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03 Curva Estandar de Proteínas PDF
03 Curva Estandar de Proteínas PDF
PROTEÍNAS
Objetivos
Desarrollar y analizar una curva estándar.
Determinar la concentración de albúmina en la clara de huevo por el
método de Lowry.
Antecedentes académicos
Espectrofotometría.
Ley de Lambert y Beer
Curvas de calibrado o curvas estándar.
Fundamento del método de Lowry.
Introducción
El adecuado diseño y análisis de una curva estándar es una herramienta
indispensable en el trabajo de laboratorio para la determinación cuantitativa
de una sustancia.
Entre las determinaciones de curva estándar más utilizadas se encuentran
aquellas que proporcionan un resultado colorido proporcional a la sustancia
que se desea cuantificar. Con este método fisicoquímico basado en la
medición de la absorción de la energía radiante, el analista medirá la
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l. Espectrofotometría
La espectrofotometría es un método de análisis óptico frecuentemente
usado en análisis químicos para determinar la cantidad de luz absorbida o
transmitida por una solución, y debido a que en el caso de las curvas
estándar, ésta es proporcional a la concentración presente, puede indicarnos
la concentración exacta al compararla con una solución de concentración
conocida. Cabe mencionar que el método espectrofotométrico recibe el
nombre según sea la radiación utilizada, como espectrofotometría de
absorción visible (colorimetría), ultravioleta o infrarroja.
a) Espectrofotometría de absorción
La espectrofotometría de absorción se basa en la capacidad que poseen
algunas sustancias homogéneas de absorber parte de la energía y transmitir
el resto cuando un haz de energía radiante monocromática incide sobre ella.
Para familiarizarse con la técnica, a continuación se presentan algunas
definiciones útiles:
• Absorbancia (A): es el logaritmo en base 10 del recíproco de la
transmitancia (T), en el que el disolvente puro es el material de
referencia, esto es:
A= log10/T = -log10T
• Absortividad (a): es la relación entre la absorbancia y el producto de la
longitud del paso óptico (b) normalmente expresada en centímetros,
por la concentración (c). Es decir:
a = A/bc A = abc
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Bioquímica Celular y de los Tejidos I
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Material y Equipo
• Probetas graduadas de 25mL
• Vasos de precipitados de 50mL
• Vasos de precipitados de 100mL
• Vasos de precipitados de 25mL
• Matraz aforado de 10mL
• 1 desyemador
• Pipeta graduada de 1mL
• Tubos de ensayo de 13 X 100
• Marcador indeleble de punta extrafina
• Gradilla
• Micropipetas. p200, p1000 y p5000 µL
• Puntas nuevas y limpias para las micropipetas
• Hojas de papel milimétrico.
• Celdas de espectrofotómetro.
Reactivos
− Reactivo 1: Na2CO2 al 2% p/v, en NaOH al 0.1 N.
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Método
1. Para realizar la curva estándar y la determinación de la calidad de proteína
contenida en la dilución de la clara de huevo, preparar 8 tubos (tabla 1) y
agregar los volúmenes indicados de los reactivos.
Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 7
Solución problema - ? ? ? - - - -
de proteínas (mL)
Solución patrón - - - - 0.1 0.2 0.4 0.8
de proteínas (mL)
H2O destilada 2.0 ? ? ? 1.9 1.8 1.6 1.2
Reactivo 3 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agitar y dejar reposar 10 min.
Reactivo 4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Agitar inmediatamente y dejar reposar 20 min.
Medir absorbancia a 640 nm.
Curva Estándar de Proteínas.
Resultados
Con los resultados de los tubos 4, 5, 6 y 7 elaborar en una hoja de
papel milimétrico la curva estándar, en la cual se graficará absorbancia
contra concentración de albúmina.
Interpolar las absorbancias de los tubos problema (albúmina de clara
de huevo).
Tomar en cuenta las diluciones de la muestra para determinar la
concentración de albúmina en 100 mL de clara de huevo y comparar
con la concentración teórica.
Cuestionarios
1. ¿Cuál es el fundamento del método de Lowry?
2. ¿Cuál es la concentración teórica de albúmina en la clara de huevo?
3. Que diluciones se tienen que hacer a una solución de 10g/100 mL
para obtener una concentración de 10 mg/100 mL.
4. ¿En una curva estándar, se debe tener un volumen final igual en
todos los tubos? ¿Por qué?
Referencias
1. Aguilar-Santelises L, García-del Valle A, Corona-Ortega MT, Rangel-
Corona R, Cruz-Millán M. Antología del laboratorio de Bioquímica
Celular y de los Tejidos I (complemento). Material en CD e impreso.
México: FES Zaragoza; 2007.
2. Ayres G. Análisis químico cuantitativo. México: HARLA; 1970.
3. Bender GT. Métodos instrumentales de análisis en química clínica.
España: Editorial Acribia; 1992.
4. Castaño F. Espectroscopía UV y visible. España: Alhambra; 1970.
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