Práctica Microcultivo

Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Microbiología General II.
Práctica No. 4: Microcultivo.
Presentan:
Aguilar Galena Mayra Jacqueline.
Hernández Hernández Lucero.
Méndez Zapiain Arturo.
Romero Sedglach Kevin Axel.
Equipo: 9. Grupo: 1702.
Asesor Titular: Q.F.B. Manuel Orduña Sánchez.
Ciudad de México, 11 de octubre de 2019 Laboratorio de Microbiología General II.

Objetivos
Objetivos:
Ser capaz de realizar la técnica de

microcultivo.
Entender la eficacia de un microcultivo para

identificar y clasificar un hongo filamentoso.
2
Ciudad de México, 11 de octubre de 2019 Laboratorio de Microbiología General II
Generalidades
Morfología colonial o macroscópica
Morfología microscópica
Reproducción
IDENTIFICACIÓN
DE Microcultivo
HONGOS:
Composición de la pared celular
Pruebas metabólicas (levaduras)
Nutrición
3
Generalidades
MORFOLOGÍA
MICROSCÓPICA:
Estructura
Esporas
Hifas
4
Generalidades
Hongos filamentosos
5
Técnicas Técnicas para la observación microscópica de hongos:
Disgregación
Montaje
Cinta adhesiva
(Rush-Munro)
Técnicas Gota
pendiente
Cultivo Emparedado
*Lamina
Microcultivo
desecada
6
Técnicas Preparación por disgregación (montaje húmedo o en fresco):
Tomar una Disgregar la

Colocar una gota Presionar
muestra del muestra en la
pequeña de levemente y
hongo con ayuda gota de colorante
colorante en un observar a 10x y
del asa y colocar un
portaobjeto. 40x.
micológica. cubreobjetos.
Penicillium sp
7
Técnicas
Utilidad:
 El método más rápido para la detección de estructuras fúngicas.
 Puede aportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo y en otras, un diagnóstico
de sospecha previo a la confirmación definitiva por cultivo.
Ventajas Desventajas
Puede sufrir algún

Fácil de realizar. traumatismo las estructuras
fúngicas.
Rápida.
Económica.
8
Técnicas Preparado por cinta adhesiva “Scoth” (Rush-Munro):
Con un pedazo Pegar la cinta

Colocar un gota de cinta sobre la gota en
pequeña de adhesiva, tomar el portaobjetos, Observar a 10x y
colorante en el una muestra* de eliminar el 40x.
portaobjetos. la colonia de los exceso del
hongos. colorante.
Aspergillus sp
9
*Entre la parte central de desarrollo y la periferia de desarrollo del hongo.
Técnicas
Utilidad:
 Conserva las características de agrupamiento de las esporas de algunos hongos
más delicados.
El resultado depende
Fácil de realizar. completamente del
operario.
Rápida.
Depende de la madurez
del hongo.
Económica.
Depende de la forma
Mantiene la estructura del adecuada de aislamiento.
hongo.
Identificación 10
relativamente precisa.
Técnicas Técnica de gota pendiente:
*Limpiar el cubreobjetos. Realizarle un circulo de

vaselina (con un palito de madera) y colocar una
gota pequeña de colorante.
Se inocula una asa con el hongo y se coloca en la

gota de colorante.
Colocar el portaobjetos encima del cubreobjetos.
Invertir la preparación y observar a 10x y 40x.
*NOTA: Una alternativa de la técnica y considerada por muchos autores

como la más adecuada es usar un cubreobjetos con un pocillo y ahí colocar
caldo y realizar la colocación de la muestra.
11
*Covadonga VSM, Silóniz MSS. Técnicas básicas de microbiología. Observación de bacterias y hongos. Red(Bio)Microbio. 3(5):15-38, 2010. ISSN: 1989-3620.
Técnicas
Utilidad:
 La gota permite multitud de planos de enfoque.
 Exenta de las fluctuaciones provocadas por las corrientes liquidas que se generan entre el
portaobjetos y cubreobjetos.
 Permite observar la evolución en el desarrollo del hongo (cuidando las condiciones de humedad y
temperatura).
Evita que se seque. Lenta.
Protege a la muestra del aire. De preparación cuidadosa.
Visualización de la formación de
esporas.
12
Técnicas Técnica de emparedado:
Retirar los
Colocar una
cubreobjetos y
Introducir un gota de
Colocar de 3-8 colocarlos sobre
cubreobjetos colorante sobre
fragmentos de Incubar de 7-15 un portaobjetos Observar a 10x
por cada uno en el cubreobjetos
hongos en una días a 25°C. que contiene y 40x.
un ángulo de ya montado y
caja Petri. previamente una
45°. colocar otro
pequeña gota de
cubreobjetos.
colorante.
Alternaria sp
13
Técnicas
Utilidad:
 Después del crecimiento del hongo se retira el cubreobjetos. De esta manera, los filamentos y
órganos de reproducción quedan unidos al cubreobjetos y al portaobjetos.
Buena observación de estructuras. Lenta.
Económica.
Se puede incubar más de una

muestra.
14
Técnicas Lamina desecada:
Fijar con alcohol,

colorear,
Sobre un Retirar el exceso
Depositar 5mL de deshidratar con
portaobjetos Sembrar en el de gelosa
agua en una caja etanol absoluto,
colocar gelosa centro e incubar. Saboraud y secar a
de Petri estéril. enjuagar con
Saboraud. 37°C.
tolueno y montar
en resina.
Fusarium sp
15
Técnicas
Utilidad:
 El hongo se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, lo que permite observar su
estructura intacta, así como su desarrollo.
Buena observación de estructuras. Lenta.
Económica.
16
Técnicas Microcultivo:
Permite la observación de las estructuras microscópicas de hongos filamentosos, que se

distinguen con facilidad sin distorsión, alteración o rompimiento de las mismas, esto pasa
cuando el hongo se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos.
17
Se emplea para:
 Identificación taxonómica.
 Estudios de ontogenia de los conidios.
 Preparaciones permanentes útiles en la enseñanza.
 Como apoyo para las identificaciones diferenciales.
 Obtención de material para micrografías (normal y

electrónica).
18
Medios de cultivo usados:
PDA
Extracto de malta
Agar Borelli
Agar Saboraud
Agar Czapek
19
Colocar un trozo circular de

papel filtro sobre el fondo de una
caja de Petri estéril. Colocar un
par de varillas (o triángulo) de
vidrio dentro de la caja y encima
de este dispositivo colocar un
portaobjetos.
20
En condiciones estériles,
cortar un cubo (o cilindro)
de agar PDA o Saboraud
(apróx. 1.5 cm diámetro) y
colocarlo sobre la superficie
del portaobjetos.
21
Inocular (a partir de los

hongos aislados) en 4
ejes del borde del medio
de cultivo [que sea
visible la inoculación].
22
Calentar un cubreobjetos con

suavidad pasándolo rápidamente
por una flama y colocarlo de
inmediato sobre la superficie del
agar (con el fin de fundir
parcialmente la superficie del agar
y obtener un sello hermético).
23
Agregar a la caja Petri

suficiente agua glicerinada
estéril (5 o 10%) para saturar
el papel filtro (con el fin de
humectar la preparación y
evitar desecación).
24
Cerrar la caja Petri e

incubar a temperatura
ambiente (o a 30°C) de 3
a 7 días.
25
Revisar diariamente el crecimiento

del hongo. Si se decide que esta
completa la maduración del cultivo
(extensión de 2/3 parte del
cubreobjetos), agregar de 1 a 3mL de
formaldehído al 10% o fenol, 30min
antes de la manipulación del
microcultivo.
26
Una vez inactivadas las esporas,

retirar con cuidado el
cubreobjetos y colocarlo en un
portaobjetos que tiene una gota
pequeña de colorante y observar
en microscopio con objetivo 10x
y 40x
27
Al portaobjetos se le
retira el agar y se deposita
en un vaso con fenol al
10%.
28
Aplicar una pequeña gota de

colorante al portaobjetos y
colocar encima un
cubreobjetos. Se observa al
microscopio.
29
Técnicas Microcultivo: Utilidad de los reactivos:
• Humectar la preparación y así evitar la

Agua- desecación.
glicerina
Formaldehido
• Inactivación de las esporas.
o fenol (10%)
• Se usa para la tinción directa de micelio micólico,

Colorante el cual toma un delicado color azul claro.
30
NOTA IMPORTANTE:
 Para Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis y Sporothrixs chenkii NO SE REALIZA EL

MICROCULTIVO *[Más que se tengan las condiciones de seguridad apropiadas]*.
Por el alto riesgo de contaminación por la inhalación o contacto de las esporas al destapar la caja
Petri.
31
Técnicas
Utilidad:
 El hongo se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, lo que permite observar su
estructura intacta, así como su desarrollo; esto permite determinar con exactitud género y
especie.
Los hongos se observan intactos. Laboriosa.
La mejor técnica para observar

De preparación cuidadosa.
estructuras.
Idóneo para identificar y clasificar No es diagnóstico rápido *para
hongos filamentosos. hongos patógenos*.
32
Técnicas
*Algunos autores hacen

mención también a
Recordar: Sólo si se
Nocardia sp y
tiene las condiciones
Streptomyces sp.
de seguridad adecuados.
*Kenneth JR, Ray CG. Sherris. Microbiología medica. 6ta ed. México: McGrawHill; 2017.
*Covadonga VSM, Silóniz MSS. Técnicas básicas de microbiología. Observación de bacterias y hongos. Red(Bio)Microbio. 3(5):15-38, 2010. ISSN: 1989-3620. 33
Metodología
Metodología de la practica:
34
Metodología
Importante:
Una gota PEQUEÑA

de colorante.
35
Aplicaciones
Aplicaciones en Q.F.B.
FARMACIA INDUSTRIAL
Control de calidad.
Desarrollo de antifúngicos.
Garantizan el uso seguro de los medicamentos.
BIOQUÍMICA CLÍNICA
Diagnostico de hongos patógenos.
Permite la identificación del agente etiológico.
Son útiles en la selección y monitoreo de la terapia antifúngica, seguimiento evolutivo y para confirmar la
curación.
FARMACIA HOSPITALARIA
Monitoreo de preparaciones parenterales.
Debido a que son preparaciones estériles, es necesario monitorear la proliferación microbiológica que
afectaría directamente al producto y la salud del paciente.
Tratamiento de enfermedades causadas por hongos.
36
Referencias:
1. Arenas R. Micología Medica. 3 ed. México: Interamericana McGrawHill; 2008.
2. Bonifaz A. Micología Médica Básica. 4 ed. México: McGrawHill; 2010.
3. Covadonga VSM, Silóniz MSS. Técnicas básicas de microbiología. Observación de bacterias y hongos.
Red(Bio)Microbio. 3(5):15-38, 2010. ISSN: 1989-3620.
4. Kenneth JR, Ray CG. Sherris. Microbiología medica. 6ta ed. México: McGrawHill; 2017.
5. Koneman E. Diagnóstico microbiológico. 5 ed. Argentina: Médica panamericana; 2003.
6. López MR. Micología Médica (Procedimientos para el Diagnostico de Laboratorio). 3 ed. México: Trillas; 2012.
7. Prats G. Microbiología Clínica. Argentina: Médica panamericana; 2006.
“POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU”

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Ciudad de México. 37
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Práctica No. 4: Microcultivo.
Presentan:
Aguilar Galena Mayra Jacqueline.
Hernández Hernández Lucero.
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Equipo: 9. Grupo: 1702.
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Práctica No. 4: Microcultivo.

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Ciudad de México, 11 de octubre de 2019 Laboratorio de Microbiología General II.

Ser capaz de realizar la técnica de

Entender la eficacia de un microcultivo para

Morfología colonial o macroscópica

Pruebas metabólicas (levaduras)

Tomar una Disgregar la

Puede sufrir algún

Con un pedazo Pegar la cinta

*Limpiar el cubreobjetos. Realizarle un circulo de

Se inocula una asa con el hongo y se coloca en la

Colocar el portaobjetos encima del cubreobjetos.

Invertir la preparación y observar a 10x y 40x.

*NOTA: Una alternativa de la técnica y considerada por muchos autores

Evita que se seque. Lenta.

Protege a la muestra del aire. De preparación cuidadosa.

Buena observación de estructuras. Lenta.

Se puede incubar más de una

Fijar con alcohol,

Buena observación de estructuras. Lenta.

Permite la observación de las estructuras microscópicas de hongos filamentosos, que se

 Estudios de ontogenia de los conidios.

 Preparaciones permanentes útiles en la enseñanza.

 Como apoyo para las identificaciones diferenciales.

 Obtención de material para micrografías (normal y

Medios de cultivo usados:

Colocar un trozo circular de

Inocular (a partir de los

Calentar un cubreobjetos con

Agregar a la caja Petri

Cerrar la caja Petri e

Revisar diariamente el crecimiento

Una vez inactivadas las esporas,

Aplicar una pequeña gota de

• Humectar la preparación y así evitar la

• Se usa para la tinción directa de micelio micólico,

 Para Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis y Sporothrixs chenkii NO SE REALIZA EL

Los hongos se observan intactos. Laboriosa.

La mejor técnica para observar

*Algunos autores hacen

Una gota PEQUEÑA

“POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU”

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Práctica No. 4: Microcultivo.

Asesor Titular: Q.F.B. Manuel Orduña Sánchez.

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