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de bacterias
Alfredo Martínez Jiménez y Guillermo Gosset Lagarda
Entre los compuestos generados por la indus- llamadas enzimas que funcionan como catali-
tria química, los aromáticos y los combusti- zadores. La biotecnología estudia y aprovecha
bles se distinguen por tener un gran número esta capacidad catalítica natural de los orga-
de aplicaciones en los sectores farmacéutico, nismos para generar procesos biológicos de
de alimentos y energético. Actualmente, estas producción de moléculas útiles.
moléculas se obtienen mediante procesos ba- El conjunto de reacciones químicas que
sados en refinación y síntesis química a partir ocurren en un organismo se conoce como me-
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del petróleo y derivados. Esto permite producir tabolismo. Esta serie de transformaciones quí-
compuestos aromáticos y combustibles úti- micas tiene el propósito de generar diversas
les con un costo de producción relativamente moléculas que serán unidas en diferentes con-
bajo. Sin embargo, la mayoría de estos proce- figuraciones y así se generarán nuevos com-
sos generan subproductos que contaminan ponentes celulares. Mediante este proceso la
el medio ambiente. Por otro lado, depender célula crece hasta llegar a un punto en que se
del petróleo como materia prima tiene la des- divide dando lugar a nuevas células. Mediante
ventaja de que no es renovable, por lo tanto, reacciones específicas, la energía química para
en el futuro su disponibilidad será limitada. llevar a cabo estos procesos es extraída de las
Por estos motivos, ha surgido el interés en la moléculas orgánicas, principalmente azúcares.
búsqueda de alternativas tecnológicas para Así, cualquier célula puede considerarse como
producir compuestos útiles mediante proce- una fábrica microscópica, capaz de llevar a
sos no contaminantes y que no dependan del cabo un gran número de reacciones químicas
petróleo. Una de las alternativas más promiso- diferentes. Sin embargo, en su estado natural,
rias es la biotecnología. Esta área tecnológica las células generalmente no producen cantida-
puede definirse como el uso de organismos o des elevadas de los compuestos útiles desde
sus componentes, con el fin de generar bienes el punto de vista industrial. Por este motivo es
y servicios. Todos los seres vivos tienen la ca- necesario modificar su metabolismo para que
pacidad de realizar transformaciones químicas adquieran tal capacidad, para que se convier-
debido a que poseen proteínas especializadas tan en fábricas químicas.
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Figura 1.
Herramientas teóricas y experimentales de la ingeniería
de vías metabólicas.
tiene como objetivo la modificación racional rosa pues permite determinar la mayoría de los
de las propiedades de una proteína, tomando flujos metabólicos intracelulares. Sin embargo
como base la información funcional y estruc- requiere de equipos costosos y cálculos muy
tural. La ingeniería de proteínas generalmente complejos. La determinación de flujos meta-
se aplica al mejoramiento de enzimas. Entre las bólicos se basa en el uso de moléculas de azú-
mejoras que se realizan a este tipo de proteí- cares en las cuales uno o varios de sus átomos
nas, se pueden citar: incrementar la actividad de carbono son el isótopo 13C. Los isótopos son
específica, cambiar la especificidad hacia nue- átomos de un elemento que difieren en el nú-
vos substratos, eliminar la inhibición alostérica, mero de neutrones en su núcleo. En el caso del
entre otros. carbono, el isótopo más abundante es el 12C.
El análisis de flujos metabólicos tiene como Utilizando técnicas analíticas es posible de-
objetivo determinar la distribución y la mag- terminar si una molécula contiene átomos del
nitud de los flujos de materia y energía en la isótopo 12C o 13C. En este tipo de experimentos,
célula (Stephanopoulos et al., 1999). Este tipo generalmente se utiliza glucosa marcada. La
de estudios es posible debido a que se cono- glucosa es alimentada en un cultivo bacteriano
ce prácticamente la totalidad de las reacciones y, como resultado del metabolismo, sus átomos
químicas que constituyen el metabolismo de de carbono terminan formando parte de la ma-
E. coli. Se sabe que en el metabolismo de esta yoría de los componentes celulares. Utilizando
bacteria participan aproximadamente 994 en- métodos analíticos, es posible determinar la
zimas y 794 metabolitos. En esta red metabó- posición de los átomos de 13C en un gran nú-
lica algunas reacciones siempre están activas mero de moléculas en la célula. Con esta infor-
y otras se inducen o reprimen dependiendo de mación y el conocimiento de la estequiometría
las condiciones donde se encuentre la bacteria. en la red metabólica del organismo, es posible
La complejidad del metabolismo ha generado calcular los flujos internos en la célula (Flores
la necesidad del desarrollo de métodos de es- et al., 2002).
tudio especiales, basados en enfoques teóricos El objetivo del análisis de control metabólico
y experimentales. Uno de estos métodos es el (ACM) es definir la relación cuantitativa de una
diseño de modelos del metabolismo celular in reacción enzimática sobre el flujo en una vía
silico, es decir, simulados en una computado- metabólica completa. Cuando se desea modifi-
ra. En esta área se fusionan la informática y la car el metabolismo de un microorganismo, una
bioquímica. Ahora es posible simular, median- de las principales preguntas es: ¿cuál o cuáles
te algoritmos implementados en programas de de las actividades enzimáticas deberán ser mo-
computadora, los flujos en las reacciones me- dificadas para lograr un efecto específico? No es
tabólicas de una bacteria. Así se pueden calcu- sencillo encontrar la respuesta a esta pregunta,
lar los efectos sobre esta distribución de flujos principalmente debido a la gran complejidad del
por cambios en la composición de nutrientes, metabolismo celular. El ACM es la principal he-
o la ausencia de una o varias enzimas. Este tipo rramienta que permite identificar las enzimas
de estudios ha sido muy valioso para ayudar a clave dentro de vías metabólicas específicas. La
entender cuáles son los límites teóricos en la relación entre una actividad enzimática y el flujo
capacidad de producción de algunos metaboli- metabólico se expresa como un coeficiente de
tos y cuáles son las distribuciones de flujos que control de flujo (CCF). El CCF se define como el
permiten llegar a dicho resultado. cambio en el flujo en una vía metabólica que re-
La determinación de flujos metabólicos en sulta al incrementar la actividad de una enzima
una célula viva es otra aproximación al estudio en particular. La determinación de los CCF para
del metabolismo celular. Esta metodología se las enzimas dentro de una vía metabólica espe-
basa en la utilización de moléculas marcadas cífica, permite establecer cuáles de ellas son las
con isótopos. Esta metodología es muy pode- que limitan el flujo. Una vez que se identifican
las enzimas limitantes, mediante la aplicación to de generar una cepa de producción mediante
de la ingeniería genética se puede incrementar la aplicación de la IVM. A continuación se presen-
el nivel de expresión de sus genes y por conse- tarán ejemplos de cómo se aplican estas estrate-
cuencia la actividad específica. gias para el desarrollo de cepas de E. coli produc-
toras de compuestos aromáticos y etanol.
Siguiendo esta estrategia, se han construi- se pueden obtener mediante síntesis química a
do cepas de E. coli con la capacidad de producir partir de L-dihidroxifenilalanina (L-dopa) u otras
directamente a partir de glucosa: ácido quínico, moléculas químicamente similares. La extrac-
catecol, melanina e índigo. Algunas cepas mo- ción de melanina a partir de tejidos animales
dificadas pueden producir precursores, los cua- presenta el problema de un bajo rendimiento
les, mediante transformaciones químicas, dan y, sobretodo, de variabilidad en la composición
lugar a los compuestos: hidroquinona, benzo- química del producto. En el caso de la extracción
quinona, ácido adípico, aspartamo, benzocaína, a partir de cultivos de cepas naturales produc-
ácido gálico y pirogalol (LaDuca et al., 1999). toras de melaninas, el problema principal es el
Varios de estos productos son sintetizados ac- bajo rendimiento. Finalmente, la producción de
tualmente usando al petróleo como materia melaninas por medio de síntesis química es un
prima. Al contar ahora con cepas bacterianas proceso costoso debido al bajo rendimiento du-
capaces de producirlos a partir de glucosa, se rante la síntesis de los precursores empleados.
abre la posibilidad de desarrollar tecnologías Debido a las limitaciones de los métodos
biológicas sustentables no contaminantes. descritos anteriormente, existe el interés en el
En bacterias como E. coli, el repertorio meta- desarrollo de cepas microbianas modificadas
bólico de compuestos derivados de la vía aromá- que permitan la síntesis de melanina química-
tica es limitado. Sin embargo, si se considera la mente homogénea y con un nivel de produc-
totalidad de los organismos que poseen esta vía, ción elevado. Los procesos desarrollados a par-
es posible observar la gran diversidad en com- tir de estas nuevas cepas han tenido un éxito
puestos que se derivan de la misma. Además limitado debido a que estas cepas no han sido
del papel que estos compuestos juegan dentro modificadas para sobreproducir compuestos
del metabolismo primario del organismo, se aromáticos. Además, se han utilizado genes
han identificado funciones de protección contra que codifican para tirosinasa provenientes de
competidores, patógenos o depredadores, así hongos, los cuales no se expresan adecuada-
como una función estructural en plantas (ligni- mente en E. coli.
na). Entre los compuestos aromáticos con un pa- Tomando en cuenta estos antecedentes, se
pel protector se encuentran las melaninas. Estos decidió trabajar en el desarrollo de cepas de E.
son pigmentos que se han identificado en orga- coli con una alta capacidad de producción de
nismos desde bacterias hasta el hombre. Exis- melanina. Esta bacteria carece de la capacidad
ten varios tipos de melaninas, uno de ellos, las natural para sintetizar este polímero; sin em-
eumelaninas, provienen de la transformación de bargo, existen otras bacterias que sí pueden
la tirosina por medio de la acción de la enzima hacerlo. Considerando lo anterior, se decidió
tirosinasa (Cabrera-Valladares et al., 2006). La eu- utilizar las técnicas de ingeniería genética para
melanina es un polímero aromático; una de sus transferir de alguna de estas bacterias a E. coli
principales características es el amplio rango de el gene que codifica para una tirosinasa. De las
absorción dentro del espectro electromagnético. bacterias que se sabe pueden producir melani-
Durante los últimos años ha crecido el interés na, se eligió a Rhizobium etli como organismo
en este tipo de polímeros, debido a que se han donador del gene de la tirosinasa. R. etli es una
identificado algunas propiedades fisicoquímicas bacteria del suelo que se asocia con las plantas
importantes. Se sabe que la melanina puede ac- de frijol para ayudarles a fijar nitrógeno y con
tuar como fotoprotector, intercambiador catió- esto mejorar su capacidad de crecimiento. Con
nico, agente quelante, semiconductor amorfo, y base en la información sobre el genoma de esta
posee actividades antioxidantes y antivirales. bacteria, se diseñó una estrategia para aislar el
Las melaninas se pueden obtener mediante gene melA que contiene la información para la
extracción a partir de tejidos animales o a par- síntesis de la enzima tirosinasa. El gene melA
tir de cultivos de bacterias u hongos. También fue aislado e introducido a la bacteria E. coli. La
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Figura 2.
Compuestos aromáticos sintetizados por Escherichia coli
mediante la introducción de genes de otras especies mi-
crobianas. El nombre de los genes introducidos y el orga-
nismo del que provienen están indicados en las flechas
que dan lugar a cada compuesto.
expresión de este gene en la bacteria permitió tibles fósiles tienen una disponibilidad finita
la generación de una cepa recombinante de E. y, dado el extensivo uso que actualmente se
coli que adquirió la capacidad de sintetizar me- hace de ellos, se agotarán en el presente siglo.
lanina a partir de tirosina (Cabrera-Valladares et El etanol carburante se produce mediante tec-
al., 2006) (figura 3). Con esta cepa recombinan- nologías biológicas a partir de material reno-
te de E. coli se desarrolló un proceso fermen- vable, no es contaminante como el petróleo,
tativo con el cual se logró producir hasta 6 g/l su uso no incrementa la concentración neta
de melanina en la escalas de 1, 10 y 100 litros de bióxido de carbono en la atmósfera. Por
(Lagunas-Muñoz et al., 2006). tanto, el uso del etanol carburante no propi-
A la fecha, nuestro grupo de investigación cia el incremento de temperatura ni el cambio
continúa mejorando la producción de melani- climático en el planeta. Actualmente existen
na a partir de células completas de E. coli. Sin tecnologías consolidadas y bien desarrolladas
duda uno de los principales retos es producir para producir etanol carburante. Dichas tec-
el pigmento a partir de fuentes de carbono de nologías utilizan como fuente de carbono a la
menor precio que la tirosina. Esto se puede lo- sacarosa proveniente de la caña de azúcar, en
grar manipulando el metabolismo central del Brasil, y a la glucosa proveniente del almidón
carbono, es decir, canalizando la glucosa hacia de maíz. en EE.UU. México no es autosuficien-
la formación de los precursores de los aminoá- te en la producción de maíz, es más, se impor-
cidos aromáticos (fosfoenol piruvato y eritrosa- tan más de ocho millones de toneladas al año
4-fostato) y eliminando la regulación de la vía de este grano para satisfacer las necesidades
de producción de tirosina. En trabajos previos directas de alimentación de la población, o in-
hemos utilizado estrategias similares para directas a través de la engorda de ganado para
maximizar la producción de fenilalanina (Báez consumo humano. Entonces esta materia pri-
et al., 2004). Sin embargo, acoplar la producción ma no es viable para la producción de etanol
de melanina a la generación de tirosina requeri- carburante. Por otro lado, aún cuando México
rá de la aplicación de estrategias novedosas de produce excedentes de sacarosa y los exporta,
la ingeniería de vías metabólicas para lograr un este azúcar proveniente de la caña de azúcar
proceso de alto rendimiento. Aunado a esto, el tampoco es una materia prima viable para pro-
desarrollo de estos catalizadores nos proveerá ducir etanol. Las razones no son tecnológicas
del conocimiento necesario para producir me- sino económicas: tales excedentes no satisfa-
laninas de diversos colores, que tienen diferen- cen los altos volúmenes requeridos para que el
tes propiedades y aplicaciones en campos tan etanol sea empleado como energético, el costo
diversos como el de salud, cosmetología, bioló- del etanol de sacarosa nacional (la más costo-
gicos, de barnices y pinturas, de síntesis quími- sa del mundo) es mayor comparado con el de
ca y fabricación de polímeros conductores de la gasolina (Martínez et al., 2006).
electricidad, entre otros. Por su abundancia y capacidad de reno-
vación sustentable, las materias primas más
viables para la producción de biocombusti-
Síntesis en E. coli de compuestos de bles resultan ser los azúcares presentes en los
fermentación con aplicación industrial residuos agroindustriales (la lignocelulosa o
mediante la introducción de genes biomasa), siendo su bajo o nulo costo otro fac-
heterólogos (caso etanol carburante tor que favorece su uso. Los residuos de la in-
a partir de residuos agroindustriales) dustria azucarera, y potencialmente cualquier
El etanol anhidro o etanol carburante es un ex- residuo agroindustrial, son sustratos más eco-
celente combustible que, además, puede usar- nómicos, pero más complejos que la glucosa y
se como oxigenante de combustibles fósiles, o la sacarosa, y pueden ser convertidos en pro-
bien como sustituto de gasolina. Los combus- ductos útiles mediante procesos de fermenta-
Figura 3.
Lado izquierdo de la caja: cepa de E. coli silvestre (no pro-
ductora de melanina). Lado derecho: cepa de E. coli modi-
ficada por técnicas de ingeniería metabólica para producir
melanina.
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Figura 4.
Esquema metabólico ideal para la producción de etanol a
partir de glucosa y xilosa en cepas etanologénicas de E. coli.
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