Metodología:

Esta investigación está basada en el método de investigación experimental con la finalidad de

analizar y comparar cepas de microalgas nativas para fitorremediación de pasivos ambientales
(relaves).
A partir de este método científico de investigación, se obtiene la caracterización de cepas
tolerantes a metales pesados, en base a la experimentación que consistió en tomar una muestra
de relave de la mina metálica, caracterizar las microalgas, cultivar las microalgas, determinar
sus capacidad fitorremediadora y finalmente optimizarla para uso de biofertilizante.
Para lograr este resultado de detalla la metodología utilizada:

1. Muestreo de relave:
Se toman muestras de relave y se determina la composición de metales pesados.
REQUERIMIENTOS

 Pala
 Cortador metalúrgico
 Recipientes de plástico de 8 lt de capacidad
 Guantes
 Cubre bocas
PROCEDIMIENTO
Para determinar qué metales están presentes en la muestra, utilizaremos un laboratorio
externo especializado.

2. Muestreo de microalgas
Se evalúan microalgas tolerantes a medios con presencia de metales pesados.
REQUERIMIENTOS

 Microscopio óptico
 Aceite de inmersión
 Cubreobjetos
 Portaobjetos
 Pipetas
PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos agregar una gota (10 µL) de cultivo y colocar un cubreobjetos.
Observar la preparación al microscopio, si la imagen no es muy clara agregar una
gota de aceite de inmersión y observar a 50X.
2. Observar morfología y características generales (plastos, pirenoides, presencia de
espinas o espículas, flagelos, estructuras de resistencia, acinetos, heterocistos, etc.)
3. Empleando las claves dicotómicas para identificación de algas sabremos qué
tipos de microalgas existen en el relave en estudio.
3. Análisis de nutrientes:
REQUERIMEINTOS
Para el análisis de nitrógeno amoniacal (N-NH4 + ), nitrito (N-NO2 - ), nitrato (N-NO3 - )
y fosfato (P-PO4 -3) se necesita:

 Analizador discreto automático de Westco Scientific Instruments: Smartchem 200

(Analyzer Medical System).
Determinación de demanda química de oxígeno (DQO)
La DQO se determina mediante el método colorimétrico, para lo cual se empleará:

 Espectrofotómetro de UV/VIS: Spectroquant® Pharo 300 con un rango de

longitudes de onda 190-1100, lámpara y +- 1 nm de precisión.
Determinación de sólidos suspendidos
Se emplea la metodología gravimétrica propuesta por Standard Methods (ME 2540-D). La
concentración de sólidos suspendidos totales (SST) se determina así mediante la
eliminación de la humedad a 105ºC de una muestra filtrada
MUESTREO Y PRESERVACION DE LA MUESTRA
La muestra se debe recolectar en botellas de vidrio o plástico de 1 L de capacidad.
Refrigerar la muestras a 4ºC.
Analizar antes de 24 horas de preferencia, como máximo 7 días de realizado el muestreo.
EQUIPOS Y MATERIALES

 Filtros de fibra de vidrio: Whatman 934 AH o Gelman A/E o Milipore AP 40.

Preferentemente de 4,7 cm de diámetro.
 Equipo de filtración por vacío: embudo de membrana filtrante, preferentemente de
4,7 cm de diámetro, frasco de succión de suficiente capacidad para la muestra,
trampa de agua, bomba de vacío.
 Estufa para operar a 103-105ºC.
 Mufla para operar a 550 ± 50ºC.
 Desecador conteniendo un desecante con indicador coloreado de humedad.
 Balanza análitica de precisión 0.1 mg.
 Probetas
PROCEDIMIENTO
Preparación del papel de filtro:
Colocar el filtro en el embudo de filtración. Aplicar vacío y enjuagar con tres porciones de
20 mL de agua destilada. Continuar la succión hasta eliminar totalmente el agua. Secar en
estufa 103-105ºC por 1 hora en un soporte de porcelana o similar. Si se va a determinar
volátiles muflar por 15 min.a 550 ºC, enfriar en desecador y pesar. Repetir el ciclo de
muflado, enfriado y pesado hasta peso constante.
Determinación:
a) Una vez que se obtuvo el peso constante del filtro, pesarlo inmediatamente antes de
usarlo. Colocar el filtro en el embudo de filtración, mojar el filtro con una pequeña
cantidad de agua destilada.
b) Tomar un volúmen de muestra homogeneizada que de un residuo seco entre 2.5 y
200 mg. Verter el volumen medido en el embudo de filtración. Comenzar la
 succión. Lavar 3 veces sucesivas con 10 mL de agua destilada cada vez,
permitiendo un completo drenaje en los lavados. Continuar la succión por 3
minutos hasta que la filtración sea completa.
c) Remover el filtro y colocarlo sobre un soporte de porcelana. Secar por 1 hora a103-
105ºC en estufa, enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir
el ciclo de secado, enfriado, y pesado hasta peso constante o hasta que la pérdida
de peso sea menor que el 4% del peso previo o 0.5 mg.
d) Colocar el filtro anterior en la mufla a 550 ± 50ºC durante 1 hora. Enfriar en
desecador y pesar. Repetir la secuencia hasta obtener peso constante o hasta que la
pérdida de peso sea menor que el 4% del peso previo o 0.5 mg.

CALCULOS Y EXPRESION DE RESULTADOS

SST , mg / L 
 P2  P1  1000
V
 P  P  1000
SSF .mg / L  3 1
V
SSV , mg/ L  SST  SSF

SOLIDOS SUSPENDIDOS TOTALES

Donde:
SST = sólidos suspendidos totales en mg/L. SSF = sólidos suspendidos fijos en
mg/L.
SSV = sólidos suspendidos volátiles en mg/L.
P1 = peso del filtro preparado en mg.
P2 = peso del filtro más el residuo seco a 103-105ºC en mg.
P3 = peso del filtro más el residuo calcinado a 550 ºC en mg.
V = volumen de muestra tomado en mL.

4. Determinación de fósforo total

Para la determinación de fósforo total de las muestras se realiza una digestión ácida previa
mediante la cual los polifosfatos y el fósforo orgánico son convertidos a ortofosfatos.
TOMA Y PRESERVACIÓN DE LA MUESTRA
Colecte las muestras en envases de plástico ó vidrio y presérvelas con ácido sulfúrico
concentrado hasta un pH < 2. Las muestras así preservadas tienen un tiempo máximo de
espera para el análisis de 28 días.
REQUERIMIENTO DE EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES
EQUIPOS
  Espectrofotómetro UV-VIS marca Hewlett Packard modelo 8453, detector de
arreglo de diodos, ancho de banda de 0.1 nm, provisto de una celda de vidrio con
paso de luz de 1.0 cm, y consta de lo siguiente:
 Sistema óptico revertido de haz sencillo.
 Fuente de radiación, la lampara de tungsteno.
 Monocromador
 Detectores fotodiodos y a su vez arreglo de diodos.
 Plancha de calentamiento Schott Ceran ó Thermolyne Cimarec2
 Balanza analítica electrónica con aproximación de 0.0001 g.
 Cabina extractora para vapores inorgánicos.
REACTIVOS

 Agua Ultra Pura, obtenida mediante un purificador Labconco WaterPro PS.

 Ácido sulfúrico, H2SO4, concentrado.
 Ácido nítrico, HNO3, concentrado.
 Fenolftaleína en solución alcohólica: Disuelva 1 g de fenoftaleína en 100 mL de
alcohol etílico y adicione 100 mL de agua ultra pura.
 Hidróxido de sodio, NaOH, 6 N. Disuelva 240 g de NaOH en un vaso de
precipitado de un litro, lleve a temperatura ambiente y complete a un litro con agua
ultrapura, en un balón clase B.
 Ácido sulfúrico, H2SO4, 5N: Ácido sulfúrico, H2SO4, 5N: En un vaso de
precipitado de 400 mL, agregue 200 mL de agua ultra pura y adiciónele lentamente
70 mL de H2SO4 concentrado, como se produce una reacción exotérmica, espere
hasta que se enfríe la solución, en ese momento transfiera cuantitativamente la
solución a un balón de 500 mL y complete con agua ultrapura. Mantenga en frasco
de vidrio a temperatura ambiente.
 Solución de tartrato de antimonio y potasio: Disuelva 0.6858 g de
K(SbO)C4H4O6⋅½H2O en 200 mL de agua ultra pura, en un balón aforado de 250
mL lleve a volumen. Almacene a temperatura ambiente en frasco de vidrio, por un
período de tiempo no mayor de 3 meses. No utilice este reactivo después del
tiempo recomendado, ya que forma un precipitado azul en la muestra que se va a
analizar, minutos después de adicionar el reactivo combinado, registrando valores
más bajos en los resultados. Refrigerar.
 Solución de molibdato de amonio: Disuelva 20 g de Heptamolibdato de amonio
tetrahidratado, (NH4)6Mo7O24⋅4H2O en 500 mL de agua ultra pura. Almacene
refrigerado en frasco de vidrio, por un período de tiempo no mayor de 6 meses.
Este reactivo puede formar un precipitado blanco con el tiempo, que no interfiere
en la calidad del análisis. Agite muy bien antes de utilizarlo.
 Ácido ascórbico, 0,1 M: Disuelva 1,76 g de ácido ascórbico en 100 mL de agua
ultra pura. Guarde en frasco de vidrio ámbar, esta solución es estable por cerca de
una semana, refrigerada a 4°C.
 Reactivo combinado: Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura
ambiente antes de agregarlos. Mezcle los siguientes reactivos en estricto orden y
proporciones, agitando después de la adición de cada uno de los reactivos, para 100
mL de reactivo combinado:
 50 mL de H2SO4 5N
 5 mL de solución de tartrato de antimonio y potasio
 15 mL de solución de molibdato de amonio
 30 mL de solución de ácido ascórbico. Si prepara este reactivo en un
recipiente de vidrio transparente se puede observar una coloración amarilla
 que indica que quedó bien preparado. Si nota algo de turbidez, agite y deje
en reposo por unos minutos hasta que ésta desaparezca. Este reactivo es
estable por 4 horas.
 Solución patrón de fosfato de 50 mg(P-PO4)/L: Coloque 0.25 g de Fosfato diácido
de potasio también denominado Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 grado
analítico, a secar a 105°C durante dos (2) horas. Disuelva en agua ultra pura 0,2195
g de KH2PO4 anhidro y diluya a 1000 mL en balón volumétrico. Almacene en la
nevera a 4 °C en frasco de vidrio perfectamente rotulado. 1,00 mL = 50,0 µg
PO43–-P.
MATERIALES

 Balones aforados clase A de 250, 200, 100 y 50 mL.

 Balones clase B de 100 y 1000 mL
 Erlenmeyers de 200, 250 y 100 mL.
 Pipetas aforadas clase A, de 1, 2, 5, 10, 20, 25 y 50 mL. Pipetas volumétricas de 5
y 10 mL Probetas plásticas de 50 mL y 25 mL.
 Pipeta pasteur.
 Embudo de vidrio pequeño
 Soporte para filtración
 Celda de vidrio.
 Papel para limpiar lentes.
 Microespátula.
5. Identificación de las poblaciones microbianas
La técnica empleada para la identificación de las bacterias nitrificantes y metano tróficas ha
sido el método FISH, o de hibridación fluorescente in situ. El método se describe en Borrás
(2008). Se utilizaron sondas generales para la identificación y seguimiento microbiológico
de las bacterias.
6. Optimización de microalgas

7. Análisis cromatográfico
Uno de los análisis más utilizados para caracterizar el perfil lipídico de una muestra es la
cromatografía de gases. Se basa en la técnica de separación por elución en solventes y en el
principio de que las moléculas, según sus características, PM y polaridad varían en el
tiempo hasta que llegan al detecto ( López 2008)
La muestra se volatiliza y se inyecta en una columna cromatografica de elución, es
generada por flujo de una fase móvil de un gas inerte, para este caso hidrógeno o helio
Para el perfil lipídico de grasas y aceites, la muestra problema debe tener únicamente
fracción lipídica.