ELECTROFORESIS DE

DIGERIDOS CON ENZIMAS

DE RESTRICCION

ADRIANA MARIA GIL ZAPATA

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
ENZIMAS DE RESTRICCIÒN
 SECUENCIAS
PALINDRÓMICAS

EcoRI 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5 ’

hidroliza los enlaces fosfodiéster

que unen las bases G y A de cada
hebra, de este modo los cortes
que crea son escalonados y dan
lugar a la formación de fragmentos
de ADN cuyos extremos tienen una
corta región monocatenaria que
resultará complementaria a las de
los otros fragmentos.
 Polimorfismos de longitud de
Fragmentos de Restriccion (RFLP„s)
ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO I

Una sola enzima (multimérica que posee

3 subunidades) reconoce la secuencia
específica de ADN, metila y restringe.
Pero la restricción no ocurre en el sitio de
reconocimiento, sino que es al azar y en
sitios distantes al de reconocimiento.
ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO II

La restricción ocurre en el sitio de

reconocimiento. Estas enzimas tipo II
son las utilizadas en genética molecular
puesto que permiten romper el ADN en
sitios específicos, y así, recuperar
secuencias conocidas.
ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO II
ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO III

Es similar al sistema tipo I, utilizan

una enzima oligomérica que realiza
todas las actividades enzimáticas, y
rompen el DNA 25-27 bp, más allá
del sitio de reconocimiento.
ENZIMAS DE RESTRICCION
 Una unidad de enzima se define como la
cantidad de la misma que se necesita para
cortar 1µg de DNA en 1 hora.

 Se han identificado más de 200

endonucleasas de restricción.
http://www.neb.com/nebecomm/products/category
1.asp
ENZIMAS DE RESTRICCION
 Las enzimas tipo II, dependiendo de
su especificidad, al romper el ADN
provocan 2 tipos de cortes:
 A. Cortes pegajosos, dejando
productos con extremos
complementarios (cohesivos) Ej: Eco
RI y Pst I.
 B. Cortes Romos
(Desoxinucleotidil transferasa
terminal).
ENZIMAS DE RESTRICCION
EXTREMOS PEGAJOSOS O
COHESIVOS
EXTREMOS ROMOS
CORTES ENZIMAS DE
RESTRICCION
APLICACIONES ENZIMAS DE
RESTRICCION
 Hacer mapa de restricción de un plásmido o
bacteriófago.

 Fragmentar DNA genómico para separación de

electroforesis y “Southern Blot”.

 Generación de fragmentos para ser usados

como sondas marcadas en “Southern”y
“Northern” blotting.

 Generación de fragmentos para ser

subclonados en los vectores apropiados,
creación de DNA recombinante.
 APLICACIONES ENZIMAS DE
RESTRICCION
 Desarrollo ADN Recombinante y
biotecnologia.
 Mecanismos de regulación y expresión
génica.
 Mapeo y cartografía de genes.
 Diagnostico enfermedades geneticas con
cambio en la secuencia de ADN.
 Desarrollo proteínas recombinantes.
APLICACIONES
DE LA GENÉTICA
MOLECULAR

ENZIMAS
DE
RESTRICCIÓN
APLICACIONES DE LA GENÉTICA
MOLECULAR

ENFERMEDAD GÉNICA
GANANCIA O PÉRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIÓN
Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción
Enzima de Secuencia de
Polimorfismo
restricción Reconocimiento
1711C>T HhaI 5- GCG^C- 3
3- C^GCG- 5

1711C>T
Reactivo / Polimorfismo
(A486V) Separaración:
H20 bidestilada 2,825 µl Gel de agarosa al 3%
Buffer 10X 1 µl
Visualización:
BSA Acetylated 100
0,1 µl Bromuro de Etidio
µg/µl
Enzima de restricción 10
HhaI 1 U
U/µl
Amplificado 6 µl
Volumen final 10 µl
Incubación a 37°C 4 horas
 P 1711C>T Electroforesis
Tamaño del Tamaño del
Enzima de
Polimorfismo Amplificado Genotipo Producto de
Restricción
(bp) Restricción (bp)
TT 185
1711C>T 185 HhaI CC 161 / 24
CT 161 / 24 - 185
PCR ANGIOTENSINOGENO
AGT
 H20: 1 0 ul
 Buffer: 5.0 ul
 MgCl2 : 6.0 ul
 dNTPs: 4.0 ul
 Primers: 6.4/6.4ul
 Taq: 0.2 ul
_________
38 ul + 12 ul ADN.
 DIGESTICON CON LA
ENZIMA NcoI
C CATG G
Descriptin
G GTAC C

Features
•Blue/White Cloning Qualified: Promega's blue/white
cloning assay provides a higher level of quality control for
enzymes used in cloning applications.

Protocol Restriction Enzyme Usage Information.

Storage Store at –20 C.

Conditions
Storage 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM
Buffer DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol.
Source Nocardia corallina.

Incubatin Buffer D. 37 C.
Conditions
 A B C D MULTI-CORE™
Percent
Activity in 50–75% 75–100% 75–100% 100% 75–100%
4-CORE®
Buffer
System

Frequency
of Cutting λ Ad-2 ΦX174 pUC18 M13mp18 pBR322

4 20 0 0 0 0

Notes For site-specific methylation information, consult McClelland, M.,

Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640–59.
PROTOCOLO DIGESTION NcoI

 Enzima: 0,2 ul
 Bufffer : 0,5 ul
 H 20 : 4,3 ul
________
5,0 ul + 15ul Amplificado
Llevar a 37°C.
ELECTROFORESIS
 METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

CAMARA DE ELECTROFORESIS
GEL DE AGAROSA
ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAR

EQUIPO ABI PRISM 310

 ELECTROFORESIS

Técnica en la cual una partícula cargada se hace

desplazar a través de un medio aplicando un
campo eléctrico.

La velocidad de migración es función de la

densidad de carga y ésta a su vez es función
de una serie de parámetros que marcan las
condiciones experimentales como: pH, fuerza
iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
 MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL
CAMPO ELECTRICO

Catión ( carga + ) Migra al polo negativo. CATODO

Anión ( carga - ) Migra al polo positivo. ANODO

La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la

partícula cargada, es proporcional a la carga de la
partícula y al voltaje del campo eléctrico
aplicado.

F = Q X V
 MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO
ELECTRICO

Otra fuerza se opone al movimiento de la partícula

y es proporcional al tamaño y la forma de ella y a
la viscosidad del buffer.
Fr = F X V
Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula
empieza a migrar y hace que alcance una
velocidad constante.
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE
LAS PARTICULAS

Carga neta de la partícula: Efecto del pH

del tampón.
Cuando las partículas se colocan en un
campo eléctrico, estas migrarán hacia el
ánodo o el cátodo en función de la carga
neta que posean y ésta depende del pH de
la solución en que se encuentran.
 FACTORES QUE AFECTAN LA
MIGRACION DE LAS PARTICULAS

Tamaño y Forma de la partícula:

Según el tipo de electroforesis, el tamaño y la
forma de la partícula pueden tener mayor o
menor importancia.
Cuando se emplean soportes que permiten el
paso selectivo de moléculas, según el tamaño,
retienen las grandes y dejan pasar las más
pequeñas.
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE
LAS PARTICULAS

Fuerza iónica del tampón:

En la electroforesis, la corriente es llevada por
los iones presentes, tanto del tampón como
de las partículas en solución, por tanto
cuanto más concentrado es el tampón, mayor
la proporción de corriente que transportan,
menor la migración de las partículas y peor la
separación.
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE
LAS PARTICULAS

Potencial del campo eléctrico:

A mayor potencial del campo eléctrico mayor
velocidad de la partícula.
Según el método electroforético se elige trabajar
manteniendo constante el V o A.
Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de
separación, pero también la temperatura aparecen
efectos indeseables como: desnaturalización de pr,
evaporación del buffer, aumento de la fuerza iónica.
 TIPOS DE SOPORTES

El procedimiento electroforético se lleva a

cabo sobre dos soportes::

1. Soportes No Restrictivos:
Las partículas colocadas sobre ellos, se
separan únicamente en función de su carga
eléctrica. Los principales soportes son:
Papel – Acetato de Celulosa – Agarosa
TIPOS DE SOPORTES

2. Soportes Restrictivos:
El soporte ejerce algún tipo de resistencia al
desplazamiento de las moléculas de la muestra. La
resistencia estará dada por el tamaño del poro del
soporte y por el tamaño y características de las
moléculas que deben desplazarse sobre el soporte.
Los principales tipos de soportes son:
Geles de Almidón – Geles de Poliacrilamida
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
AGAROSA:
Es uno de los componentes del agar. Se
prepara como un gel de concentración entre
0.5 – 2 gr %. El tamaño del poro es grande
y permite el paso de moléculas de peso
molecular relativamente alto, por lo cual
migran tan solo en función de su carga. Su
aspecto claro y transparente facilita la
cuantificación por densitometría.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

POLIACRILAMIDA
Se forman por polimerización de la acrilamida con un
agente enlazante. El tamaño del poro varía, según la
concentración de la acrilamida y las moléculas puedan
ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaños.
Soporte ideal para obtener mayor y mejor número de
separaciones electroforéticas. Se puede leer por
densitometría.
Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
 Fragmentos obtenidos de la
digestión de AGT con la enzima NcoI
El fragmento del amplificado de AGT sin
digerir pesa: 303 pb
T: 303 pb
M: 211 pb + 92pb

El polimorfismo: T174M
Resultado de la electroforesis:
TT 0.83, TM 0.15, MM 0.02
 ELECTROFORESIS CAPILAR

POLIMERO POP 4
Soporte restrictivo que permite la separación de
moléculas de ADN desde un par de bases en
adelante.
Se deposita en un capilar de 1 mm de diámetro y
este se introduce en un equipo automatizado que
posee una placa de calentamiento y un laser que
detecta la señal de los fluorocromos.
ABI PRISM 310
ABI PRISM 310
FLUOROCROMOS
 REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS

Obtención de la Montaje de la
Muestra jeringa

Montaje de la muestra

Electroforesis capilar

Detección por el laser

Lectura de
electroferogramas
ELECTROFEROGRAMA
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
LADDER ALÉLICO
PERFIL GENÉTICO