Plant Biotechnology Journal ( 2016) 14, pp. 2190-2200 doi: 10.1111 / pbi.

12575

cadena de frío y vacuna de refuerzo cloroplasto-hecho libre de virus a la

inmunidad confieren contra diferentes serotipos de poliovirus

Hui-Ting Chan 1, Yuhong Xiao 1, William C. Weldon 2, Steven M. Oberste 2, Konstantin Chumakov 3 y Henry Daniell 1, *

1 Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina Dental de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, EE.UU.

2 Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE.UU.

3 Centro para la Evaluación e Investigación Biológica, Food and Drug Administration, Bethesda, MD, EE.UU.

Recibió el 16 de marzo de de 2016; 28 Resumen

revisada de abril de de 2016; aceptadas 5 de La OMS recomienda la retirada completa de la vacuna de la polio oral (OPV) tipo 2 antes de abril de 2.016 a nivel mundial y la sustitución con al
mayo de el 2016.
menos una dosis de la vacuna de poliovirus inactivado (IPV). Sin embargo, de alto costo, el suministro limitado de IPV, persistente circulante
* correspondencia ( Tel 215-746-2563; fax
transmisión poliovirus derivados de la vacuna y necesidad de refuerzos posteriores siguen sin resolverse. Para satisfacer esta necesidad crítica,
215-898-3695; correo electrónico: hdaniell @
una estrategia novedosa de una proteína viral 1 vacuna bajo costo frío libre de cadena producidos por plantas (VP1) subunidad oral de refuerzo
upenn.edu)
después se informó de una sola dosis de IPV. La optimización de codones del gen VP1 expresión potenciada por 50 veces en los cloroplastos.

Oral impulsar de VP1 expresa en células de plantas con adyuvantes derivados de las plantas tras una sola cebado con IPV significativamente

aumentaron VP1-IgG1 e VP1-IgA títulos cuando se compara con bajar IgG1 o títulos de IgA insignificantes con inyecciones de IPV. IgA juega un

papel fundamental en la erradicación de la polio debido a su transmisión a través de los sistemas de agua o alcantarillado contaminados. Títulos

de anticuerpos neutralizantes (~ 3.17 - 10.17 registro 2 titre) y la seropositividad (70 - 90%) contra todos los serotipos de poliovirus Sabin tres se

observó con dos dosis de IPV y de los refuerzos orales-celulares de la planta, pero de una sola dosis de IPV resultó en pobres neutralización.

células vegetales liofilizadas que expresan VP1 almacenado a temperatura ambiente mantienen ef e fi y plegado antígeno conservado / montaje

fi indefinidamente, eliminando de este modo la cadena de frío actualmente requerido para todas las vacunas. Se discute la sustitución de la OPV

con esta vacuna de refuerzo y los próximos pasos en la traducción clínica de antígenos y adyuvantes aprobados por la FDA.
palabras clave: enfermedades infecciosas humanas,

cultivo molecular, la transformación de cloroplastos,

bioencapsulación, entrega oral, inmunidad de la mucosa.

poliovirus mediante el mantenimiento de una adecuada inmunidad de la población (Bhasin,

Introducción
A pesar de su éxito, vacuna viva atenuada oral de poliovirus (OPV) y vacuna
antipoliomielítica inactivada (IPV) tiene una serie de deficiencias que los hace
menos que óptimo para su uso en el entorno posteradication (Mueller et al., 2005;
Racaniello,
2011). Sabin cepas utilizadas en OPV puede revertir a la virulencia por mutaciones
puntuales o recombinación con otros enterovirus (Burns
et al., 2014; Runckel et al., 2013), mientras que la IPV es caro, no induce inmunidad de la
mucosa adecuada (Onorato et al., 1991), requiere de almacenamiento / transporte en frío y
las inyecciones intramusculares. Se observó la inestabilidad genética de las cepas Sabin
hace varias décadas entre los casos de poliomielitis paralítica asociada a la vacuna en los
receptores de OPV en los EE.UU. y sus contactos cercanos (Alexander
et al., 2004; Schonberger et al., 1976). Brote en Haití y República Dominicana (Kew et
al., 2002) hace una década llevado al descubrimiento de poliovirus circulantes
derivados de la vacuna (VDPV) que causaron numerosos brotes de los tres
serotipos (Diop et al.,
2015; Lakhani y Bumb, 2014). Los pacientes inmunocomprometidos pueden ser
infectados crónicamente con el virus de la polio después de la vacunación con OPV
(Sutter y Prevots, 1994) y siguen excretan poliovirus virulentos durante años e incluso
décadas (Dunn et al.,
2015). La inevitabilidad con que VDPV virulenta emerge llevó la OMS para
proponer la retirada completa de VPO después de la circulación del poliovirus
salvaje se ha detenido, y sustituirlo por el uso global de IPV para prevenir la
re-emergencia de
2008).
Este escenario posteradication se complica por varios factores relacionados con las
propiedades del IPV. A pesar de que las personas inmunizadas con IPV están completamente
protegidos contra la parálisis, que podrían estar infectados con el virus de la polio y lo
transmiten a sus contactos. Además, el poliovirus pueden vivir en las heces de una persona
infectada durante muchas semanas y también puede contaminar los alimentos y el agua en
condiciones insalubres. Por lo tanto, los poliovirus virulentos pueden circular silenciosamente
en las comunidades inmunizados con IPV (Shulman et al.,
2014). Mientras que la inmunidad de las mucosas causadas por OPV es significativamente
más eficaz, que se desvanece rápidamente, pero puede ser impulsado por cualquiera de OPV
o IPV (Duintjer Tebbens et al., 2013). El suministro de costo y limitado de IPV ha llevado Grupo
Asesor Estratégico de Expertos (SAGE) para proponer que una sola dosis de IPV puede ser
utilizado en algunos países con el primer inmunidad de la población, a pesar de una dosis de
IPV tiene como resultado la seroconversión completa. Esto sugiere que existe una necesidad
de vacuna de refuerzo que podría ser utilizado en individuos inmunizados previamente para
inducir la respuesta anamnésica y estimular la inmunidad de la mucosa. Virus de la polio es un
virus intestinal transmitida de persona a persona a través de la boca y se multiplica en el
intestino. La superficie de la mucosa intestinal juega un papel fundamental durante la infección
por virus de la polio. Por lo tanto, la construcción de una especí patógeno-fi c mucosa
respuesta inmune localizada es importante que los anticuerpos generados pueden neutralizar
el virus antes de que pueda causar infección (Shakya et al., 2016).

2190 ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd.
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distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados.
 polio Plant-hecho confiere vacuna oral inmunidad 2191

vacunas de subunidades derivados de plantas son térmicamente estables y están

resultados
libres de contaminación con agentes patógenos de origen animal. También pueden
ser diseñados para contener múltiples antígenos y portadores transmucosa, para vectores cloroplasto VP1
proteger contra múltiples enfermedades infecciosas (en Albarrac et al., 2015; Chan y
Poliovirus proteína de la cápside viral 1 (VP1) es una de las proteínas estructurales de
Daniell, 2015). A la entrega oral, los fármacos de proteínas expresadas en células de
poliovirus y podría servir como un candidato a vacuna ideal. Por lo tanto, dos VP1
plantas están protegidas de ácidos y enzimas en el estómago por la pared celular
proteínas (nativo y de codones optimizados) deriva fromSabin 1 secuencias de
vegetal; cuando se fusiona con los fármacos de proteínas portadoras transmucosal
codificación fusedwith el portador transmucosal CTBwere expresado en tabaco y de
liberados en el lumen del intestino son fi eficientemente suministrada al sistema
lechuga cloroplastos. De los 302 aminoácidos de esta proteína, 187 codones han sido
circulatorio o inmune (Arlen et al., 2008; Belyakov y Ahlers, 2009; DavoodiSemiromi et
optimizados cambiando la frecuencia de uso del codón para parecerse a la del
al., 2010; Kohli et al., 2014; Shenoy et al., 2014; Sherman et al., 2014; shil et al., 2014; Do et
cloroplasto psbA gen (el gen del cloroplasto más altamente traducido). codones raros se
al., 2015). Tales avances mecanicistas y conceptuales podría revolucionar de
sustituyeron con codones óptimos para la expresión de transgenes en los cloroplastos y
suministro de vacuna mediante la eliminación del coste de los sistemas de producción
el contenido de AT del gen optimizedVP1 aumentó from51.98% a 59,03%. genes de
complejos, tales como la fermentación, fi cación puri, almacenamiento en frío y el
fusión BothCTBVP1 se construyeron con un GPGP región (Gly-Pro-Gly-Pro) de la
transporte (Jin y Daniell, 2015; Kwon et al., 2013). Aunque patata derivado de HBsAg
bisagra para minimizar el impedimento estérico de la VP1 fusionada, así como un sitio de
expresado a través del genoma nuclear fue probado en preclínica y en ensayos
escisión de furina, RRKRSV (Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Val) (Figura 1a). Ambos genes de
clínicos humanos hace una década (Kong et al., 2001; Thanavala et al., 2005), el
fusión fueron impulsados ​por la psbA promotor y la región 5 'no traducida (UTR) para
progreso en el avance a etapas posteriores es lento. Dos retos principales son los
aumentar la expresión, y la transcripción se estabilizó mediante la psbA 3'-UTR.
bajos niveles de expresión de antígenos vía el genoma nuclear y el potencial para
inducir tolerancia sin cebado inyectable de antígenos con adyuvantes (Chan y Daniell,
2015; Rybicki, 2014). Tanto estas preocupaciones se tratan en antígenos de la vacuna
del cloroplasto derivado (Chan y Daniell, 2015; L €

Integración de VP1 en plastomas de tabaco

CTB-VP1 líneas de tabaco transplastómicas se confirmaron por análisis de PCR con los
conjuntos de cebadores 3P / 3M y 5P / 2M. la integración dirigida y homoplasmia del gen
CTB-VP1 se evaluaron adicionalmente por transferencia de Southern sondada con el trnI y trnA
OSSL y Waheed, 2011).
fl Anking secuencia. Todas las líneas de tabaco transplastómicas independientes
Con el fin de insuficiencias de dirección de las vacunas contra la polio actuales,
mostraron fragmentos de hibridación distintas con el tamaño correcto, pero no el
incluyendo insu fi ciente vacuna fi cacia en algunas poblaciones, la inestabilidad y la
fragmento de 4,4 kb del tipo silvestre en la Un fl digerido con III blot de ADN total (Figura 1a,
reversión a la neurovirulencia, desprendiéndose de hacer circular VDPV, y el alto costo e
b). Por lo tanto, Southern blot análisis confirmó la fi c integración sitespeci estable de los
inadecuada inmunidad de la mucosa del IPV, una vacuna de refuerzo de bajo costo ha sido
transgenes en el genoma del cloroplasto y la homoplasmia.
desarrollado en este estudio usando un antígeno viral de la polio se expresa en los
cloroplastos. La estrategia de utilizar una vacuna subunidad VP1 por plantas de un refuerzo
por vía oral en lugar de repetir la vacunación OPV es un nuevo enfoque para lograr el
objetivo de erradicar el poliovirus (PV). En este estudio, se proporcionan pruebas de que Plegable, la estabilidad y CTB-VP1 pentámero de montaje en hojas de tabaco
bucal refuerzo con VP1 cloroplasto derivado junto con adyuvantes de plantas artificiales liofilizadas
(saponina y escualeno) induce fuertes respuestas inmunes que confieren inmunidad
acumulación CTB-VP1 en plantas transplastómicas fue cuantificada mediante análisis de
protectora contra diferentes serotipos de PV.
transferencia Western. Intensidades de polipéptidos CTB-VP1 en plantas nativas y de codones
optimizados se compararon con conocida

(si) CTB-VP1
(una) afl III afl III
4,4 kb WT 1 2 3 4
Bam HOLA BGL II

Salvaje tytabaco PE 0 .81 kb 4 .4 kb

3 .9 kb
del genoma del cloroplasto
16S trnI ARNt 23S
3,1 kb

CTB VP1CO
-
plantas transplastómicas
GPGPRRKRSV WT 1 2 3 4

CTB-VP1 4,4 kb

16S trnI Prrn aadA PpsbA afl III TpsbA ARNt 23S 3.4 kb

CTB VP1CO
CTB-VP1CO 3 .kb
1 1 kb 3

afl III afl III

Figura 1 Creación y caracterización de líneas de tabaco transplastómicas que expresan nativo y optimizado por codones CTB-VP1. vectores de transformación de cloroplastos (a) de tabaco que contienen
CTB-VP1 casetes de expresión. Prrn, rRNA operón promotor; aadA, aminoglucósido 3 'adeniltransferasa gen; PpsbA,
promotor y 5 'UTR de la psbA gene; CTB, secuencia de no tóxico subunidad B del cólera de codificación; VP1, secuencia para el gen de poliovirus VP1 de codificación; TpsbA, 3'-UTR del gen psbA; trnI, isoleucil-tRNA; ARNt, alanil-ARNt;

(B) análisis de transferencia Southern de las líneas de tabaco transplastómicas CTB-VP1 nativas y de codones optimizados.

Un fl III-digerido tipo salvaje (WT) y se transformó (línea 1, 2, 3 y 4) de ADN genómico se sondeó con DIG marcado con fl Anking secuencia digerido con Bam HOLA/ BGL II. UTR, la región no traducida.

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
2192 Hui-Ting Chan et al.

Las cantidades de estándar CTB. La secuencia de VP1 de codones optimizados (2600 l g
/ g de peso seco) aumento de la expresión por 50 veces en comparación con el
producto del gen VP1 nativo (54 l g / g DW, Figura 2a). Nativo y codones optimizados
CTB-VP1 alcanzó hasta
0,1% y 4 - 5% de la proteína total de la hoja, respectivamente. Como se muestra en la
Figura 2b, se detectó la proteína de fusión del monómero CTB-VP1 con la masa
molecular correcta de 44 kDa con anti-CTB o anticuerpo VP1. antígeno CTB-VP1
aumentó aún más ~ 20 veces en las células liofilizadas cuando se compara con muestras
de hojas congeladas (Figura 2C). Se observó la banda de monómero intacto de proteínas
de fusión CTB-VP1 sin ninguna degradación detectable de CTB-VP1 en todas las
muestras liofilizadas probados después de almacenamiento durante 4 y 8 meses a
temperatura ambiente (Figura 2D). Formación de estructuras pentaméricas de la
CTB-VP1 expresadas en los cloroplastos se evaluó usando ELISA de unión a GM1.
Como se muestra en la Figura 2e, tanto nativos y fresco con codones optimizados y se
liofilizó CTB-VP1 del tabaco mostró absorbancia comparable a CTB (control positivo).
Esto indica que la proteína de fusión CTB-VP1 expresa en tanto
cloroplastos frescas y liofilizadas formaron estructuras pentaméricas adecuados que podrían
unirse al receptor gangliósido GM1, que es un requisito para la administración de fármacos
de proteínas oral. La estabilidad de VP1, e fi cacia de unirse al receptor gangliósido GM1,
plegamiento apropiado y pentámero de montaje se mantuvieron después de la liofilización y
prolongada de almacenamiento durante 8 meses a temperatura ambiente (Figura 2d, e).
La evaluación de las respuestas de anticuerpos a VP1
El objetivo de este estudio era determinar si se liofiliza proteína CTB-VP1 formulado con
adyuvantes derivados de plantas (de saponina y / o escualeno), aprobado por la FDA
podría inducir específico inmunogenicidad de anticuerpos y neutralizar diferentes
serotipos de poliovirus. Se investigó el impacto de los adyuvantes (escualeno y saponina)
utilizando células vegetales que expresan un bajo nivel de VP1 (gen nativo) como
anticipamos que dosis de antígeno más alta podría enmascarar el efecto adyuvante. Lo
más importante, podríamos usar peso similar de células de plantas, pero con ~ 50 veces
la dosis de antígeno inferior, de ese modo

(una) 1 gμ WT N 2,5 gμ 5 gμ (si) CTB-VP1CO CTB-VP1CO

CTB CO WT N CO WT N CO
kDa
100 75 50 kDa CTBWT 1 2 3 4 100 75 50 kDa VP1 WT 1 2 3 4
100 75
CTB-VP1 CTB-VP1
50
50 CTB-VP1 (44 kD)
(44-kDa) 37 (44-kDa)
37
(44 kDa)
37 25
25
20
25 20

20 15
15
15
10 10

Anti-CTB Anti-VP1

CTB-VP1 CTB-VP1CO CTB (ng) L F

(C)
kDa CTB WT 2,5 5 10 (g) 0,1 0,25 0,5 1μ (g) μ 1,5 3 4,5 1X 0,2X 0,1X 1X WT
kDa
50
100 100 75

75

50 50 CTB-VP1
CTB-VP1 37 (44 kDa)
37 (44 kDa)

25
25
20 20
15
15

(re) (mi)
S (meses de almacenaje; )

CTB (ng) F 4 8

kDa 369 WT 1 21 212

100
75

50 CTB-VP1
(44 kDa)
37

25

20

15

1 gμ por carril TLP

Figura 2 Caracterización de líneas transplastómicas CTB-VP1. (A) transferencia de Western de nativo CTB-VP1 (N) o de codones optimizados (CO) y los extractos de plantas no transformadas cargados en la proteína

indicada total (parte superior) o dilución en serie (parte inferior) y se sondaron con anticuerpo anti-CTB. CTB (5 ng) se cargó como control positivo. (B) transferencia de Western de CTB-VP1 en cuatro líneas independientes

transplastómicas y de tipo salvaje (WT) (1 l g / carril) controles sondadas con anti-CTB o anti-VP1 y estándares de proteína. Los anticuerpos utilizados (factor de dilución): de conejo anti-CTB anticuerpo policlonal dilución 1: 10

000; conejo anti-VP1 anticuerpo policlonal dilución 1: 1000. (C) Comparación de la CTB-VP1 en liofilizado (L) o (f) muestras de hojas congeladas; 10 mg polvo molido se extrajo en 300 l L de tampón de extracción. 1 9 es 1 l L de

extracto de suelo. (D) Estabilidad de CTB-VP1 después de un almacenamiento de hojas liofilizadas a temperatura ambiente durante 4 u 8 meses (e) GM1 ensayo de unión de nativo (N) y de codones optimizados CTB-VP1

(CO). F: fresco; L: liofilizada; WT: no transformada; BSA (1%, w / v), albúmina de suero bovino. Los datos son medias

SD de tres
experimentos independientes.

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
 polio Plant-hecho confiere vacuna oral inmunidad 2193

eliminando impacto potencial de presentes naturalmente adyuvantes en células vegetales.
Los ratones se reforzaron con nativo (1,08 l g VP1 por dosis, grupo 6) o de codones
optimizados derivado del tabaco CTB-VP1 (52 l g VP1 por dosis, grupo 9) con las dos
adyuvantes tenía títulos de anticuerpos anti-media VP1 IgG1 de 6080 o 7840 en 57a, 4640 o
9760 87a 4.640 o 8.640 días 117o. En contraste, dos dosis de IPV (grupo 2) dio como
resultado 3520, 2160 o 1980 VP1 títulos cuando se compara con una sola dosis (grupo 3) de
IPV (2960, 920 o 1240, la Figura 3b - re). Por lo tanto, los títulos de VP1-IgG1 alcanzaron
niveles más altos en la fi meses primer y no aumentó después de boosters orales
posteriores (Figura 3a - re). Sin embargo, los títulos de VP1 IgG1 en IPV individuales o dos
dosis disminuyeron después de la primera fi meses. Del mismo modo, el suero títulos de
VP1-IgA aumentaron después del refuerzo oral en el mes primero (grupo 6:
mostró en grupos de ratones (grupos de 6, 9 y 10) por vía oral dosis de refuerzo con la
formulación nativo o codones optimizados VP1. Estos resultados muestran que bucal refuerzo
con células vegetales que expresan CTB-VP1 puede inducir tanto respuestas de la mucosa y
inmune sistémica mientras que IPV de dosis única o doble desarrolló niveles más bajos de
IgG1 y los títulos de IgA insignificantes. Debido a que tanto la VP1 nativo y codonoptimized se
fusionan con CTB, también medimos especí fi co títulos de anticuerpos CTB-IgG1 en suero y
extractos fecales. La mayoría de los grupos mostraron títulos despreciables (50 - 150) en el
suero (Figura 5) y los extractos fecales (Figura 4b), muy por debajo de la desviación estándar
de los títulos de VP1-IgG1 y son por lo tanto considerarse insignificante.

titres Poliovirus neutralizantes contra todas las cepas Sabin 1, 2 y 3 siguiente

cebado e impulsar
336, 344, 264 o 224; grupo 9: 480, 552, 400, 480) y no aumentar fi significativamente
después de subsiguiente impulso (Figura 3e - h). En agudo contraste, IPV dosis únicas o Las muestras de sangre de todos los grupos experimentales y los no tratados se ensayaron de

dobles no aumentaron los títulos de IgA, con limitación fi rmando de suministro de vacuna una manera doble ciego y en muestras por triplicado a CDC. Una muestra de suero se consideró

sistémica. Para investigar la respuesta inmune de la mucosa, que mide VP1 específico a seropositivos si los anticuerpos estuvieron presentes en un registro 2 titre ≥ 2.5. los títulos de

partir de extractos fecales (Figura 4a). Los títulos más altos de VP1 IgA fueron neutralización individuales se representaron gráficamente, y la barra representa la media de

neutralización

(una) (mi)
000 **** **** **** **** **** 1500 NS NS ** *** ***
29 días 29 días

V P1-IgA VP título
1-IgG1 titre

000 15 1000

5000 10 500

0 0
1 2 3 6 9 10 1 2 3 6 9 10

(si) (F)
15 000
**** *** **** **** *** 1500 NS NS ** *** ***
57 días 57 días
VP1-IgG1 título

10 000 1000
titre VP1-IgA

figura 3 Evaluación del suero VP1-IgG1 y VP1-IgA títulos de anticuerpos

5000 500
después de la vacunación oral o subcutánea. Las respuestas de

anticuerpos de ratones ( n = 10 / grupo) vacunados con dosis únicas o

dos de la vacuna de poliovirus inactivada (IPV) o VP1 bioencapsulado 0 0

1 2 3 6 9 10 1 2 3 6 9 10
en células vegetales. (una - d) VP1-IgG1 anticuerpo títulos en diferentes

puntos de tiempo: (a, b) refuerzos semanales y muestras de sueros

(C) (sol)
recogidos en los días 29 y 57; (C, d) aumenta mensuales y las muestras **** ** *** **** *** 1500
NS NS ** *** ***
15 000

recogidas en los días 87 y 117; (mi - h) los títulos de anticuerpos VP1-IgA 87 días 87 días

en diferentes puntos temporales: (E, F) refuerzos semanales y muestras

V P1-IgA titre V
P1-IgG1 título

10 000 1000
de sueros recogidos en los días 29 y 57; (G, h) aumenta mensuales con

muestras de suero recogidas en los días 87 y 117. Grupo 1: sin tratar;

grupo 2: 2 dosis de IPV; Grupo 3: una dosis única IPV; Grupo 6: IPV 5000 500

prime, impulsado con VP1 o grupo 9 nativo: VP1 de codones

optimizados en células de plantas con adyuvantes (saponina /

0 0
escualeno); grupo 10: igual que el grupo 9 pero sin IPV de cebado. Los
1 2 3 6 9 10 1 2 3 6 9 10
resultados se muestran como los títulos de anticuerpos recíprocos

finales individuales y medios SEM. Unidireccional ANOVA mostró (re) (H)

**** ** *** **** **** 1500
NS NS ** *** ***
15 000
diferencias significativas entre los grupos ( P < 0,0001) y post hoc
117 días 117 días
titre VP1-IgA
VP1-IgG1 título

10 000 1000

5000 500

comparaciones por t- prueba mostró diferencias significativas entre

específicos c grupos de tratamiento y el grupo de control 0 0

respectivo. (** P < 0.05, 1 2 3 6 9 10 1 2 3 6 9 10

* * * P < 0,01, **** P < 0.001, NS no significativo). grupos grupos

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
2194 Hui-Ting Chan et al.

*** **** ****

(una) 200 NS NS *** **** **** (si) NS NS
50

40
150

titre VP1-IgA

titre CTB-IgA
30
100
20

50
10

0 0
1 2 3 6 9 10 1 2 3 6 9 10

grupos grupos

Figura 4 Fecal IgA títulos de anticuerpos después de la vacunación oral y subcutánea. Los niveles de VP1 y CTB-especí fi co IgA títulos de anticuerpos en los extractos fecales obtenidas de ratones ( n = 10 / grupo) después

de la vacunación de 3 meses. gránulos fecales se recogieron en el día 10 después del refuerzo oral. Los títulos de ELISA se muestran (a) VP1-específica IgA anticuerpo titre. (B) CTB-específica IgA anticuerpo titre. Grupo 1:

sin tratar; grupo 2: 2 dosis de la vacuna de poliovirus inactivada (IPV); Grupo 3: una dosis única IPV; Grupo 6: IPV prime, impulsado con VP1 o grupo 9 nativo: VP1 de codones optimizados en células de plantas con

adyuvantes (saponina / escualeno); grupo 10: igual que el grupo 9 pero sin IPV de cebado. Los títulos de anticuerpos se definen como el recíproco de la dilución más alta por encima de la línea de corte, que era tres veces la

media de fondo. Todas las muestras se ensayaron por triplicado. Los resultados se muestran como los títulos de anticuerpos de punto final recíprocos individual y media SEM. Unidireccional ANOVA mostró diferencias signi fi

cativas entre los grupos ( P < 0,0001) y post hoc comparaciones por t- prueba mostró diferencias significativas entre específicos grupos de tratamiento C y el grupo control. (*** P < 0,01, **** P < 0.001, NS no significativo).

titre SEM de cada grupo. Los resultados muestran que después de IPV cebado,
todos los grupos experimentales - oral de refuerzo con los nativos (grupos 4 - 6) o de
codones optimizados antígeno VP1 con adyuvantes derivados de plantas (grupos 7 - 9), así
como dos dosis de IPV (grupo 2) o de una sola dosis IPV (grupo 3) - inducidos diferentes
niveles de títulos neutralizantes contra los tres serotipos de cepas Sabin. Los resultados
muestran que bucal refuerzo con VP1 codones optimizados (grupo 9) indujo fi
significativamente mayor Sabin 1-, 2- Sabin y Sabin 3-anticuerpos neutralizantes (rango de
~ 3,17 - 10.17, 3.17 ~ - 9,5 y 3,5 ~ - 10,5 registro 2
titres), similar al grupo de ratones que recibieron dos dosis de IPV (grupo 2) (rango
de ~ 3,17 - 6.17, 3.5 ~ - 10.5 y 3.17 ~ - 9,17 log 2
titres) (Figura 6a - c), pero fueron fi significativamente más altos que los de los ratones con una
sola dosis de IPV solamente (grupo 3) (rango de ~ 3,83,
~ 3.17 - 4,5 y 2,5 ~ - 6.8). Sin embargo, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en los
sueros de ratones que fueron impulsadas solamente por vía oral sin IPV de cebado (grupo
10). Los ratones se reforzaron con la VP1 nativo (grupo 6) tenía significativamente a
reducir Sabin anticuerpos neutralizantes 1-títulos (rango de ~ 3,17 - 9.17) que los ratones
potenciado con antígeno VP1 codonoptimized (grupo 9) (~ 3,17 - 10.17) ( P < 0,01). Sin
embargo, los ratones potenciado con formulación de antígeno VP1 nativo (grupo 6)
mostraron fi significativamente mayor Sabin 2 y Sabin 3-anticuerpos neutralizantes títulos
que los ratones que recibieron una sola dosis de IPV (grupo 3): (~ 3,5 - 6.83 y 3.17 ~ - 10,17
vs 3,17 ~ - 4,5 y 2,5 ~ - 6.8). Claramente, los estudios muestran que el poliovirus
neutralización de protección sólo los grupos 2, 6 y 9 de la oferta óptima contra los tres
serotipos de poliovirus. Con la excepción del grupo de 6 en Sabin serotipo 1, los tres
grupos contra los tres serotipos proporcionan resultados estadísticamente similares.
Discusión
De septiembre de 2015 declaración de erradicación mundial de virus tipo 2 ha llevado a
la OMS SAGE para recomendar la retirada de OPV2 de los programas de inmunización
sistemática en todos los países, con la introducción simultánea de al menos una dosis de
IPV (la iniciativa de erradicación mundial de la poliomielitis (IMEP), 2015) . Sin embargo,
varios riesgos aún permanecen en la preparación para la introducción global del IPV y el
próximo cambio de la OPV trivalente a la OPV bivalente, incluyendo el suministro IPV
limitado, transmisión cVDPV persistente y desafíos de contención de poliovirus (IMEP
Erradicación de la Polio y Final de partida Balance Intermedio, 2015). Lo más importante,
no hay tecnología disponible, excepto refuerzo IPV que no está al alcance de muchos
países con recursos limitados. Después de tipo 1 y tipo son erradicadas 3 poliovirus, el
uso rutinario de la vacuna OPV será suprimida y sustituida con el uso global del IPV.
Esta transición es esencial para el mantenimiento de altos niveles de inmunidad de la
población para proteger contra la aparición de VDPV y futuros brotes. Esto pone de
relieve la necesidad del desarrollo de una nueva generación de vacunas contra la polio
bajo costo debido a que el costo actual del IPV es demasiado alta para la mayoría de los
países en desarrollo (Verdijk et al.,
2014). Aunque hay que tener cuidado en la extrapolación de los resultados de los
roedores a las aplicaciones clínicas humanas, la mala seroprotectivity y neutralización
de virus de la polio obtenidos con una sola dosis de IPV se informa en este estudio en
el cuidado en el uso de IPV sin aumentar aún más.

vacuna contra la polio refuerzo sin cadena de frío

Para determinar la tasa de seropositividad de anticuerpos neutralizantes de
poliovirus, para cada cepa Sabin, el número de ratones con seroprevalencia
(neutralizando registro anticuerpo 2 ( titre) ≥ 3) se comparó con el número total de
ratones en cada grupo. Los ratones que recibieron dos dosis de IPV (grupo 2) o por
vía oral potenciado con antígeno VP1 codones optimizados con saponina y escualeno
adyuvantes (grupo 9) mostró más alto seropositividad para poliovirus Sabin 1, 2 y
anticuerpos 3 neutralizantes (Figura 6D, f) . tasa de seropositividad varió entre 70% y
90% para dos dosis de IPV frente a oral de refuerzo con VP1. Estos resultados
muestran que el antígeno VP1 codonoptimized con adyuvantes derivados de las
plantas tiene la mayor tasa de seropositividad, los anticuerpos neutralizantes (Figura
6d - f) y los títulos neutralizantes del virus (log 2 titre ~ 3.17 - 10,17) contra todas las cepas
Sabin 1, 2 y 3 (Figura 6a - C).
Expresión de VP1 en los cloroplastos y bioencapsulación de células vegetales pueden
proteger antígenos del sistema digestivo a la entrega oral y facilita su liberación en el
sistema inmune en el intestino por los microbios comensales (Davoodi-Semiromi et al., 2010;
limaye et al., 2006). fusiones de antígeno CTB facilitan el suministro transmucosal para el
sistema inmune a través del receptor epitelial intestinal GM1 (Verma et al., 2010).
Producción de vacunas verdes contra enfermedades infecciosas con facilidad de
administración oral que no requiere una cadena de frío es una necesidad importante,
especialmente en áreas con acceso limitado a almacenamiento en frío y el transporte
(Davoodi-Semiromi et al., 2010). VP1 es también altamente estable en células de plantas
liofilizadas cuando se almacena a temperatura ambiente durante varios meses, lo que
facilita un sistema de suministro de vacuna libre de la cadena de frío. Lo más importante,
la liofilización de las células vegetales mantiene

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
 polio Plant-hecho confiere vacuna oral inmunidad 2195

(una) 200
NS NS *** **** **** adecuado plegamiento de CTB con enlaces disulfuro y pentámero de montaje después de un

prolongado almacenamiento a temperatura ambiente.

29 días

Número de aceleradores y formulaciones orales requeridas

150

Antígeno específico IgG1 e IgA fueron significante inducida cativamente después de unos
impulsores orales que generan altos niveles de inmunidad sistémica y de la mucosa. Ambos
CTB-IgG1? Tre

100 títulos VP1-IgG1 e IgA VP1 alcanzaron niveles más altos después de la primera fi mes de
impulsar oral y no aumentaron aún más con más refuerzos. Aunque se proporcionan los
datos de neutralización de la colección etapa sueros más adelante aquí, los lotes anteriores

50 evaluados para Sabin serotipo 1 neutralización mostraron resultados similares en los grupos
de dosis de refuerzo con células vegetales que expresan VP1. Por lo tanto, sólo una o dos
boosters de VP1 bioencapsulado en células de plantas puede ser necesaria. Sin embargo,

0 varios refuerzos ahora se utilizan para varias vacunas. vacuna contra el ántrax actual
1 2 3 6 9 10 requiere ocho sobres (Lynch et al., 2014). Varias dosis de la vacuna oral contra la poliomielitis
(tantos como quince) se administraron en las zonas de brote en la India (Lakhani y Bumb,
(si)
250 NS NS ** **** **** 2014), pero, por desgracia, hubo varios casos de inmunidad inducida por la polio (Bhasin,
57 días 2008). Para determinar el número mínimo de refuerzos se requieren más experimentos,
aunque bajo costo y fácil almacenamiento hacen que el número de aumentos menos
200
importantes que las vacunas actuales que requieren almacenamiento en frío y transporte.
En este estudio, se suspendieron las células vegetales en solución salina tamponada con
CTB-IgG1? Tre

150 fosfato (PBS) antes de la entrega oral, pero para la entrega a los niños, pueden ser
necesarios formulación adecuada con el jarabe de azúcar. En este contexto, se debe añadir
que la administración oral de células de zanahoria liofilizadas que expresan
100
glucocerebrosidasa, suspendidas en el jugo de naranja entrado en fase I / II de estudios
clínicos realizados por Protalix BioTherapeutics (Shaaltiel
50

0
1 2 3 6 9 10
et al., 2015). Los estudios futuros deben centrarse en la expresión del antígeno VP1 en
(C) 250 NS NS NS *** *** una planta comestible adecuada para la administración oral; varios antígenos de vacunas
117 días y productos biofarmacéuticos se han expresado en los cloroplastos de lechuga (Daniell et
al., 2016A, b; Jin y Daniell, 2015; Kanagaraj et al., 2011; Lakshmi et al., 2013; Ruhlman
200

et al., 2007, 2010).

150 Aunque IPV es altamente eficaz en la inducción de anticuerpos sistémicos para
CTB-IgG1? Tre

proteger contra la enfermedad paralítica, es menos e fi ciente en la inducción de la

100
inmunidad de la mucosa que se necesita para prevenir la re-infección y excreción
de poliovirus en el medio ambiente especialmente en los países en desarrollo.
Nuestros resultados confirmaron que en ratones con dosis únicas o dos de IPV
50
inducidas sólo mínimas títulos de IgA, explicando la inadecuada inmunidad de la
mucosa de IPV. Los ratones cebados con IPV y oralmente potenciado con VP1
0 bioencapsulado suscitó fuertes antígeno especí-fi c suero IgG1 e IgA títulos en
1 2 3 6 9 10 sangre y extractos fecales, confirmando que la administración oral de antígeno
grupos VP1 con adyuvantes derivados de plantas generadas tanto las respuestas
inmunes sistémicas y mucosas. Además, el poliovirus infecta la garganta y los
Figura 5 Evaluación del suero CTB-IgG1 anticuerpo títulos después de la vacunación oral. Toxina
intestinos después del contacto con una persona infectada. Como invade
del cólera subunidad B se recubrió en placas de ELISA y se sondeó con muestras de suero
poliovirus a través de las superficies mucosas, et al., 2016). Así, en lugar de
inactivado por calor individuales (comenzando con una dilución 1: 50). CTB-IgG1 títulos de
impulsar repetidamente con IPV, impulsando la formulación oral con la subunidad
anticuerpos en diferentes puntos de tiempo: (a, b) refuerzos semanales y muestras de sueros
VP1 tiene el potencial para el desarrollo de un práctico y e fi ciente subunidad
recogidos en los días 29 y 57; (C) aumenta mensuales y las muestras recogidas en el día 117.
poliovirus.
Grupo 1: sin tratar; grupo 2: 2 dosis de la vacuna de poliovirus inactivada (IPV); Grupo 3: una dosis
única de IPV. Grupo 6: IPV primer, impulsado con la proteína VP1 nativa con adyuvantes; grupo 9:
IPV prime, impulsado con la proteína VP1 de codones optimizados con adyuvantes; grupo 10:
potenciado con VP1 codones optimizados con adyuvantes pero sin IPV de cebado. La saponina y
escualeno se usaron como adyuvantes. Los resultados se muestran como el título de anticuerpos
de punto final recíproco individual y media SEM. P < 0,0001) y post hoc comparaciones por t- prueba
Impacto de la dosis de antígeno
mostró diferencias significativas entre específicos grupos de tratamiento C y el grupo control. (** P < 0,05,
*** P < 0,01, **** P < 0.001, NS no significativo). En este estudio, evaluamos ambos antígenos VP1 nativas y de codón optimizado
expresadas en los cloroplastos. El nivel de proteína VP1 era 50 veces mayor en las plantas
que expresan VP1 codones optimizados (Figura 2). Nuestra en vivo estudio también mostró
que la vacunación con

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
2196 Hui-Ting Chan et al.

(una) (d)
*** NS NS NS NS NS ***
100
Iniciar sesión 2 neutralización titre

80
12

Seroposi? Vidad tasa (%)

Sabin 1

60
10

40
68

24 20

0 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(si)
*** NS NS *** NS NS *** (E)

100
Iniciar sesión 2 neutralización titre

80
12

Seroposi? Vidad tasa (%)

Sabin 2

60
10

40
68

24 20

0 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(C)
*** NS NS **** NS NS **** (F)

100
Iniciar sesión 2 neutralización titre

80
12
Seroposi? Vidad tasa (%)
Sabin 3

10 60

68 40

24 20

0 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

grupos grupos

Figura 6 Determinación de los títulos de virus de la polio neutralizantes y tasa de seropositividad de Sabin 1, 2 y 3-neutralizantes títulos después de la vacuna inactivada subcutánea poliovirus (IPV) o VP1 oral de

refuerzo. los títulos de anticuerpos neutralizadora de virus de 117 días sueros de ratones ( n = De 10 / grupo) potenciado con nativo o codonoptimized CTB-VP1 antígenos adyuvada con sólo saponina (grupos 4 y 7),

sólo escualeno (grupos 5 y 8) o ambos (grupos 6, 9 y 10); ratones con dos dosis de IPV (grupo 2) o la dosis IPV sola (grupo 3); y los ratones sin tratar (grupo 1). títulos individuales para cada ratón se representaron

gráficamente, y la barra representa el título medio neutralizante

SEM. La dilución de suero de un título recíproco a la que no se detectó la neutralización del virus se registró como el registro 2 ( titre) de 2,5.
anticuerpos Poliovirus neutralizantes contra las tres cepas de Sabin, (a) Sabin 1, (b) Sabin 2 y (c) Sabin 3. ANOVA de una vía mostró diferencias significativas entre los grupos ( P < 0,0001) y post hoc comparaciones
por t- prueba mostró diferencias significativas entre fi específicos c grupos de tratamiento y el grupo 3 - sola dosis de IPV (*** P < 0,01, **** P < 0.001, NS no significativo). La tasa de seropositividad de
poliovirus-anticuerpos neutralizantes como se determina por el número de ratones con seroprevalencia (neutralizando registro anticuerpo 2 ( titre) ≥ 3) con el número total de ratones en cada grupo potenciado
con el nativo o codones optimizados CTB-VP1 (grupos 4 - 10), o, IPV dos dosis (grupo 2) en el día 1 y el día 30 o IPV de dosis única (grupo 3). La tasa de seropositividad de los títulos de neutralización contra
Sabin cepas 1, 2 y 3 (d - f) se muestran.

optimizado-codón VP1 indujo signi fi respuestas de anticuerpos significativamente más un peso de 20 - 25 g, es fácil para entregar dosis adecuada a los niños. En este contexto,
elevados de IgG1 e IgA que el gen VP1 nativo, lo que indica que las dosis de antígeno más nuestro reciente éxito en la producción de antígenos en una instalación comercial cGMP
altas aumentan ef e fi de la inmunización oral. Debido a que dio 20 mg de células de plantas debe ayudar en el avance de este concepto a la clínica (Sb et al., 2015).
liofilizados para ratones

ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200

adyuvantes y antígenos derivados de plantas
quillay extracto (Tipo 1) contiene más de 100 saponinas triterpenoides derivados de
plantas (20 - 26%) y ha sido aprobado como sustancias generalmente reconocido como
seguro (GRAS) por la FDA (Agencia de Respuesta a Carta Aviso GRAS N ° 000165 GRN).
El escualeno es una sustancia que se encuentra naturalmente en el cuerpo humano, así
como en los animales y las plantas y se ha usado como un adyuvante en En influenza A
vacuna autorizada por la FDA AS03adjuvanted (H5N1) monovalente virus
(GlaxoSmithKline) y con adyuvante MF59 en influenza vacuna (Fluad TM) ( Novartis). Por lo
tanto, los antígenos y adyuvantes usados ​en este estudio se han utilizado anteriormente o
actualmente en la clínica. CTB recombinante está aprobado como un componente de una
vacuna contra el cólera orales con licencia internacional Dukoral y se utiliza en la clínica
durante una década (Hill et al., 2006). Además, la administración oral de rCTB
significativamente disminuyó la inflamación de leve a la enfermedad de Crohn
moderadamente activa en ensayos clínicos humanos (St col et al., 2010). La administración
oral de rCTB químicamente reticulado a un péptido de la humana 60-kD proteína de
choque térmico uveítis mitigado de la enfermedad de Behcet en un II de ensayos clínicos
de fase I / (Stanford et al., 2004). Modelado de VP1 muestra la estructura 3-D que los
epítopos principales aparecen en la superficie de la proteína, lo que demuestra la
idoneidad de esta estructura para generar anticuerpos adecuados para la neutralización
(Liu et al., 2011). Niveles de anticuerpos neutralizantes con un título por encima de la
dilución 1: 8 [3 log 2 ( titre)] umbral son aceptados por todos los organismos nacionales de
reglamentación por tener una buena correlación con la protección en la revisión de las
solicitudes de licencia para las vacunas IPV-que contiene (Plotkin, 2010; Verdijk et al., 2014).
Como era de esperar, los títulos de virus-neutralizantes inducidos por dos IPV dosis fueron
alta para todas las cepas Sabin. En nuestro estudio, el cebado con IPV y oralmente
refuerzo con VP1 bioencapsulado con adyuvantes derivados de plantas (de saponina y
escualeno) mostró la más alta seropositividad y los títulos neutralizantes del virus (rango
3.17 - 10.17 registro 2 titre) contra todos Sabin 1, 2, 3 cepas. Aunque los ratones que sólo
fueron reforzados con VP1 más dos adyuvantes pero no cebados (grupo 10) mostraron la
producción fuerte VP1speci fi c anticuerpo (IgG1 e IgA), no se observaron títulos
neutralizantes del virus en este grupo en comparación con los ratones que fueron cebados
con IPV. Así, sólo por vía oral refuerzo con vacuna de subunidad parece ser insu fi ciente
para inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante bien al antígeno. En comparación
con VP1-específica del anticuerpo (IgG1 e IgA), CTB-específico IgG1 e IgA títulos eran
insignificantes porque los ratones no se cebaron con CTB. Estos resultados demuestran
que el cebado oral es esencial para inducir una inmunidad adecuada contra los patógenos.
Por desgracia, la mayoría de los artículos sobre los títulos de anticuerpos de la vacuna
informe literatura producidos por plantas, pero no en los resultados patógeno o exposición
a la toxina, ez Aguirreburualde et al., 2013).
Necesidad de otras vacunas de refuerzo para la población de edad avanzada
Aunque este estudio se centra en la vacuna contra la polio de refuerzo, hay una mayor necesidad de
aumentar la inmunidad como la esperanza de vida va en aumento. Pérdida de la inmunidad contra las
enfermedades infecciosas entre la población de edad avanzada es una preocupación creciente. Por
ejemplo, las tejas se producen cuando virus de la varicela latente se reactiva cuando el envejecimiento
debilita el sistema inmunológico y esto rara vez se observa debido a las nuevas infecciones virales. Por
lo tanto, para mejorar la inmunidad contra un número de enfermedades infecciosas entre la población
de edad avanzada, vacunas de refuerzo orales de bajo coste podrían servir como un concepto
novedoso.
En conclusión, vacunas libres de virus y cadena de frío no están actualmente
disponibles para cualquier enfermedad infecciosa. Por lo tanto,
ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
polio Plant-hecho confiere vacuna oral inmunidad 2197
la producción y el suministro oral de vacunas que utilizan la tecnología transplastómicas
debería facilitar el desarrollo de bajo costo cadena- frío y vacunas de refuerzo libres de
virus. Aquí, se muestra una vacuna de refuerzo bajo costo utilizando antígenos de polio
bioencapsulado como estrategia alternativa para evitar las vacunas OPV repetidas para la
erradicación del poliovirus mundial y la prevención de brotes de poliomielitis en las zonas
endémicas.
Procedimientos experimentales
VP1 construcción cloroplasto vector y regeneración de plantas transplastómicas
El gen VP1 nativo (906 pb) de Sabin 1 poliovirus (Genbank número de acceso
AY184219) fue amplificado usando el cebador cebador y reverso 5
'CgATCTAgATCAATATgTggTCAgATC-3' 5'
gggCCCgggCCCCggCgTAAACgCTCTgTTgggTTAggTCAgATg-3. El fragmento fi
ed PCR-ampli y el gen VP1 codonoptimized (sintetizado por GenScript,
Piscataway, NJ) se clonaron en vectores de tabaco y la transformación de
cloroplastos lechuga. suministro biolístico de vectores de transformación de
cloroplasto y la regeneración de tabaco transplastómicas ( Nicotiana tabacum
CV. Se realizaron líneas Petit Habana) como se ha descrito previamente (Verma et al., 2008).
Caracterización de las líneas de tabaco transplastómicas y lechuga
Para con fi rm transgén integración casete en el genoma del cloroplasto del tabaco, la
PCR se realizó utilizando pares de cebadores 3P / 3M y 5P / 2M (Verma et al., 2008).
análisis de transferencia Southern se realizó para con fi rm integración del transgén y la
homoplasmia como se ha descrito previamente (Verma et al., 2008).
La liofilización de CTB-VP1 hojas de tabaco transplastómicas
hojas de tabaco Frozen CTB-VP1 fueron transportados a un liofilizador (Génesis
35XL, SP científica, Stone Ridge, NY) en hielo seco y se liofilizaron en 40, 30, 20, 15,
10, 5 y 25 ° C durante un total de 72 h bajo un vacío de 400 mTorr. materiales de
hojas liofilizadas se molieron en un molinillo de café (Hamilton Beach, Southern
Pines, NC) tres veces a la máxima velocidad (impulso en 10 s y de 30 s). El polvo fi
ne se almacenó con gel de sílice en un entorno libre de humedad a temperatura
ambiente.
El análisis por inmunotransferencia y puri fi cación de proteínas
chloroplastderived
El análisis por inmunotransferencia y cuantificación de proteínas de fusión CTB-VP1
se realizaron de acuerdo con los métodos publicados previamente (Davoodi-Semiromi
et al., 2010). El ensayo densitometría para cuanti fi cación de CTB-VP1 se llevó a cabo
usando cantidad conocida forma monomérica (11,5 kDa) estándar CTB (Sigma, St
Louis, MO) y el monómero de la proteína de fusión. Para detectar proteínas
fusionadas-CTB-VP1, las transferencias se incubaron con 1: 10 000 de conejo
anti-CTB anticuerpo policlonal (GeneWay, San Diego, CA) o 1:. 1000 de conejo
anti-VP1 anticuerpo policlonal (Alpha Diagnostic Intl Inc., San Antonio, TX), seguido de
1: 4000 de cabra anti-IgG de conejo-HRP como anticuerpo secundario
(SouthernBiotech, Birmingham, aL). CTB y recombinante Sabin 1 VP1 (Alpha
Diagnostic Intl. Inc.) se utilizaron como controles positivos. Para las proteínas de
fusión CTB-VP1 del cloroplasto derivado purifican, se utilizó His60 Ni Súper flujo de
resina (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) según las instrucciones del
fabricante. Las fracciones eluidas se dializaron tres veces con PBS estéril, ° Se usó C.
Puri fi ed cloroplasto derivado de CTB-VP1 para mediciones de inmunoglobulina.
2198 Hui-Ting Chan et al.
Toxina del cólera B-GM1-gangliósido receptor ensayo de unión
Para probar la capacidad del derivado de cloroplasto del tabaco CTB-VP1 para formar
pentámeros y se unen al receptor GM1-gangliósido, un CTB - ensayo de unión a GM1
se realizó como se describe (DavoodiSemiromi et al., 2010).
Los ratones y Programa de vacunación
Mujer ratones CD-1 6 años de edad - Se adquirieron 7 semanas de Charles River
Laboratories (Wilmington, MA) y alojados en jaulas microisolator. Los experimentos se
llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la Universidad de Pennsylvania
Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Los ratones fueron divididos
aleatoriamente en nueve grupos de 10 ratones por grupo. Grupo 1 era un grupo de
control en el que los ratones se dejaron sin tratar. Todos los ratones de los grupos 2 a 8
fueron por vía subcutánea (sc) cebado con 100 l L de IPV suspensión de tres tipos de
poliovirus [40: 8: unidad de antígeno 32 D de tipo 1 (Mahoney), de tipo 2 (MEF-1) y tipo
3 (Saukett) (IPOL, Sano fi Pasteur, Swiftwater, PA)]. Grupo 2 Los ratones fueron sc
impulsado con los mismos IPV 30 días después del cebado. Grupo 3 ratones fueron
solamente sc imprimadas con IPV. Los ratones en grupos de 4 a 10 fueron impulsadas
por vía oral con material vegetal liofilizado: los ratones en grupos de 4 - 9 fueron
impulsadas una vez a la semana durante ocho semanas consecutivas a partir del 1
semana después de la sensibilización. Los ratones en grupos de 4 a 6 fueron
impulsadas por vía oral con hojas de tabaco CTB-VP1-expresan nativas liofilizada; cada
ratón fue reforzado con 20 mg de material en 200 l L de PBS más diferentes adyuvantes:
saponina (saponina de Kilaja corteza, Sigma) (grupo 4), escualeno (Sigma) (grupo 5) o
ambos (grupo 6). Los ratones en grupos de 7 a 10 fueron impulsadas por vía oral con
CTBVP1 expresan hojas de tabaco codones optimizados liofilizada; cada ratón fue
reforzado con 20 mg de material en 200 l L de PBS más diferentes adyuvantes: saponina
(grupo 6), escualeno (grupo 7) o ambos (grupos 9 y
10). La sangre se recogió 1 día antes de imprimar y 10 días después del refuerzo. Las
muestras de suero fueron inactivado por calor al 56 ° C durante 30 min para destruir la
actividad del complemento. En el tercer mes después oral de refuerzo con formulaciones
CTB-VP1, los pellets fecales se recogieron en el día 10 después de la vacunación.
Preparación de formulaciones de vacuna de bioencapsulado, CTB-VP1 planta
hecho
formulación de la vacuna se lleva a cabo generalmente como se describió previamente
(Domingos et al., 2008; Sotavento et al., 2015), pero con cationes modificadores. emulsión
primaria en la fase acuosa se hizo mezclando 0,05% de Tween-80 en PBS con 20 mg
de material VP1 planta de tabaco liofilizado (con 2 mg de saponina o no) y seguido por
mezcla con la fase de aceite de escualeno (80% v / v escualeno, 20% v / v de Span-80).
Determinación de la respuesta de anticuerpos por ELISA
respuestas inmunológicas, incluyendo suero y los niveles de extracto fecales de
VP1-específico IgG1, IgA y CTB-específico IgG1, los títulos de IgA, se ensayaron mediante
ELISA directo como se ha descrito previamente (DavoodiSemiromi et al., 2010). La sangre se
recogió 1 día antes de imprimar y 10 días después del refuerzo. bolitas fecales se recogieron
en el tercer mes después de la dosis oral. Como se ha descrito previamente (Kraynyak et al., 2010), Prevención de Enfermedades.
todos los gránulos fecales fueron pesados ​y, se añadieron 2 ml / g de 0,01% BSA 0,02% de
solución de azida de sodio que contiene inhibidor de proteasa. Después de agitación con
vórtex vigorosa (~ 20 min), las muestras se centrifugaron a 135 sol durante 20 min. El
sobrenadante se transfirió a un tubo limpio para su posterior centrifugación (1.600
sol, 30 minutos). El sobrenadante se dividió en alícuotas y se almacenó a 80 ° DO.
ª 2016 los autores. Plant Biotechnology Journal publicada por la Sociedad de Biología Experimental y la Asociación de biólogos Aplicadas y John Wiley & Sons Ltd., 14, 2190-2200
Brevemente, para la medición de los títulos de anticuerpos VP1-IgG1 e IgA VP1, 10 l g / ml
purificado proteínas CTB-VP1 se utilizó para revestir placas de 96 pocillos Maxisorp ELISA
(Nunc) durante la noche a 4 ° C. Para la medición de los títulos de anticuerpos IgG1 e CTB
CTB-IgA, fuente comercial toxina del cólera subunidad B (1 l se utilizó g / ml) (Sigma) para el
recubrimiento de 96 pocillos de placas de ELISA durante la noche a 4 ° C. Las placas se
bloquearon con 1% de BSA (Sigma 7906) en PBS con 0,05% de Tween. de diluciones
dobles de muestras de suero de los ratones individuales inactivadas por calor (empezar a
dilución 1: 400 para VP1-IgG1, 1: 50 de dilución para VP1-IgA y CTB-IgG1) extractos de
pellets fecales o (comienzan en 1: 5 tanto para VP1-IgA y CTB-IgA) se incubaron durante la
noche a 4 ° C, seguido por HRPconjugated rata anti-IgG1 de ratón (1: 1000) (BD) o
HRPconjugated de cabra anti-ratón de IgA (1: 5000) (American Qualex, San Clemente, CA)
diluido en tampón de bloqueo y se incubaron a 37 ° C durante 1 h seguido por el desarrollo
de color con sustrato TMB durante 10 min a RT. La reacción se detuvo añadiendo 100 l L de
ácido sulfúrico 2 N por pocillo, y se midió la absorbancia usando un lector de ELISA a 450
nm. Los títulos de anticuerpos se define como el recíproco de la dilución más alta por
encima de la línea de corte, que era tres veces la media de fondo (Frey et al., 1998). Todas
las muestras de suero y extractos de pellets fecales se ensayaron por triplicado. Los
resultados se muestran como título de anticuerpos individuo
SEM.
Poliovirus Sabin 1, 2, Ensayo 3 neutralización
Animales se reforzaron por vía oral con proteínas CTBVP1 nativas o codones optimizados
con adyuvante de saponina y / o escualeno o, para el grupo 2 y el grupo 3, tanto de
cebado y refuerzo con el IPV o cebado con sólo el IPV. Diez días después del último
refuerzo oral (día 117 del experimento), se recogieron y se guardan a 80 muestras de
suero ° C para más ensayos de neutralización en los Centros para el Control y la
Prevención (CDC) como se describe previamente de Enfermedades (Verdijk
et al., 2014; OMS, 1991, 1997). Y, muestras de suero brevemente se ensayaron por
triplicado con el uso de ensayos fi ed microneutralización caciones para los anticuerpos a
Sabin cepas de tipo 1, 2 y 3. Las muestras de suero de control y los grupos experimentales
se ensayaron aleatoriamente y ciegamente. La dilución de suero de un título recíproco a la
que no se detectó la neutralización del virus se registró como el registro 2 ( titre) de
2,5, o negativo; un registro 2 título de ≥ 3 se consideró protectora. títulos individuales para
cada ratón se representan gráficamente, y la barra representa título medio neutralizante
SEM.
análisis estadístico
se notifican todos los datos para los ratones individuales, y la media SEM se da para cada
grupo. Los análisis de las diferencias estadísticamente significativas en los títulos de
anticuerpos entre los grupos se realizaron utilizando ANOVA de una vía y t- de prueba
(GraphPad Prism versión 6) y PAGS
valores <0,05 se consideraron significativos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por Bill y Melinda Gates (OPP1031406), NIH
subvenciones R01 HL107904 y R01 HL109442 de Henry Daniell. Los hallazgos y
conclusiones de este informe son las de los autores y no representan
necesariamente la de la posición oficial de los Centros para el Control y la
El conflicto de intereses
Aunque no hay financiera conflicto de interés para informe, se describe que el
autor correspondiente es un inventor en numerosas patentes de informes
expresión de proteínas terapéuticas humanas en los cloroplastos.
 polio Plant-hecho confiere vacuna oral inmunidad 2199

CTACK modula la respuesta inmune en las mucosas en ratones y macacos.

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