INDUSTRIA CARNICA I

Estudiantes: Coyago Mayra – Maldonado Natali – Reinoso Oscar

Fecha: 21-10-2019

Docente: Ing. Galo Salazar

Tema: Microscale electrodes integrated on COP for real sample Campylobacter spp.
detection (Microscale integrados en COP para la detección de Muestras reales
Campylobacter spp)

RESUMEN

Campylobacter spp. son las responsables de enfermedades bacterianas agudas en

humanos en todo el mundo, son unas de las principales causantes de la diarrea y de las
enfermedades que se transmiten a través de los alimentos ("intoxicaciones alimentarias")
Pueden infectar el tubo digestivo y provocar diarrea, fiebre y retortijones abdominales,
por lo tanto, es necesario implantar métodos de fácil aplicación e interpretación para la
detección de los patógenos que las causan. En este artículo, se fabricó el primer
genosensor electroquímico basado en electrodos de oro de película delgada depositados
en sustratos de polímero de olefina de ciclo (COP) para la detección de Campylobacter
spp en matrices alimentarias, específicamente en muestras de carne cruda de aves de
corral.
El presente articulo se eligió con la finalidad de generar conocimiento acerca de las
condiciones responsables de enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos, y en
especial del campylobacter, conocer sus efectos y una manera de poder detectarlo en los
alimentos.

INTRODUCCIÓN

La alimentación es un aspecto relevante de la salud pública mundial porque desempeña

un papel vital en el mantenimiento de una salud adecuada, pero también causa
enfermedades importantes en el ser humano. En 2010, la Autoridad Europea de Seguridad
Alimentaria (EFSA) estimó que en Europa se notificaron un total de 212,064 casos de
Campylobacter en humanos lo que implica un costo para los sistemas de salud pública de
2.400 millones de euros. La Campylobacter, que puede causar diarrea y fiebre, se
encontró principalmente en la carne cruda de aves de corral. En los países en desarrollo,
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se estima que entre el 40 y el 60% de los niños menores de 5 años desarrollarán al menos
una infección sintomática, que generalmente ocurre durante el primer año de vida. El
aislamiento de Campylobacter spp. es difícil porque las bacterias generalmente están
presentes en muy pocos números. Por esta razón, no hay biosensores comerciales
disponibles para detectar Campylobacter spp en matrices alimentarias y se pueden
encontrar muy pocos informes en la literatura (Yang et al., 2013).
los biosensores electroquímicos de ADN son más rápidos, más simples y más baratos que
los métodos de diagnóstico tradicionales. El ADN tiolado (compuesto que contiene el
grupo funcional formado por un átomo de azufre y un átomo de hidrógeno) se puede
ordenar bien sobre una superficie de oro mediante el uso de moléculas espaciadoras entre
el ADN y el resto tiol (Paleček y Bartošík, 2012). Los electrodos de microescala permiten
relaciones de alta densidad de corriente, pequeños volúmenes y la ausencia de electrolitos
de soporte, velocidades de transporte de masa rápidas y respuesta en estado estacionario.
Las ventajas de estos sistemas miniaturizados (bio) incluyen la reducción del volumen de
muestra y reactivos, facilidad de detección, manejo mínimo de materiales peligrosos y
detección de muestras múltiples paralelas (Medina-Sanchez et al., 2012.)
En la mayoría de los casos, el polimetilmetacrilato (PMMA) se usa como modelo
prototipo. Sin embargo, por consideraciones de mercado, el PMMA presenta una calidad
muy frágil, se disuelve fácilmente en solventes orgánicos y la temperatura de operación
se limita a solo 50 ° C. Para fines biológicos, otros polímeros técnicos como el COP y el
copolímero de cicloolefina (COC) (Niles y Coassin, 2008) pueden actuar como mejores
plataformas poliméricas debido a sus propiedades ópticas favorables, bajos niveles de
impurezas, alta temperatura de transición vítrea (Tg), moldeabilidad y baja absorción de
agua (Lee et al., 2008).

En este artículo, el componente de biosensores de un microdispositivo de detección

completo aplicado a la detección de Campylobacter spp. en la carne se describe. El
método analítico se basa en la deposición de electrodos de oro basados en película delgada
a microescala sobre sustratos de COP y la posterior modificación de la superficie con una
sonda de tiolado de ADN.

MATERIALES Y MÉTODOS
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Productos químicos y reactivos

Tris(hidroximetil)aminometano (Tris-base), ácido etilendia-minetetraacético (EDTA),

ortofosfato de hidrógeno sódico, ortofosfato de dihidrógeno sódico, hidróxido de sodio,
ácido acético glacial, bromofenol, xileno cianol FF, sacarosa, agarosa, Nancy-520, ácido
sulfúrico (H2SO4), agua libre de pirógenos, ferricianuro de potasio [K3Fe(CN)6] y
Mercaptohexanol fueron comprados a Sigma-Aldrich. La acetona 99,5% y el etanol
99,5% fueron suministrados por Pan-reac. El agua ultrapura de resistividad de 18,2 M se
obtuvo de un sistema de agua Milli-Q (Millipore Corp).

Instrumentación

Los experimentos CV y SWV fueron monitoreados con el CH Potenciostato 1040B de

los instrumentos que utiliza la versión de software de la CE a temperatura ambiente. Los
espectros FT-IR se midieron en un espectrómetro Perkin-El-mer Spectrum 100. La
espectroscopia UV/Vis se midió en un espectrofotómetro Biotek Eon utilizando Take3
micro-vo- placa de lumen para 2 muestras de μL. Para la amplificación de PCR se utilizó
un Mastercycler Personal de Eppendorf con tapa calentada. La estructura cristalográfica
de las películas Au depositadas en la plataforma de plástico fue analizada por difracción
de rayos X (XRD) por medio de un difractómetro Philips XPERT MRD en una
configuración de ángulo de inclinación configuración (Cu K-1-1/41.54059 o). Se empleó
un microscopio de fuerza atómica JPK NanoWizard en el modo de contacto intermitente
utilizando una punta de silicio con una constante de fuerza de 40 N m 1 y una frecuencia
resonante de aproximadamente 300 kHz para estudiar la topografía de los materiales
probados.

Imprimaciones PCR

Para detectar el género Campylobacter se descargó una secuencia basada en la secuencia

del gen flagellin (flaA) (pb: 1269232-1270950) con el número de acceso: NC_002163. 1
de Genbank en el. Formato FASTA. Los sitios de restricción y digestión se simularon
utilizando el software UGENE. Se seleccionó un fragmento de 300 bp y conjuntos de
imprimaciones several de alrededor de 25 de longitud base utilizando el software Primer-
Blast (NCBI) de acuerdo con el software normas generales de diseño de imprimación
(contenido de G/C entre 50–60% y Tm de unos 60oC). Antes de determinar las
imprimaciones se realizó una alineación con el programa BLAST (NCBI) con el finde
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descartar la secuencia de imprimación alineada con otrasbacterias. Los imprimadores

fueron sintetizados por Sigma-Aldrich y nombrado como
AAGGCGGCTATGGCTGCTGTTGATGATGGA y inversamente
TGCACTCTCGGCTGCTCAAAGTCTCT.

RESULTADOS

Bacteria: Campylobacter
Campylobacter se pueden encontrar en cualquier lugar y comúnmente se pueden encontrar en el tracto
intestinal de gatos, perros, aves, ganado vacuno, ganado porcino, roedores, monos, aves silvestres y en
algunos humanos. Y se puede transmitir consumiendo leche sin pasteurizar, carnes o aves crudas o no
cocidas completamente, u otros alimentos y agua contaminados y por contacto con las heces de
animales infectados.
Método utilizado antes Método utilizado hoy en dia
los medios de cultivo clásicos y las técnicas de Actualmente los biosensores están empezando a
biología molecular son los métodos tradicionales desempeñar un papel interesante en el
para el diagnóstico en los alimentos diagnóstico. En particular, los biosensores
electroquímicos de ADN son más rápidos,
sencillos y baratos

Desventajas del método de análisis Ventajas del método de análisis

Método caro
Se necesita varias muestras
Se requiere de gran tiempo para análisis
Las ventajas de estos sistemas miniaturizados
(bio) incluyen la reducción del volumen de
muestras y reactivos, la facilidad de detección, el
manejo mínimo de materiales peligrosos y la
detección paralela de múltiples muestras

El biosensor

El biosensor ha sido probado en muestras reales al inocular la célula de Campylobacter

en un trozo de pollo. Después de 48 h de enriquecimiento se tomaron dos muestras. Una
de las partes se rascó desde la superficie (S3) y la otra parte se molió en un mortero (S4).
Después de la adición de 10 ml de PBS, 0,57 g de acetato de sodio, 1 ml de tolueno, 5 ml
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de EDTA y 1 ml de SDS al 10%, la mezcla resultante se centrifugó durante 40 minutos a

la velocidad máxima (4400 rpm). El ADN (S3 y S4) se extrajo del sobrenadante usando
proteinasa K. Una porción de alimento se incubó sin contaminación como control
negativo (NC). La amplificación produjo una banda a 180 pb El producto amplificado se
desnaturalizó e hibridó con la sonda de inmovilización. Después de la amplificación, se
cuantificó la cantidad de Campylobacter utilizando una prueba de extracción. Los valores
obtenidos fueron 52 nM y 54 nM para S3 y S4, respectivamente. Campylobacter spp. se
detectó en 6 de las 9 muestras de pollo analizadas por el biosensor. Las muestras NC no
tienen ADN de Campylobacter pero otros compuestos en la muestra presentan un
aumento significativo en la corriente cuando se comparan los valores con el producto de
PCR 0 nM. Para S3 y S4, los resultados fueron consistentes con la curva de sensibilidad,
aunque los valores actuales obtenidos son más bajos de lo esperado para la cantidad de
ADN calculada. Usando este genosensor, los valores obtenidos para S3 y S4 se pueden
distinguir perfectamente del NC, lo que confirma la positividad de las muestras. La
comparación del resultado indica que se está detectando el ADN de una muestra real pero
10 veces menos que el ADN de las muestras de PCR. Sin embargo, el principio de
funcionamiento del biosensor implica que el paso previo a la detección es el proceso de
PCR y toda la mezcla de amplificación se transferirá a la muestra de detección. Por lo
tanto, se introducirá una cantidad mínima de 50 nM en todos los casos en la cámara de
detección. Por lo tanto, las muestras con valores actuales inferiores a 30 μA pueden
considerarse negativas. utilizando una sonda de ADN conjugada con fluoróforo para el
diagnóstico de muestras de carne. Las diferencias pueden explicarse porque el biosensor
utiliza una detección de fluorescencia para el análisis cuantitativo, que es un método más
sensible. Sin embargo, una mayor precisión, exactitud, rentabilidad y la posibilidad de
medir muestras turbias son las principales razones para usar el genosensor para
Campylobacter spp. Detección en muestras de carne cruda.

CONCLUSIONES

Se describe un proceso para fabricar un biosensor electroquímico sobre sustratos

poliméricos para la detección selectiva de Campylobacter spp en muestras de alimentos
reales. El dispositivo se basa en la deposición de microelectrodos de oro de película
delgada, cuyo procedimiento de fabricación se transfiere directamente de la tecnología
estándar de Microsystems
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La superficie del electrodo requiere activación electroquímica, lo que apunta el buen

rendimiento del dispositivo hacia los ácidos. Desde el punto de vista biológico, se ha
realizado la amplificación del ADN genómico bacteriano en poco tiempo y de una manera
muy específica. Los CV y SWV experimentales obtenidos antes y después de la
hibridación sugieren que el dispositivo presenta un alto potencial para integrar la
electroquímica y la microfluídica para el análisis de microorganismos en los alimentos y,
por lo tanto, las muestras con valores actuales inferiores a 30 μA pueden considerarse
negativas.

El desarrollo de este dispositivo basado en polímeros es el último paso para la fabricación

de un dispositivo microfluídico destinado a ser una herramienta de diagnóstico para el
uso rutinario en el sector alimentario. Hasta donde sabemos, no hay ejemplos de este tipo
de dispositivos diseñados para aumentar la integración de funciones en los chips en lugar
de realizar un solo paso en cada dispositivo. Esta complejidad del sistema es necesaria
para el diagnóstico de POC con alta sensibilidad y bajo tiempo de proceso en comparación
con los métodos de rutina.

BIBLIOGRAFÍA

 Financial support by the ETORTEK (IE13-360) program from the Ekonomiaren

Garapen eta Lehiakortasun Saila (Eusko Jaurlaritza) is gratefully acknowledged.
 Supplementary data associated with this article can be found in the online version
at http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2015.03.063.

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