EXTRACCIÓN, EVALUACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y AMPLIFICACIÓN DEL

ADN DE “SACCHAROMYCES CEREVISIAE”

1Agredo Steven, 2Olarte María Alejandra

1steven.agredo00@usc.edu.co 2maría.olarte01@usc.edu.co

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de

Biología Celular y Molecular, Programa de Microbiología

Profesor Mauricio Ramírez

Santiago de Cali, Colombia
Mayo 29 de 2019A

RESUMEN:
Es esencial dentro de la biología celular y molecular efectuar la extracción del ADN
y observarlo de manera macroscópica con fin de resolver problemas genéticos de
humanos y animales, mejoramiento de razas (animales) y variedades, pero esta
práctica no tiene ese final, esta práctica fue realizada con fines educativos para
adquirir habilidades y destreza a fin de realizar correctamente las técnicas para la
extracción de ADN y poder ser cuantificado; Esta práctica fue elaborada de manera
conjunta en tres diferentes sesiones que en general involucran la extracción,
evaluación de cantidad-calidad y cuantificación del ADN de “Saccharomyces
cerevisiae”, utilizando las técnicas de amplificación (región ITS1-ITS2), PCR,
electroforesis y espectrofotometría. En la primer sesión se extrajo el ADN de
levadura seca activa y pigmentada, la cual fue preparada anteriormente con SDS
(dodecilsulfato sódico) el cual nos ayudó a desnaturalizar el ADN, Isopropanol,
etanol, acetato de potasio, buffer T.E que nos ayudaron a solubilizar el ADN,
posteriormente se almacenaron en tubos eppendorf a 20°C temperatura; En la
segunda sesión se evaluó la calidad y cantidad del ADN por medio de
espectrofotometría UV, para el desarrollo posterior de PCR. Se obtuvo como
resultado

PALABRAS CLAVES:
ADN, Levadura, cuantificación, amplificación, PCR.
INTRODUCCION
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
En la tabla 1. La cual nos da la cuantificación del ADN de “saccharomyces cerevisiae” para
nuestra primera muestra (M1) se obtuvo la absorbancia a 260= 0,332 ng / µl, la absorbancia
a 280=0,159 ng / µl y la proporción A260/A280= 2,09 ng / µl nos muestra evidentemente una
contaminación, al igual que nuestra muestra 2 (M2), ya que nuestras muestras tienen una
proporción A260/A280 mayor a 1.8 ng / µl.

MUESTRA CONCENTRACION UNIDADES A260 A280 A260 /

DE ACID. NUC. NANOGRAMOS/MICRO A280
LITROS
Control 0,1 ng / µl 0,002 -0,008 -0,28
(+)
M1 16,6 ng / µl 0,332 0,159 2,09
M2 22,8 ng / µl 0,456 0,200 2,28
Tabla 1. Cuantificación ADN

M2 muestra mayor concentración en

la tabla 1, pero en la figura 1 se
contrarresta esta información
tabulada, debido a que evidentemente
la barra no se ve bien marcada.
En la figura 1 podemos observar que
M1 muestra una barra de color verde
fluorescente poco iluminada,
comparada con nuestro control
positivo, mostrada por Sybr Green.

Figura 1. Resultado de PCR.

El ADN puro tiene una relación A260 /
A280 de 2.0, por lo tanto, si una
muestra de ADN tiene una proporción
A260 / A280 mayor que 1.8, esto
podría sugerir una contaminación por
ARN. Sin embargo, debido a la
similitud en los perfiles de absorción
de ARN y ADN, probablemente la
forma más precisa de determinar la
contaminación por ADN es hacer
funcionar la muestra en un gel de
agarosa donde se verá claramente
que el ARN migra delante del ADN. [1]
El SDS (Dodecilsulfato sódico) actúa
rompiendo enlaces no covalentes en
las proteínas, desnaturalizándolas,
provocando que estas moléculas
proteicas pierdan su conformación
nativa. Esto ocurre porque el SDS se
une a las zonas apolares del
polipéptido.[2]
El tampón TE es una solución tampón
de uso común en biología molecular,
especialmente en procedimientos que
involucran ADN, ADNc o ARN. "TE" se
deriva de sus componentes: Tris, un
tampón de pH común, y EDTA, una
molécula que quela cationes como Mg
2+. El propósito del tampón TE es
solubilizar ADN o ARN, mientras se
protege de la degradación.[3]
Las principales técnicas de
identificación de levaduras están
basadas en la aplicación de métodos
de biología molecular como la PCR
(Reacción en cadena de la
polimerasa), permitiendo resultados
más específicos, extremadamente
sensibles y en corto tiempo.[4]
El factor de dilución del ADN
dependerá de la intensidad de la
banda observada en el gel de
agarosa; Un valor obtenido de
aproximadamente 1.8 es considerado
puro para ADN Si es menor hay
contaminación con proteínas, fenoles
u otras sustancias que absorben en
una longitud de onda cercana a
280.[5]
En la técnica de electroforesis, el
SYBR Green representa una
alternativa como tinte al bromuro de
etidio, ya que es hasta 100 veces más
sensible que éste y mucho menos
perjudicial para la salud.[6]
La espectrofotometría UV/Visible nos
permite confirmar que contamos con
cantidad suficiente de ácidos
nucleicos (DNA/RNA) de calidad
adecuada antes de llevar a cabo
ensayos de PCR cuantitativa en
tiempo real (QRTPCR), análisis de
SNPS (Polimorfismos de nucleótido
único) o la secuenciación automática
demuestras de DNA de plásmidos,
cósmidos, productos de PCR.[7]
El NanoDrop es un espectrofotómetro
de espectro total (220-750nm) que
mide concentraciones con 1 µl de
muestra, con gran exactitud y
reproductibilidad. Utiliza una nueva
tecnología que usa la tensión
superficial para mantener la muestra
en su sitio y se eliminan las cubetas de
mesura. Además, el ND-1000 tiene la
capacidad de medir muestras muy
concentradas, sin necesidad de
diluirlas (acepta 50X más de
concentración que las medidas
estándares con cubetas). Esta
característica lo hace idóneo para
medir la concentración de ácidos
nucleicos y para determinar su
cualidad. El software calcula
automáticamente la concentración de
los ácidos nucleicos siguiendo la
relación: 1 A260nm = 1 OD DNA = 50
µg/ml. 1 A260nm = 1 OD RNA = 40
µg/ml. [8]
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
[1] El factor de dilución del ADN
dependerá de la intensidad de
la banda observada en el gel de
agarosa.

[2] A. Nassif, S. C. Chan, F. J. Storrs

and J. M. Hanifin. Abstract:
Abnormal skin irritancy in atopic
dermatitis and in atopy without
dermatitis. Arch Dermatol.
November 1994;130(11):1402.

.[3] Krebs, JE Goldstein, ES y

Kilpatrick, ST, 2009. Genes X de
Lewin, 10ª ed. Jones y Bartlett.

[4] Berg, JM, Tymoczko, JL &

Stryer, L., 2006. Stryer
Biochemistry, 4ª ed. WHFreeman
& Co Ltd.

[5] Dawson, RMC Elliot, DC, Elliot,

WH y Jones, KM, 1989. Data for
Biochemical Research , 3ª ed.
Prensa de la Universidad de
Oxford.
[6] Ross; Haites, Kelly (1990).
"Repetición de congelación y
descongelación de ADN en
suspensión: efectos sobre el
rendimiento y la integridad del
ADN”. Revista de Genética
Médica. 27 (9): 569
[7] Molinari HB, Crochemore ML.
Extração de DNA genômico de
Passiflora spp para análisis PCR-
RAPD. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal - SP
2001; 23 (2): 447- 450.
[8] Nanodrop 1000 | Servei
Genòmica Bioinformàtica
Sct.uab.cat.