TEMA 3.

DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

Cristalografía de rayos X

Se prepara un cristal que contenga a la proteína y bombardearlo con rayos X, de tal forma que
al interaccionar por difracción cree un patrón de difracción impreso que permita determinar la
estructura de la proteína cristalizada

Pasos:
1. Formar cristales con un
determinado tamaño y dureza
2. Bombardear con sayos X
3. Obtención de un patrón (visua-
lizar y analizar)
4. Obtención del mapa de densi-
dad electrónica
5. Deducción de la estructura
protéica

La propiedad más importante del estado cristalino es la

repetición en el espacio de ciertos patrones. Cuando se
estudia el estado cristalino conviene marcar un punto
arbitrario como referencia para establecer una red (espacio
reticular) a partir de este.

Los puntos reticulares (a analizar) están relacionados entre sí

por operaciones de translación. Cuando se define un espacio
reticular se establece un espacio mínimo que por repetición
es el que genera el retículo completo.

En tres dimensiones, el patrón se repite ahora las tres longitudes de

espacio. El motivo mínimo que se repite para generar el espacio
reticular en 3D se llama celda unidad. La repetición tiene que ser
periódica, formando una serie de paralelepípedos que forma la red.
Por tanto la red cristalina es una repetición tridimensional de la celda
unidad.

Identificar un cristal es identificar una celda unidad, y a partir de la célula unidad podemos
generar la red completa. Para definir la celda unidad es necesario dar ciertos parámetros:

 Aristas (Å): a (lado más largo), b ( lado que completa la base) y c (altura)

 ̂ ) β (𝑎𝑐
Ángulos: α (𝑏𝑐 ̂)
̂) y γ (𝑎𝑏

 Volumen de la celda unidad:

1
𝑽 = 𝑎𝑏𝑐 · (1 − 𝑐𝑜𝑠 2 𝛼 − 𝑐𝑜𝑠 2 𝛽 − 𝑐𝑜𝑠 2 𝛾 + 2 𝑐𝑜𝑠 𝛼 · 𝑐𝑜𝑠 𝛽 · 𝑐𝑜𝑠 𝛾) ⁄2

En función de los parámetros de la celda unidad se definen 7 sistemas cristalográficos. Cada

uno de los 7 sistemas tiene una relación rotacional de simetría característica.

1
Para un mismo espacio reticular hay varias posibilidades de colocar los puntos en la red. Se
pueden colocar en los vértices pero también puede haber en otros sitios. Todas las posibilidades
de redes que se conocen en la naturaleza dan lugar a 14 estructuras (Redes de Bravais) que se
conocen en cristalografía, que generan un subconjunto que corresponde casi con el de los 7
sistemas anteriores.

 Cuando una red tiene puntos (átomos) solo en

las esquinas la red se llama primitiva. Redes
primitivas hay siempre, en las 7 posibilidades.
P
 Además nos vamos a encontrar redes donde
hay puntos extra, si están en el centro se llama
red centrada en el cuerpo. En monoclínico y
los 3 último no hay. I

 Red centrada en las caras: Además de puntos

en los vértices también tienen puntos
reticulares en los centros de las 6 caras (en
cubico y ortorhombico) F

 Red centrada en el lado: Además de las

esquinas hay puntos en el centro, pero solo de
caras opuestas. Solo hay en monoclínico. C
 Excepción en redes trigonales. Se usa R pero
es un P más. R

Hasta ahora solo se han tenido en cuenta los movimientos de traslación, pero, ¿qué pasa con
rotaciones, reflexiones en el plano e inversiones? Si tenemos en cuenta este tipo de operaciones
aparecen muchas más combinaciones

Los elementos de simetría que hay en cristales son: ejes de simetría de orden 2, 3, 4 y 6, planos
de simetría (m) y centros de inversión (i). Estos elementos de simetría, en redes tridimensionales
generan 32 grupos puntuales (conjuntos de operaciones en cristales que dejan invariante un
punto).

Nota: en algebra se llama grupo a un conjunto con unas determinadas propiedades.

Cuando se combinan estas operaciones con las translaciones aparecen nuevos elementos de
simetría como pueden ser los planos deslizantes y ejes helicoidales. Cuando se combinan todos
estos elementos se ve que hay 230 posibilidades de transformaciones de simetría en la red.
Cualquier proteína está en alguno de los 230 grupos espaciales.

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Una proteína tiene una forma muy irregular y por eso es difícil hacer crecer un cristal que esté
bien ordenado. Por los huecos que dejan las proteínas pueden representar la mitad del volumen
del cristal (canales que se crean) y son rellenados por moléculas de disolvente (agua), estas
moléculas de agua son muchos más móviles que las del cristal real e introducen ruido.

Dificultad para hacer cristales:

 Deben tener una pureza de al menos del 97%
 Los cristales se forman a partir de una disolución sobre saturada (sistema
termodinámicamente inestable, de no equilibrio). Hay más cantidad de soluto de la que
debería a la temperatura a la que estamos trabajando.
 La formación de cristales depende de muchas circunstancias ambientales

Por todo esto lleva mucho tiempo hacer cristales

Estrategia para formar cristales a partir de una disolución sobre saturada

Tenemos un vaso que se cierra, se sella y debajo de la placa se

pone una gota con una disolución que contiene la proteína y un
agente precipitante (cualquier sal muy soluble en agua y que no
agreda a la proteína) en una concentración baja. En el fondo del
vaso se pone la misma disolución, pero con una concentración
alta de agente precipitante (Cuanta más diferencia de
concentración mejor).

Cuando empezamos hay una diferencia muy grande, es la única variable que hay que variar para
llegar a equilibrio del sistema. Se sube la concentración de precipitante arriba para lo cual hay
que modificar la cantidad de líquido que hay en esa disolución (se sube la concentración de
precipitante en la gota retirando agua). Se observa difusión de vapor de agua por lo que agua
pasa de arriba a abajo, cuando la gota ha perdido suficiente cantidad de agua como para que
haya aumentado la cantidad de precipitante el proceso se detiene. Se forma el cristal por
nucleación.

Cuando un cristal crece lo hace por deposición de capas (capas de crecimiento). Hay capas
(planos) de agregación que son más favorables que otras.

Para entender lo que es la difracción en un cristal hay que plantear una reflexión de luces (que
hace una onda cuando interacciona). Vamos a examinar los planos de crecimiento de un cristal.
La información sobre los planos en un cristal (la forma o geometría) se consigue trabajando con
unos parámetros que se llaman índices de Miller.

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 Se hacen dos cosas:

1. Mirar cual es la distancia mínima de corte de los planos en una celda unidad. Si los
dibujos fueran redes planas, la celda unidad seria el recinto lineal (todo lo que hay en la
red son repeticiones), de forma que hay un conjunto de planos que son paralelos y que
crecen en esa inclinación.

A B C

Se expresa esa distancia mínima en fracciones de las dimensiones de la celda unidad. Si

un plano corta en la parte media de la arista a diré que es 12 de a. En A es (1,1), en B es
(12, 13). Cuando un conjunto de planos son paralelos a uno de los lados de la celda unidad
decimos que la distancia es infinita. En C es (∞,1)

2. Calcular los inversos de las distancias determinadas en el paso anterior, y esos inversos
se escriben entre paréntesis sin comas. Con una particularidad: si esos inversos ya son
números entero, estos números enteros ya son los índices de Miller del cristal y si no
son enteros hay que multiplicar por un factor hasta que lo sea.
A (1 1) B (2 3) C (0 1)

Ej: datos cristalográficos de un compuesto orgánico

pequeño (toxina del hongo alternaría). Caso del
Alternariol. La estructura en el cristal no es plana,
aparecen diedros fuera del plano. Se ve la celda unidad
del cristal, es curioso porque solo hay una molécula
completa, el resto son trozos de otras. Cuando se
analizan varias capas de moléculas empieza a verse un
patrón.

Para visualizar el cristal usamos rayos X porque se utiliza en una escala del orden de magnitud
de lo que queremos medir. La escala son Å, y la radiación electromagnética cuya longitud de
onda permita sondear estas magnitudes son los rayos X.

Formas de generar rayos X:

 Se da una descarga, los electrones chocan con el ánodo
y se emiten rayos X. En el impacto entre los electrones
y los átomos del ánodo metálico se calienta.

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 Se emiten rayos X poco intensos por lo que hay que someter a la muestra a tiempos de
exposición muy largos. Se necesitan cristales grandes, de 0’5 mm.

 Synchrotron: se someten partículas a velocidades

altísimas, en el movimiento radial se genera
radiación electromagnética. Esta radiación que
aparece por aceleración radial se llama radiación de
Synchrotron. Se saca un haz de la longitud de onda
que nos convenga, tienen enorme intensidad. Los
tiempos de exposición son cortos.

 Aparición nueva fuente de rayos X. Producción

de láseres de rayos X. Se puede trabajar con
cristales de nm.

Una vez hemos formado los cristales y tenemos la fuente de rayos X hay que hacer que choquen.
Observaremos un fenómeno de difracción que consiste en el cambio de dirección que
experimenta un conjunto de ondas al chocar con un obstáculo.

Cuando las ondas del frente se descomponen

resulta que al salir del obstáculo pueden seguir
caminos diferentes, y pueden ir en fase (coinciden
máximos con máximos y mínimos con mínimos) o
desfasadas (al revés). Se da lugar a puntos de luz o
de sombra obteniéndose un patrón de difracción.

Las bandas de luz se formarán cuando se de

interferencia constructiva (cuando las ondas se
refuercen). Por el contrario, hay interferencia
destructiva (sombra) cuando las ondas se
destruyen.

Esto depende de la diferencia de fase, si las ondas

salen en fase (si la diferencia de fase es 0) dos
ondas de amplitud 1 refuerzan la amplitud dan
valor 2 y es constructiva. Si hay desfase de ¼ de
onda va a haber un reforzamiento parcial (1’4).
Habrá zona de luz, no tanto como la anterior pero
no llega a ser sombra. Si van desfasadas ½ es
sombra.

Red de difracción: es una superficie que tiene la particularidad de que la superficie rugosa
cuando es iluminada con algún tipo de luz produce difracción. Ejemplo: CD funciona como tal.

El fenómeno de difracción se da si el tamaño del objetico con el que choca (obstáculo, rejilla,
espaciado) es del orden de magnitud de la longitud de la onda.

Si el objetivo original tiene un determinado patrón de formas, la idea es que se puede ver qué
patrón de difracción produce eso. Si examinamos un patrón de difracción podemos deducir la
organización espacial del objeto que produjo la difracción. Los patrones de difracción dan
información sobre los objetos que la han producido.

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Se somete cristal a rayos X a cualquier orientación posible (se le hace rotar en las 3 dimensiones
del espacio, para que se produzcan todas las difracciones posibles) y se da la difracción,
observando en la placa un patrón de difracción. Cuando los rayos X inciden sobre el cristal éste
se calienta mucho pudiendo romperse (complica el proceso, hay que enfriarlo).

Algunos rayos X interactúan con los electrones de cada átomo y hacen que oscilen. La oscilación
de electrones sirve como nueva fuente de rayos X que se emiten en todas las direcciones. Los
rayos X salen tras atravesar el cristal a diferentes distancias dependiendo de la posición de cada
átomo del cristal. Solo los rayos que constructivamente interfieren con otro (ondas se suman:
haz difractado) dar lugar a un punto de difracción en el detector.

̅̅̅̅
𝐴𝐵 = ̅̅̅̅
𝐵𝐶 = 𝑑 sen 𝜃

𝐷𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠:
̅̅̅̅
𝐴𝐵 + ̅̅̅̅
𝐵𝐶 = 2𝑑 · 𝑠𝑒𝑛𝜃 = 𝑛𝜆

a c La última igualdad se da cuando están en

fase y hay una interferencia constructiva
b máxima.

Se puede ver como una reflexión de las ondas en los planos del cristal. Cuando una onda se
refleja lo hace con el mismo ángulo con el que ha incidido. La diferencia entre ondas: Depende
de la distancia de los planos y del ángulo de incidencia. La diferencia de caminos debe ser un
número entero de veces la onda, la suma es máxima.

Una vez tenemos la celda unidad, los índices de Miller

(h, k, l) van a determinar los planos que la componen.
En una celda unidad puede haber varios planos. A partir
de las distancias de corte se puede deducir. Podemos
relacionar distancias de planos con puntos de corte.

Existe una relación entre la distancia entre planos y los

1 ℎ2 𝑘2 𝑙2
puntos de corte: = 𝑎2 + 𝑏2 + 𝑐 2
𝑑2

6
En la imagen se ve un patrón de difracción. Debe haber
una simetría. No todos los átomos producen señales de
difracción con la misma intensidad, el poder de
difracción de un átomo es directamente proporcional al
tamaño del átomo (más electrones implica mayor poder
de difracción).

Cada tipo de átomo tiene un factor, una propiedad que

se puede conocer que mide su capacidad de difractar, se
llama factor de dispersión de rayos X o factor de
scattering (fj) del átomo j.

Para sacar la información contenida lo que se hace es codificar todas las manchas del patrón de
difracción en términos matemáticos de una expresión que son los factores de estructura.
𝑭(ℎ𝑘𝑙)𝑛 = ∑ 𝑓𝑗 𝑒 −2𝜋𝑖(ℎ𝑥𝑗+𝑘𝑦𝑗+𝑙𝑧𝑗)
𝑗
Es una expresión que es un sumatorio sobre todos los átomos de la celda unidad, el factor fj es
el término de la expresión que nos va a indicar si la mancha es más o menos intensa. La
exponencial es una forma de expresar un vector de posición en el espacio tridimensional del
cristal, es decir, de indicar las posiciones de los átomos.

Es el vector de posición teniendo en cuenta en que plano está el átomo (por eso están los índices
de Miller), con coordenadas que hacen referencia al cristal.

La racionalización de los factores de estructura se puede deducir a partir de:

 Vector de posición atómico: coordenadas relativas a las dimensiones de la celda unidad

⃑⃑⃑
𝑅𝑗 = ℎ𝑥𝑗 + 𝑘𝑦𝑗 + 𝑙𝑧𝑗

 Cuando se produce un fenómeno de difracción, una onda que es una función

matemática de tipo 𝐴𝑐𝑜𝑠 · (𝑛𝜋𝑥). Cuando hay interferencias nos interesa la amplitud
de la onda para ver la fase, pero cuando se suman más ondas se introduce el ángulo de
fase (𝜑) :
𝐴𝑐𝑜𝑠 · (𝑛𝜋𝑥 + 𝜑)

 Cualquier onda se puede escribir como una combinación de senos y cosenos. Esta serie
es conocida como serie de Fourier:
𝑓(𝑥) = ∑ 𝑎𝑛 · cos(𝑛𝜋𝑥 + 𝜑) + ∑ 𝑏𝑛 · sen(𝑛𝜋𝑥 + 𝜑)
𝑛 𝑛

 Relación de Euler: una suma de senos y cosenos se puede escribir como una exponencial
compleja. Las operaciones exponenciales hacen mucho más fácil su resolución que
productos y divisiones:
𝑒 ±𝑖𝜋𝑥 = cos(𝜋𝑥) ± 𝑖𝑠𝑒𝑛(𝜋𝑥)

La herramienta matemática para extraer información de los patrones de difracción ya

codificadas con los factores de estructuras es la transformada de Fourier (FT). Permite
interconvertir dos maneras de describir un mismo fenómeno.

7
Por ejemplo tenemos una onda se puede definir en un cierto dominio respecto al tiempo f(t) o
también en un dominio de frecuencias f(ν). Si conocemos f(t), para sacar f(ν) hay que resolver
una integral. Son dos integrales que permiten transformar las dos descripciones del mismo
fenómeno:
∞
 Si se conoce f(t): 𝑓(ν) = ∫−∞ 𝑓(𝑡) · 𝑒 2𝜋𝑖νt 𝑑𝑡
∞
 Si se conoce f(ν): 𝑓(t) = ∫−∞ 𝑓(ν) · 𝑒 −2𝜋𝑖νt 𝑑ν

La transformada de Fourier relaciona el dominio del tiempo de la función (rojo) al dominio de la

frecuencia de la función (azul). Las frecuencias que la componen, distribuidas por el espectro de
frecuencias, se representan como picos en el dominio de la frecuencia de una amplitud
determinada.

Al utilizar la transformada de Fourier de los factores de estructura sale la densidad electrónica

en el mundo real (x, y, z). Se pueden trazar mapas de contorno de la densidad electrónica. Hay
que convertir la densidad electrónica en una estructura molecular. Tenemos un mapa inicial
(rejilla) de densidad electrónica, se hace una propuesta de modelo molecular y luego se va
refinando el modelo.

La calidad de la estructura final (lo bien o mal que quede el grupo de átomos) depende de una
propiedad que es la resolución. Es una medida de la calidad de los datos que se han recolectado
en el cristal. Si todas las proteínas del cristal estuvieran perfectamente alineadas y el cristal fuera
perfecto cuando los rayos X inciden los fenómenos de difracción serian coherentes, las manchas
serian nítidas.

La resolución es también el nivel de detalle en el mapa de densidad electrónica. La resolución

de se da en Å y depende del cociente el número de coordenadas atómicas que queremos
determinar divido por el número de manchas de difracción (calidad de nuestro trabajo).

Cuanto más baja sea la resolución mejor, el numerador no se puede cambiar, pero el
denominador sí, debemos obtener más manchas. Para mejorar la resolución:

 Obtención de cristales bien ordenados, fríos y sin impurezas. Es el factor limitante, hay
proteínas que sencillamente no pueden cristalizar mejor porque son irregulares, muy
móviles.

 Poder de penetración de los rayos X. Es una cuestión de dinero, pero es factible.

 Buenas técnicas de procesado de imagen. Aquí no hay problema, todos los días se están
produciendo avances.

8
Construyendo el modelo inicial es un proceso de ensayo y error en el que las piezas son
moleculares movido hasta que se obtiene un buen ajuste. Con un modelo inicial calculamos los
factores de estructura que se obtendrían con esa estructura. Cada modelo estructura se
comparan los factores de estructura calculados en cada momento con los factores de estructura
observados, se mueven las estructuras recalculando los factores hasta que se ajusta, se intenta
minimizar una función, que se llama función residual, R, sumatorio sobre las manchas de la
diferencia de los factores de estructura entre. A esto se le llama refinar una estructura.

Las coordenadas vienen a ser entre 0’1 y 0’2 veces la resolución. Para hacerse una idea de qué
fiabilidad tienen las estructuras:

Factor R de una proteína es una mediad de la calidad del modelo atómico obtenido de los datos
cristalográficos, es una medida de lo bien que hemos hecho el trabajo. Al principio de un fichero
PDB está el valor R.

Si tuviéramos un ajuste perfecto, R sería 0, conseguiríamos clavar el valor experimental. Cota

superior no hay, pero en la práctica para moléculas tan complejas como las proteínas, se ha
probado que con un conjunto aleatorio de átomos, sin estructura sería R = 0’67, es la cota
práctica. Entre 0’2 o 0’25 podemos fiarnos. Los datos de difracción están bien tratados.

Un proceso de refinamiento se utiliza para mejorar el modelo atómico para que se ajuste mejor
a los datos experimentales y mejorar así el valor-R. Sin embargo, esto introduce un sesgo en el
proceso ya que el modelo atómico se utiliza junto con el patrón de difracción. Para corregir este
problema, se introduce un nuevo valor R-libre.

Antes de que comience el refinamiento, en torno al 10% de las observaciones experimentales

se eliminan de los datos y el refinamiento se lleva a cabo utilizando el 90% restante. El valor R-
libre se calcula entonces para ver lo bien que el modelo predice que el 10% que no se utiliza en
el refinamiento. Para un modelo ideal, el R-libre sería similar a la del R normal, pero por lo
general, es ligeramente superior con el R-libre ~ 0,26 que corresponde a los valores R ~ 0.20.

Hay una última magnitud, que es una propiedad atómica, se da para todos los átomos de la
estructura, que da la “movilidad” (no es que se mueva pero sí oscila) del átomo en la estructura.

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Esta propiedad se llama factor B atómico / factor térmico/ factor Debyer Waller. Se define
como 𝐵 = 8𝜋〈𝑥 2 〉, donde 〈𝑥 2 〉 es la desviación cuadrática de las (x, y, z) del átomo.

Si hay una parte de la estructura que es muy flexible, va a oscilar su posición. Se da un único
número, se supone que esa movilidad es isótropa (que cambia igual en todas las direcciones, a
gran escala mires donde mires tiene el mismo aspecto). Si tenemos la posición de un átomo
representadas por un punto estamos hablando de una esfera que da la incertidumbre de las
coordenadas (de la posición atómica). Está midiendo una desviación cuadrática media.

Con el factor B se puede calcular cual es la oscilación, incertidumbre de las coordenadas. Se

puede calcular la incertidumbre de las coordenadas despejando 〈𝑥〉 de la ecuación. En la
práctica se acepta que son valores buenos de B aquellos en los que la incertidumbre está en
valores suficientemente inferiores a 1Å (B<50). Un mismo residuo, como la histidina puede tener
factores B altos y bajos. Cuando coordina un átomo de hierro está más sujeto mientras que si el
grupo está expuesto al agua está más suelto.

Para obtener mapas de densidad electrónica se usan servidores en páginas web. Se pone el
código de la proteína y nos descargamos el mapa. Tiene que haber factores de estructura en el
PDB para poder calcularlo.

Espectroscopía NMR

Ciertos núcleos atómicos tales como 1H, 13C, 15N, 31P (nº impar de partículas en el nucleo) y tienen
un momento magnético o spin igual a ½ y, en consecuencia, dos estados de espín con diferencia
de energía ~ 0,5 J / mol

En estos casos hay dos estados energéticos posibles asociados con los valores que pueden tomar
(± ½). La diferencia entre los estados de energía (ΔE) para la mayor parte de los núcleos es 0,5
J/mol. El paso entre estados se dará por la absorción/emisión de fotones. Si el fotón asociado a
la ΔE viene determinada por una señal de radiación electromagnética se puede deducir que:
Los fotones: 1,3·109 s-1  1300 MHz (radiofrecuencia)  λ= 0,23 m

Cuando una molécula se coloca en un campo magnético fuerte, los giros se alinean a lo largo del
campo hasta llegar a un estado de equilibrio. Esta alineación de equilibrio se puede cambiar a
un estado excitado mediante la aplicación externa de pulsos de radiofrecuencia (RF) a la
muestra.

Cuando los núcleos vuelven a su estado de equilibrio, que emiten el exceso de energía en el
forma de radiación de RF que se encuentra a una resonancia específica (con el pulso de RF
externo), esta frecuencia se puede medir. La frecuencia exacta de la radiación emitida desde
cada núcleo depende de su entorno molecular y es la mismo para los átomos químicamente
equivalentes.

Las señales en un espectro RMN se dan con

una magnitud que se llama desplazamiento
químico o chemical shift (δ). Se define como la
diferencia entre la frecuencia de resonancia de
la muestrea menos la frecuencia de resonancia
del compuesto de referencia dividido por la
frecuencia a la que opera el espectrómetro. Es
una magnitud adimensional.

10
Los valores típicos de δ están en torno a δ = 600Hz/300MHz = 2·10-6, por la magniud del valor se
dan en ppm. El compuesto de referencia se toma como referencia para no tratar con valores
absolutos (así hay menos error)
 Para tratar con 1H, 13C 29 se utiliza tetrametilsilano (TMS)
 Para tratar con 15N se utiliza amoniaco líquido
 Para tratar con 31P se utiliza ácido fosfórico
 Para tratar con 17O (es muy poco abundante y con señal muy debil) se utiliza agua líquida

En proteínas hay muchas señales solapantes y con una sola

dimensión no se pueden resolver los espectros de RMN. Para
resolver este problema se hace una espectroscopia de RMN
bidimensional.

Se utilizan dos tipos de desplazamientos químicos. En un

espectro bidimensional la diagonal son las señales en las que
los dos desplazamientos sean iguales. Los offpicks son los que
están fuera de la diagonal y permiten resolver la estructura.

La espectroscopia de RMN de dos dimensiones se basa en dos tipos de interacciones de spin que
produce la separación de los picos de absorción de RMN. (Requiere un átomo X, que es el núcleo
que se observa y un átomo A, que es un núcleo en la proximidad):

 Acoplamiento spin-spin: el spin de cualquier núcleo A que esté covalentemente unido a

X actúa como un pequeño imán que hace que los electrones que están entre A y X
circulen. Esa corriente inducida altera el campo magnético en la vecindad del núcleo X.
Se dice que A y X están acoplados por spin. La señal solo es detectable cuando los
núcleos que decimos q están acoplados están separados como mucho 3 veces (si están
separados el acoplamiento es despreciable)

 Efecto Nuclear Overhauser (NOE): cualquier cambio en el estado spin del núcleo X
producido por cualquier cambio en el spin de A. Tiene que ocurrir que las interacciones
sean de tipo dipolares. No tienen por qué estar unidos covalentemente, detecta que dos
núcleos están suficientemente próximos en el espacio.

En el caso de proteínas, conviene hacer une espectro para observar el espectro acoplamiento
spin-spin por un lado y efecto Overhauser por otro lado. Se llama COSY a los espectros RMN
donde se mira spin-spin y NOESY los de efecto Overhauser.

 COSY (espectroscopia de correlación): da señales que

corresponden a átomos de H que están conectadas
covalentemente a través de uno o dos otros átomos
(dos o tres enlaces covalentes). Revela interacciones
dentro del mismo residuo y son diferentes para
diferentes cadenas laterales. Estas señales dan, por
tanto, una "huella digital" (flechas rojas) de cada
aminoácido.
 NOESY (NOE Spectroscopy): dan señales que corresponden a los átomos de H que están
muy juntos en el espacio (<5 Å), a pesar de que puedan estar muy lejos en la secuencia
de aminoácidos.

11
Combinando la información de un COSY y un NOESY se puede resolver una proteína si es
pequeña. Se conocen las señales COSY que producen los aminoácidos, siendo como una especie
de huella digital. Lo mismo ocurre en NOESY con estructuras de hélices y láminas. En las
proteínas suelen ser más útiles las NOESY.

Para proteínas grandes esta técnica no funciona muy bien. Cuando una proteína tienen más de
100 residuos hace falta recurrir a otro tipo de núcleos, se marcan isotópicamente las proteínas
y luego se hace el espectro (C o N normalmente). La combinación de señales de distintos tipos
de átomos también da información relevante.

El resultado final de un espectro de RMN es una

lista de las limitaciones de distancia o cotas
para cada uno de los átomos en un residuo.

Esto da lugar a un conjunto de estructuras

posibles que encajan en las cotas que limitan la
posición de los átomos.

Más mediciones permiten reducir limitaciones

y, por tanto, menos ambigüedad en las
estructuras, pero la similitud entre todos ellos
dependerá en última instancia de la flexibilidad
de proteínas.

La ventaja de MRN es que como no es

necesario formar cristales trabaja con las
proteínas en disolución. Esto introduce un
problema. En disolución las proteínas se
mueven más (no hay restricción de
empaquetamiento como en el cristal). A la
hora de establecer las cotas de distancia va a
haber regiones de la proteína donde habrá
cierta ambigüedad.

Cuando se representa MRN de una proteína

siempre veremos superposiciones de varias
cadenas. A veces se superponen, pero hay
partes que no (como suele pasar en las colas)

Microscopía crioelectrónica (Cryo-EM)

Esta técnica está creciendo muchísimo en los últimos años y está llamada a sustituir a la
cristalografía de rayos X. Permite la visualización de los conjuntos biológicos con una resolución
que abarca desde una escala macromolecular (~ 30 Å) a casi atómica (~ 2 Å).

Muchas de las restricciones de la cristalografía de rayos X o RMN no se aplican a la Cryo-EM, el

orden cristalino es útil pero no es necesario, no hay límite superior de tamaño para las
estructuras estudiadas, y además permiten la observación de moléculas en su ambiente acuoso
nativo.

12
En la Cryo-EM una muestra biológica acuosa se
congela rápidamente y se irradia con un haz de
electrones. Un detector registra en diferentes planos
cómo se dispersan los electrones. Finalmente un
ordenador reconstruye la forma 3D de la molécula a
partir de un gran número de proyecciones planas de
las estructuras

Si los sistemas estudiados con la Cryo-EM son muy

grandes y simétricos facilitan el proceso de
reconstrucción de imágenes 3D.

Debe enfriarse rápidamente para proteger la muestra frente a la radiación. La muestra da

imágenes en distintas proyecciones planas. Se recombinan las transformadas de Fourier de las
imágenes 2D, y sale una reconstrucción 3D de Fourier que luego puede devolver la imagen del
objeto original.

En los años recientes ha habido

avances espectaculares. Se ha
realizado por ejemplo la
reconstrucción del 80S humano,
permite incluso detectar interac-
ciones en las que hay muchas
moléculas involucradas (se puede
hacer por cristalografía de rayos X
pero es muchísimo más lento).

Se pueden calcular mapas de

densidad electrónica y cuando se
compara con uno análogo de
cristalografía en ambos casos se
ven detalles a nivel atómico

La capacidad de esta técnica se ve claramente en la

determinación de estructuras de proteínas transmembrana, ya que estas no se pueden
cristalizar en general por su marcado carácter hidrofóbico.

Protein Data Bank

Banco de datos en el que están depositadas todos los datos de estructura de proteínas
(macromoléculas en general).Posee 3 sitios de distribución el de EEUU (RCSB), el de Europa y el
de Japón, con acceso a la misma información

El número de estructuras validadas aumenta muchísimo cada año, sin embargo esto no es así si
lo que se mira es el número de topologías distintas que se registran cada año, en este caso
parece estar llegándose al límite posible.

Si el PDB valida una estructura le da a la proteína un código compuesto de 4 caracteres, el

primero es número y el resto puede ser alfanumérico. No guarda ninguna relación con la
proteína, este código da para 466560 estructuras.

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