rojo de fenol con sacarosa
 Caldo rojo de fenol con lactosa
 Caldo rojo de fenol con manita
 Caldo rojo de fenol con salicina
 Caldo esculina
 Caldo: MR- VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con
Gram.
2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado,
entre lámina y laminilla.
50
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo,
y en los diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
LECTURA
 FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.
 LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los
objetivos de 40 aumentos.
 EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
 EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo
Beta.
 EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
51
PRACTICA Nº 14
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION

BUCOFARINGEA”
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de
forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento
dependen de la edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar
la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados;
ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su
tracto gastrointestinal, en los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos
presentan un gran desarrollo de levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran número de especies patógenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
 Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
 Agar nutritivo en placas
 Agar sangre en placas
 Agar chocolate en placas
 Medio hipertónico de Chapman en placas
 Agar Mac Conkey en placas
 Agar Sabouraud en tubos
 Torundas estériles (2 x tubo)
 Baja lengua
 Asa de Kolle en aro
 Laminas portaobjetos
 Set de colorante
 Gram Varillas para coloración
52
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado
en los medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente y

pruebas de patogenicidad si se requiere.
 Caldo plasma en tubo

 Disco de Bacitracina
 Disco de Optochin
 Reactivo de Citocromo
 oxidasa
 Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos
53
PRACTICA Nº 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología
bacilar, poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan
lentamente en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes
nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el
aire, en el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis,
que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y
digestiva los mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el
diagnóstico específico a través de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra ó enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,

Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia,
también, son patógenos.
PRUEBAS DIAGNÓSTICAS:
 Examen directo: BACILOSCOPIA

 Cultivo convencional: OGAWA o LJ
 Pruebas de sensibilidad convencionales:
Método de proporciones se 1era línea
Método de Proporciones en placa de 2da Línea (APP)

 Pruebas de sensibilidad rápidas:
GENOTÍPICAS:
Sondas de ADN (Genexpert MDRplus): Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina
GeneXpert: Se evalúa la droga Rifampicina
FENOTIPICAS
MODS: Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina
MATERIALES
 Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo

 Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
 Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis
54
 Láminas con extensión de otros tipos de Micobacterias
 Set de colorante de Ziehl- Neelsen ( B.A. A. R.)
 Cepas patrones sembradas en medio Lowenstein Jensen o Ogawa
PROCEDIMIENTO
1. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.
2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la
lámina portaobjetos nueva.
3. Fijar la preparación.
4. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen
porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares
rojos en un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
BACILOSCOPIA
Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda
la longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar
los resultados, según el siguiente cuadro:
Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.
De 1 a 9 BAAR promedio en 100 campos
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo promedio por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos promedio por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Más de 10 bacilos promedio por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que esta en tratamiento y
permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
55
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos

en grupos.
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica correspondiente
56
PRACTICA Nº 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se

incluyen especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las características comunes del género son:
1) Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en

“letras chinas”,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda,

contagiosa y febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en
la orofaringe, además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina
(toxina difterica). Es propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es
las vías respiratorias superiores.
El género se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales; Grupo II :

Corinebacterias fitopatógenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patógenas.
Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son:

C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y

C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier
lesión inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y
enviar inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o
Agar telurito.
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MATERIAL
 Cepa de Corynebacterium diphtheriae en caldo enriquecido

 Placa con Agar sangre
 Placa con Agar chocolate telurito de potasio
 Tubo de 13x100 con medio Pai en plano inclinado
 Set de colorante de Gram
 Set de colorante de Albert
 Tubos con Agar Urea Christensen en plano inclinado
 Caldo Rojo de fenol + Glucosa
 Caldo Rojo de fenol + Maltosa
 Asas de siembra
 Microscopio
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inóculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el método de dispersión

agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por estrías. Incubar
por 48 horas a 37°C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.
4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo

Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se
tiñen de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
58
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados

ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o dispuestos
paralelamente, o en forma de “letras chinas”.
En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro
En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos)
observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
a) Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.
b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
c) Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.
En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con bordes
enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta hemolisis.
BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae
59
PRACTICA Nº 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes
para su desarrollo “In Vitro”.
Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,

principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados
bronquiales, esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar
infecciones con riesgo de vida fatales.
La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.

aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42°C.
MATERIAL
 Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

 Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
 Agar nutritivo en Placa Petri
 Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
 Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100
 Medio TSI
 Reactivo de Oxidasa
 Frasco con cloroformo
 Set de colorantes Gram
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de

Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas
conocidas. 3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color

verdoso y un olor característico.
60
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa. MEDIO TSI:
No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no fermentan los
carbohidratos [utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio de oxidación-
fermentación (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el Agar, y realizar
la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la piocianina.
PROTOCOLO
61
PRACTICA Nº 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO BRUCELLA

HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de

esporas. Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo
menos 2 minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes
especies Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el
Agar Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de
H2S, hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002
% y requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o
biopsias de ganglios linfáticos e hígado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La
incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de:
1. Aglutinación rápida en placa
2. Aglutinación lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
MATERIAL
 Tubo con cepa de Brucella

 Frascos con medio de Ruiz- Castañeda
62
 Muestra de sangre total de paciente
 Agar fucsina en placa
 Agar Thionina en placa
 Suero positivo y suero control negativo
 Antígeno estandarizado de Brucella
 Láminas excavadas
 Pipetas de 0.2 ml
 Palito mondadientes
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e

incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de

Gram, siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea
de la lámina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por
el suero negativo y la dilución más alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos más.
63
6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una
reacción positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
64
PRACTICA Nº 19
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias
(Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y
aerobios, algunos de los cuales son patógenos para el Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante

el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el
aislamiento del agente patógeno bacteriano.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en

determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les
permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo
enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la
E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio
y urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e
infección y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre
y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales
y fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con
flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes
de infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital
MATERIALES
 Muestra de heces.
 Placas Petri con Agar Mac Conkey
 Placas Petri con Agar SS
 Placas con Agar Manitol
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 Tubos con Agar Sabouraud
 Tubos con medio TSI, LIA
 Tubos con caldo peptonado
 Tubos con Citrato de Simmons
 Tubos con caldo MR-VP
 Frasco con Lugol
 Reactivo para Citocromo-oxidasa
 Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
 Reactivo para Rojo de metilo
 Láminas portaobjeto y cubreobjeto
 Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
 Juego de colorantes para Gram
 Material básico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de

solución salina.
b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar
SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo
peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa
y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en
las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las

características.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma
el medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y

producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio
66
debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador
púrpura de bromocresol]
EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo
de Kovac tornándose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como
fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color
azul), negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando
hay producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color
amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se
le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo),
negativo (color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y
observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario
no habrá ningún cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad
utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUÍMICA
67
PRACTICA Nº 20
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo
las de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas
cutáneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas,
tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en
parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman
esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
 Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus

 Tubos con TSI
 Tubos con LIA
 Tubo con Caldo peptonado
 Tubo con MR-VP
 Tubo con Citrato de Simmons
 Desoxicolato de sodio al 0.5 %
 Microscopios
 Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de
V. cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos
a partir de la utilización de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de
aspecto verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa
positiva)
68
2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la
sacarosa, no produce H2 S.
3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
4. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.
5. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol
6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio
7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
8. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de

Desoxicolato sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir
una colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al
retirar el asa “como una cuerda larga” que se torna más pegajosa después de 60 segundos
más.
9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados.
PROTOCOLO
69
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la práctica
2. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.
70
PRACTICA Nº 21
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente
unidas, muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan
a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden

Spirochetales; comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes
serológicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos

comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades
antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de
restricción o la composición de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los
roedores y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la
orina el agente etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de
transmisión puede ser directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del
agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones
de la piel y mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de

conejo o carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación
de 5- 10 días, en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo,

orina) en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.
2. Evidencia sexológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico
inicial de 1:100
MATERIAL
 Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado

 Lamina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo
de Congo.
71
 Microscopio.
LECTURA
En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en

todo el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio En la
coloración de Kiktenko las Leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta en fondo incoloro,
presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los extremos
en forma de semigancho y con las espiras bien unidas. En la observación al microscopio de
campo oscuro, las leptospiras se observan como un “collar de perlas” son muy móviles, realizan
movimientos de translación, rotación y al rededor de su eje.
RESULTADOS
1. Características del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observación en las láminas coloreadas
72
PRACTICA Nº 22
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIÓN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de

la Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un
insecto alado hematófago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su

tamaño varía entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de diámetro, presenta flagelos unipolares
en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta),
y en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad
por los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios

enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma,
durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento por lo general semanas,
enturbia el medio con sedimento y a veces se observa películas o témpanos en la superficie de
la parte líquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las

lesiones eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de
fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden
realizar pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por
Infección de los hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del
movimiento de los hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella
MATERIAL
 Frotices coloreados por Leishman, Wrigth ó Giemsa procedentes de cultivo.

 Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
 Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN
Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella.

En las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de

películas o témpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
73
PRACTICA Nº 23
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL ó RPR
INTRODUCCIÓN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares

móviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres
géneros de microorganismos patógenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sífilis,
T. pertenue, produce el pián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce
la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina
infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho
y 5 a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de
anilina y es difícil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles
características.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no
treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey)
4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene 0.03%
de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las
partículas del antígeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en
enfermos se combina con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos
contra algunos antígenos).
5. Prueba de aglutinación (RPR) En la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las
"reaginas" presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan
por acción de las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre
partículas de carbón. La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente,
favorecida por las partículas de carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de
antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario
inactivar la muestra
MATERIALES
 Suero problema
 Laminas excavadas
 Antígeno VDRL o RPR
 Pipetas graduadas
74
PROCEDIMIENTO (VDRL)
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lámina
excavada
Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de floculos cuando la

reacción es positiva.
PROCEDIMIENTO (RPR)
I.PRUEBA CUALITATIVA
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada
uno de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico provisto: Muestra o
Controles 1 gota (50 ul) Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente
en todo el círculo.
Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo:
Reactivo A 1 gota (17 ul)
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con
agitador rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación
al cabo de este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados
II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA
Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder
de la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última
dilución que se observe reactiva.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Reactivo: presencia de aglutinación visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que
indica presencia de "reaginas" en la muestra.
No reactivo: aspecto gris homogéneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra.
RESULTADOS
N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos
RD (Reactivo débil) .................. Floculos pequeños
R (Reactivo) .............................. Floculos medianos y grandes
75
PRACTICA Nº 24
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes

patógenos causantes de una infección urinaria.
Para la obtención de muestras debe considerarse:
La recolección debe ser con un mínimo de contaminación Establecer el momento óptimo para
la recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad de recuperar microorganismos
causales. Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo
necesarias. Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de
antibióticos.
Normalmente la orina es estéril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de

contaminación por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la
muestra negativa. 2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que
hay infección urinaria.
3. Si el número de gérmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recolección
para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el
Antibiograma correspondiente.
MATERIAL
 Muestra de orina patológica

 Sedimento de orina
 Agar Mac Conkey, Medio hipertónico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en
placas
 Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C
 Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C
 Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar
Urea de Christensen.
 Tubos con 9.9 ml de Suero fisiológico 0.85%
 Pipetas de 1 ml. estériles Placas Petri, vacías estériles
 Bocal con desinfectante
 Microscopio
 Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
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 Serie de colorantes de Gram
 Láminas portaobjetos y laminillas
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
A. Estudio de las características macroscópicas Describir el aspecto de la orina: Color

(amarillo, oscuro, castaño o incoloro) Señalar si la orina es clara o turbia.
B. Estudio de las características microscópicas
1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al microscopio
con objetivos de 10X y 40X
2. Realizar un frotis y colorear por el método de Gram y Ziehl- Neelsen
C. Siembra de la muestra de orina:
1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersión agotamiento en las placas
con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
2. Método de dilución: Preparar una dilución de la orina de la siguiente manera.
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con suero
fisiológico 0.85% estéril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacías
estériles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar nutritivo
licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla homogénea.
d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37°C por 18- 24 horas.
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos,
cristales anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales,
cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes(en caso de
infección por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el

crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo decolonias
77
resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de
levaduras.
2. En la siembra por dilución, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número
de colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
3. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioquímica
respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de Christensen.
Incubar a 37°C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara
una suspensión en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentración Mínima Inhibitoria
(MIC) del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del
antibiótico alcanzado en el suero o en foco de infección.
El método de disco-difusión estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el

laboratorio, para dicha determinación (MIC).
REPORTE FINAL
Diseñar el protocolo correspondiente, señalando:
1. La observación macroscópica y microscópica de la muestra clínica.
2. Las características del desarrollo bacteriano, y los principios bioquímicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioquímico.
4. La determinación del agente patógeno causante de la infección urinaria.
5. Determinación cuantitativo número de UFC por ml.
Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)
78
PRACTICA Nº 25
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES LACTANTES.
OBSERVACION DE LÁMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de
los animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos).
En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano;
debido a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo
intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien
algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela,
rabia, hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el
crecimiento y multiplicación deben necesariamente utilizar los sistemas de las célula que
parasitan y por ello se denominan parásitos intracelulares obligados.
En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las
infecciones virales así como drogas antivirales específicas para muchos virus.
Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican
en el interior de las células vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de métodos
especiales en el laboratorio de virología, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayoría de los virus pueden multiplicarse en

cultivo de células apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad alantoidea y saco

vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hámsters, monos)
d) Serología o demostración de anticuerpos frente al virus.
e) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigación médica y epidemiología y

constituye un método muy extendido para el diagnóstico de la infección.
Por lo tanto estas prácticas nos orientan a conocer los diversos métodos de aislamiento directo
o indirecto para demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como se
deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
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METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO:
A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.
Muchos de los virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse
en las células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos
embrionados de gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y
desde entonces están siendo ampliamente usadas.
Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser
inoculado.
MATERIALES
 Huevos embrionados de 7-9 días.

 Huevos embrionados de 10-12 días.
 Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.
 Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
 Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada
 Frascos con Alcohol yodado
 Algodón
 Ovoscopio
 Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
 Equipo de disección (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
 Ratones lactantes
INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA
a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 días.
b) Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevos embrionados.
c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de 45°

e inocular 0.2 ml. de colorante.
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por
2-4 días, luego cosechar y observar.
INOCULACION POR VIA AMNIOTICA
a) Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días.
b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del
embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón.
c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
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d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana
amniótica, formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución
de Azul de metileno o del inoculo problema.
e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 3335°C
por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
INOCULACION DEL SACO VITELINO
a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo
embrionado de 6-7 días.
b) Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo
la aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
d) Sellar la abertura
D. INOCULACIÓN EN RATONES LACTANTES:
Se utilizaran ratones lactantes y las vías de inoculación serán: Intraperitoneal, Intracraneal,

Subcutánea y Nasal.
E. OBSERVACIÓN DE LÁMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión

(Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su
localización es específica de la enfermedad viral. Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto
citopatico) como conglomerados de virus asociados a productos de reacción de la célula
infectada.
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:
1. Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado el
citoplasma.
2. Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusiones eosinofilas

intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración

celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el
borde de la célula.
4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las
inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
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5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en “ojos
de lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).
6. Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las

inclusiones basófilas intranucleares.
PROTOCOLO Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.
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83
PRACTICA Nº 26
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a

expensas de la materia inerte existente, la mayoría se encuentra como saprofito, otros pueden
ser causantes de inducir hipersensibilidad así como también ser responsables de infecciones.
Entre los hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,
Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES
 Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,

Rhodotorula y Helmintosporium.
 Láminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
 Microscopios
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio aéreo, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscópico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las características

microscópicas de cada uno de los hongos preparados en las láminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo a la especie en: amarillo, verde
azufrado, marrón o negro.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas que forman conidióforos no tabicados que se

ensanchan en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas
y de donde salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en cuyo extremo se

hallan los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
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Fusarium
Colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado ó violeta en la superficie.
Microscópicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidióforos, macroconidias

septadas y alargadas, fusiformes.
Rhizopus
Colonias de micelio aéreo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisáceo.

Microscópicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos
esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior
se encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio aéreo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias
hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia
elevada de color gris.
Microscópicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales

sobre conidióforos cortos y nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica.
85
86
PRACTICA Nº 27
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS
INTRODUCCION
Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del
cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y
los invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más
comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum
y Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o
Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso
de los cabellos, barba y bigote.
Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum
gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).
MATERIALES
 Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M.

gypseum y E. floccosum.
 Lámina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
 Láminas preparadas de M. furfur en hidróxido de potasio al 20%.
 Láminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.
 Material básico de laboratorio(xilol, algodón, alcohol)
 Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia , producción de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos

preparados en láminas.
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CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio aéreo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un

pigmento de color púrpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un

pigmento amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esféricas agrupadas,

pueden presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con

pigmentación amarillo- castaño al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en

raquetas septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en

número de 4-6, rara vez se observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de
la colonia.
Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con

pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse microconidias y
clamidosporas.
88
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la

colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)
Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas

agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnóstico se da por el
examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a
negro que envuelven completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica
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90
PRACTICA Nº 28
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES. OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en
las cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues
cutáneos. Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans
y otras especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o
mucosas, aparato genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus
neoformans pueden causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre
la infección primaria es casi siempre pulmonar.
MATERIALES
 Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.

 Láminas de Candida albicans en Agar harina de maíz.
 Láminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
 Cortes histológicos con C. albicans y Cr. neoformans.
 Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)
 Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto

y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el
Agar harina de maíz, tinta china y en los cortes histológicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES
Candida albicans
Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
En el Agar- almidón- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican

a Candida albicans. En los cortes histopatológicos observar la presencia de filamentos cortos
y levaduras en las lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto
mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la
levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.
91
En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones,
las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.
92
93
PRACTICA Nº 29
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS. OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en
el hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporógena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en

su fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infección crónica, granulomatosa de la piel,

mucosa, ganglios y vísceras. Es más frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporógena, que se desarrolla

principalmente sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza),
excremento de murciélagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma

benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios
linfáticos
MATERIALES
 Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.

 Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol
 Cortes histológicos infectados por estos hongos.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
94
2. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células
esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados
con microconidias esféricas o piriformes.
En Agar Infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.
Microscópicamente se observan células esféricas.
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histológicos se observan intracelularmente como nidos de levadura

incluidas en los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeñas, redondas u
ovaladas de 1-3 micras de diámetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco.

Microscópicamente se observan hifas tabicadas con escasa producción de microconidias y gran
cantidad de macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa “Clamidospora
tuberculada”.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón
claro. Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeñas, blanquecinas presentando

posteriormente un aspecto húmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de
crema a negro.
Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo
se encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en

gemación ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
95
96

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE PREGRADO DEMEDICINA-PPM

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL

7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.

 Nombre o iniciales de los estudiantes

11. Al finalizar el trabajo:

 Limpiar con papel lente los objetivos del microscopio

El Profesor Responsable del Curso

1. Medidas generales de seguridad Barrera La seguridad como prevención viene definida

Barreras secundarias: Localizadas en el círculo del operador, incluirán:

 Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos en superficies e instrumentos, como

 Eliminación de residuos peligrosos Todos los materiales contaminados son agentes

 Contenedores de descarte de punzocortante.

1. Definición de seguridad en el laboratorio.

1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio

2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio

 Tubo portalentes y cremallera

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:

En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de

B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -

 Producto lÍquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del

Puede ser por:

 Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas

EXAMEN DE LAS PREPARACIONES TEÑIDAS

 Realizar coloraciones: simples, diferenciales y especiales

 Muestra con mezcla bacteriana

COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo

 Muestra con mezcla de bacterias

Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.

COLORACIÓN DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado

 Láminas con frotices de bacilo tuberculoso

2. Lavar con agua corriente.

4. Lavar con agua corriente

5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.

6. Lavar con agua corriente

7. Secar y observar con lente de inmersión.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de

 Frotis de sangre con Bartonella o bacterias variadas

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos

3. Lavar con agua de caño y dejar secar

4. Observar con objetivo de inmersión

5. Anotar los resultados en el protocolo.

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el

3. Fijar el frotis al calor suave

4. Cubrir con Mercurio cromo durante 3 minutos

5. Lavar con agua corriente

6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos

7. Lavar con agua corriente

8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro

Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando

COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

4) Lavar con agua corriente y secar

5) Observar al microscopio con lente de inmersión