REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA “PCR”

MIGUEL MONTALVO MEJÍA

DEIMER VITOLA ROMERO

DOCENTE: KILIANY ARCIA

ÁREA DE BIOLOGÍA MOLECULAR

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

SINCELEJO – SUCRE

2012
 CUESTIONARIO

1. ¿CUÁLES SON LOS DIFERENTES TIPOS O VARIANTES DE LA

TÉCNICA DE PCR Y DESCRIBA LA DIFERENCIA O MODIFICACIÓN A
LA TÉCNICA INICIAL?

TIPOS DE PCR
PCR anidada: técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una
amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con
cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir,
cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de
nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene
la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta
porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los
cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será
una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los
cebadores. La desventaja de ésta técnica es que no nos permite cuantificar la
muestra.
PCR in situ: consiste en una reacción de PCR ensecciones histológicas o células,
donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in
situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección
mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta
manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología
es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente
una población de secuencias de menor representación.
PCR múltiple: en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia.
Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto
con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para
amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: información
sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis,
menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Es una variante de la PCR en la que
usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa
inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN
(ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
 2er paso: aplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
 3er paso: PCR estándar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR): es la reacción de PCR cuya
principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN
presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad,
muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también
denominado valor Tm, del inglés melting temperature).
PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para
identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).

PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN,

realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias
solapantes cortas.

PCR asimétrica: no es usada para amplificar preferentemente una cadena del

ADN original con respecto a la otra.

PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia

coli pueden ser rápidamente examinadas para construcciones viables
de vectores de ADN.

Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR

convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura
constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de
desnaturalización-extensión.

PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las

etapas iniciales de la PCR: mientras que la máquina alcanza la temperatura de la
primera etapa (unos 95º) puede que ocurra la unión de los cebadores y se
produzca amplificación, ya que en el camino para alcanzar estos 95º se pasa por
la temperatura de anillamiento (que es más baja).
Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reacción comience cuando la
máquina ya esté a 95º, debido a que antes no se encuentran presentes la
polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias
técnicas:

 Añadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de

calentamiento.
 Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reacción. La
cera se funde al alcanzar los 95º y es entonces cuando los componentes
entran en contacto.
 Anticuerpos anti-polimerasa que estén bloqueando a la polimerasa. Al
alcanzar los 95º estos anticuerpos se inactivan debido a que se
desnaturalizan y la polimerasa puede actuar.

PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para

su uso en huella genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia
simple para producir una huella genética única de longitudes de fragmento
amplificadas.
PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es
conocida una secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que
flanquean insertos genómicos.

PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al
ADN de interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers.

PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas

CpG de ADN genómico.

Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con
un único par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR
multiplex.

PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la

técnica clásica de PCR, se cuantifica por aproximación con diluciones y
amplificación de concentraciones conocidas de la secuencia diana. También se
puede cuantificar por método competitivo: se trabaja con concentraciones
crecientes conocidas de un fragmento que puede ser amplificado por los mismos
oligos que la muestra de estudio, pero de menor tamaño que ésta, de forma que
con los resultados obtenidos se puede estimar qué concentración del competidor
es equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificación en
PCR está optimizada en la técnica de PCR en tiempo real.

PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una

secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.

PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se

desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de
modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el
alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no específico
bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de la
PCR.

PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede

ser usado en células vivas.

DIFERENCIA O MODIFICACIÓN A LA TÉCNICA INICIAL:

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al
realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas
en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases
de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda
proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas
de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la
mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son:
Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de
polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de
errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado
termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.

2. EN LA PRÁCTICA, LA PCR PUEDE FALLAR POR VARIAS RAZONES,

PERO NORMALMENTE ES DEBIDO A SU SENSIBILIDAD A LA
CONTAMINACIÓN, QUE A VECES PROVOCA LA AMPLIFICACIÓN DE
ADN "FALSO". ¿QUE TÉCNICAS O PROCESOS SE HAN
DESARROLLADO PARA OPTIMIZAR LA PCR?

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, aunque se puede optimizar
ésta técnica. Entre las fallas encontramos:

 La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima

cantidad de ADN para obtener un gran número de copias, así que puede
ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas
de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no
correspondiente a la muestra a analizar. La contaminación con ADN
extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen
espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de
trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en
laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para la
preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro
donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen también
de cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de
amplicones de enfermedades, y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos
son también muy recurridos para esta limpieza extensiva.
 Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la
obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos
falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:
Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn).
Normalmente, se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy
cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se
excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1
(40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas.
 Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la
secuencia, evitando los poli T/A/G/C.
La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5ºC.
Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean
complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.

 Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la

que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen
actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o
funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se
desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las más habituales son la taq y la
pfu.
 Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las
exigencias de nuestras enzimas.
 El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir
correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales
nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más
eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas
facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y
ubicación será clave.

3. ¿EN QUE CONSISTE LA PCR EN TIEMPO REAL (Q-PCR)?

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR): su principal característica es

que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original,
o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a
partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del
inglés melting temperature).
Se puede dividir en dos técnicas:
1. Técnica basada en fluorocromos no específicos.
2. Técnica basada en sondas específicas.
TÉCNICA BASADA EN FLUOROCROMOS: en esta el ADN, que ve multiplicada
su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green)
produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en
tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción pero tiene
la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más
económica que la que usa sondas específicas.
TÉCNICA BASADA EN SONDAS ESPECÍFICAS: utilizan una sonda unida a dos
fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y
el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia
energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce
cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de
la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el
cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.
La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la
PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR
puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que
ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la
acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR
esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma
que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se
puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación
(termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.

4. ¿CUÁLES SON LAS PRINCIPALES APLICACIONES EN LA

ACTUALIDAD DE ESTA TÉCNICA Y EN QUE CAMPOS?

La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como

herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de
interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo
en diagnóstico clínico.

APLICACIÓN EN INVESTIGACIÓN:
La PCR convencional, se emplea como base para multitud de técnicas en el
laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final
permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés.
Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que
contienen una secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido.
Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias
de ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean
cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la
interacción posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a
emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos
cebadores, de modo que, y si ésta no existía previamente en el fragmento y es
única en el vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la
digestión con la enzima de restricción apropiada de ambos elementos. Otro
método asimilable a esta vía es el empleo de la recombinación dirigida; esto es, se
adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la
recombinación dirigida con un vector dado.
APLICACIÓN EN MEDICINA:
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta
de diagnosis:

 Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado

cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano
cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o
temperatura de fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el
caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del
patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la
PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por
tanto, del estadio de la enfermedad.
 La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en
los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta
técnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH
o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la
sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o
"pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras
colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente
menores hasta que se encuentra el causante.
 El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un
proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias
a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante
sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar
la existencia de mutaciones.

APLICACIÓN EN PALEONTOLOGÍA Y ANTROPOLOGÍA:

la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que aún no se han
degradado. Algunos lugares en que el ADN podría preservarse son
la brea las cenizas volcánicas, el ámbar, hielos históricos polares o glaciares y
ambientes áridos, sedimentos, así como en los cristales de apatita de restos
de esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadáveres, fósiles u otros
restos mediante genotipado por análisis de microsatélites o incluso genomas
de taxonesextintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados
mediante el ADN genómico del hombre de Neanderthal. El propósito sería utilizar
este ADN amplificado para posteriormente realizar
estudios filogenéticos o etnográficos o de poblaciones mediante la comparación de
secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separación evolutiva de dos
especies.
EN LAS CIENCIAS FORENSES:

se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener pruebas a

partir de muestras mínimas dejadas por el autor de
un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos.

AGRONOMÍA Y DIVERSIDAD:
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos
concretos, dentro del marco de la genética forense, existen métodos basados en
la PCR que permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés
agronómico; por ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucleótidos de
un tamaño lo suficientemente pequeño como para que ceben de forma
relativamente inespecífica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón
de bandas discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la
electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor
semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen.

BIBLIOGRAFÍA

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