Farmacogenómica para predecir respuesta quimioterapias en tumores del

sistema nervioso central.

Objetivo general:

Contribuir en la búsqueda de marcadores genómicos y proteómicos que permitan

evaluar la utilidad y relevancia de los mismos para predecir respuesta a quimioterapias
en pacientes con tumores malignos.

Objetivos específicos:

Investigar si la expresión de proteínas de golpe de calor (Hsps), el estado de

metilación del gen MGMT y la expresión de las proteínas Bcat, BMP4 y MGMT se
encuentran asociadas a resistencia al tratamiento con temozolamida en tumores del
sistema nervioso central.

1. Evaluar durante el tratamiento con temozolamida, la proliferación, citotoxicidad y

capacidad de formación de colonias en líneas celulares de glioblastoma: F98 (rata) y
Gli36 (humana).
1.1 Analizar la expresión de MGMT, Hsp27, Hsp70, Bcat, BMP4 y el estado de
metilación del gen MGMT en las líneas celulares F98 y Gli36, antes y después del
tratamiento con temozolamida.
1.2 Evaluar muerte celular.
1.3 Correlacionar la expresión de MGMT, Hsp27, Hsp70, Bcat, BMP4 con proteínas
que forman parte del sistema de reparación del ADN mismatch-repair (MMR).
2. Inducir un modelo de glioma en ratas Wistar mediante el carcinógeno N–Nitroso-
N-ethylurea (ENU).
2.1 Analizar la expresión de MGMT, Hsp27, Hsp70, Bcat, BMP4 en las distintas
etapas de progresión del modelo y pre y post tratamiento con temozolamida

Antecedentes:

Actualmente los tratamientos terapéuticos contra tumores malignos del sistema

nervioso central no son satisfactorios, a la cirugía se suman la radioterapia y la
quimioterapia los cuales además producen efectos secundarios no deseables. Resulta
indispensable colaborar en la búsqueda de nuevos marcadores que permitan mejorar
la calidad de vida del paciente, a fin de orientar cuáles pueden ser los tratamientos
más eficaces para un paciente con un determinado tipo de tumor.
Los gliomas son las neoplasias primarias más comunes del sistema nervioso
central y se clasifican según la estirpe celular que les dio origen en: astrocitomas,
oligodendrogliomas y oligoastrocitomas. La distinción entre los subtipos es de gran
importancia ya que numerosos reportes han mostrado que la mayoría de los tumores
oligodendrogliales presentan un mejor pronóstico y mejor respuesta a la quimioterapia,
con respecto a los astrocitomas del mismo grado. Por lo tanto, la clasificación
adecuada es indispensable en la evaluación diagnóstica y terapéutica de los gliomas,
pero debido a la falta de marcadores específicos, los patólogos deben basarse
solamente en criterios histológicos y estos poseen un remarcable componente
subjetivo. Varias características radiológicas e histológicas han tratado de ser definidas
como marcadores pronósticos para oligodendrogliomas pero lamentablemente
ninguno de estos parámetros predice realmente los resultados observados. Estos
tumores son tratados principalmente por cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son
también utilizadas, pero la respuesta a estos tratamientos en general no es muy
satisfactoria.
Recientemente se ha demostrado la existencia de una fuerte correlación entre
la histología típica de los oligodendrogliomas y aberraciones genéticas presentes en
las células tumorales. La mas destacada es una deleción en el brazo corto del
cromosoma 1(1p) y en el brazo largo del cromosoma 19 (19q), conocida como LOH,
pérdida de heterocigosidad (proceso por el cual se produce la inactivación de un gen
supresor de tumor ya sea por deleción, mutación, o pérdida cromosómica). La LOH
para estos cromosomas es de utilidad como marcador para identificar a los
oligodendrogliomas, tal es así que en aquellos casos dudosos entre un astrocitoma y
un oligodendroglioma, la pérdida del 1p o del 19q orienta el diagnóstico hacia
oligodendroglioma. Además, se ha determinado la estrecha relación entre la LOH del
1p o 19q con la buena respuesta del tumor al tratamiento con quimioterapias (PCV: o
temozolamida), mientras que la falta de esta condición les confiere resistencia. Así
también, la LOH en estos cromosomas es de valuable utilidad pronostica. Se puede
decir entonces que estos marcadores forman parte de la llamada farmacogenómica.
Así también, la LOH en estos cromosomas es de valuable utilidad pronostica. Este
interesante marcador se ha encontrado además asociado a la metilación aberrante
del promotor del gen MGMT que codifica una proteína involucrada en la reparación de
daños al ADN producidos por agentes alquilantes y cuando está metilado no se
expresa, con lo cual se compromete su función. La LOH 1p/19q positiva y la
hipermetilación del gen MGMT se muestran correlacionados positivamente con la
respuesta clínica de los gliomas al tratamiento con temozolamida.
Debido a la comprobada relación entre el silenciamiento del gen MGMT y la
LOH, con la sensibilidad de los tumores al tratamiento con quimioterapias, es de
interés evaluar otras proteínas vinculadas con resistencia a drogas y mal pronóstico en
un amplio rango de neoplasias humanas, las proteínas de golpe de calor (Hsp: heat
shock proteins). Las mismas conforman un grupo de proteínas altamente conservadas
que se expresan constitutivamente en la mayoría de las células. Intervienen en
procesos metabólicos esenciales como la síntesis, plegamiento, ensamblaje y
transporte de otras proteínas, participando también de la eliminación de proteínas
desnaturalizadas. Los niveles elevados de Hsps en células malignas juegan un rol
clave en la protección contra la apoptosis espontánea asociada con malignidad y
también contra la apoptosis generada por mecanismos terapéuticos, esto podría
indicar un rol clave de estas proteínas en la carcinogénesis, progresión tumoral y
resistencia al tratamiento. De hecho, la Hsp 27 y Hsp70 están implicadas con el
pronostico de canceres específicos, la expresión aumentada de Hsp27 esta asociada
con pobre pronostico en carcinoma gástrico, de hígado, próstata y osteosarcoma y la
Hsp70 esta correlacionada con pobre pronostico en mama, endometrio y vejiga.
En lo que corresponde a gliomas el estudio de estas proteínas es incipiente por lo cual
es interesante llevarlo a cabo tanto en tejidos fijados e incluidos, como en líneas
celulares y modelo animal, además completar esta evaluación analizando la expresión
de estos marcadores pre y post tratamiento con temozolamida.
También nos interesa examinar la expresión de -catenina y BMP4. La -
catenina es un componente de las uniones adherentes célula-célula, donde interactúa
directamente con el dominio citoplasmático de las caderinas. También juega un rol
esencial en la vía de señalización intracelular Wnt, participando en la transcripción de
genes que están involucrados en la regulación del crecimiento, supervivencia y
diferenciación. La expresión citoplasmática aberrante de esta proteína se ha
encontrado relacionada con mal pronóstico en distintos tipos de neoplasias.
Previamente en nuestro grupo de trabajo se encontró que cuando -catenina se
encontraba expresada en citoplasma se asociaba a peor pronostico en cáncer mama,
además interacciona allí con la Hsp27.
Las BMP son factores de crecimiento multifuncionales que pertenecen a la
superfamila TGF, cumplen importantes roles en el desarrollo embrionario y funciones
celulares postnatales, entre ellas, la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) funciona
como un inhibidor clave de las características “stem-like” de las células precursoras
iniciadoras de tumor (TICs) en glioblastomas multiformes humanos. Provocando una
reducción in vivo de la proliferación de células de glioblastoma y un aumento en la
expresión de marcadores de diferenciación neuronales.

Actividades y metodología:

Las tareas a desarrollar durante este trabajo comprenden experimentos in Vitro

e in Vivo. Los estudios in Vitro se efectuarán en 2 líneas celulares de glioblastoma F98
(rata) y Gli36 (humana), mientras que los estudios in vivo se realizarán en un modelo
animal de glioma en ratas Wistar, inducido mediante el carcinógeno N–Nitroso-N-
ethylurea (ENU).

Experimentos in Vitro

 Silenciamiento del gen MGMT: se utilizará la técnica PCR metilación específica

(MSP). Este es uno de los métodos mas usados para obtener información
sobre el estado de metilación del ADN genómico, se basa en la modificación
del ADN por bisulfito sódico que convierte las citocinas no metiladas en
uracilos mientras las no metiladas permanecen como tales. Esta reacción
permite diferenciar ADN metilado del no metilado, mediante el diseño de
promotores específicos para cada alelo, este es uno de los pasos mas
complejos y críticos de la técnica. La elevada sensibilidad de este método
permite determinar el estado de metilación de muestras pequeñas de ADN, el
proceso se realizará bajo el protocolo puesto a punto en la primer parte de este
trabajo.
 Expresión de MGMT, Hsp 27, Hsp70, Bcat, BMP4: La detección de las
proteínas se realizará mediante inmunocitoquímica y Western blot
 Ensayo de proliferación: se analizará mediante la determinación del índice
mitótico y de la expresión del marcador de proliferación Ki67.
 Ensayo de citotoxicidad: se utilizará la técnica de reducción del colorante MTT.
 Capacidad de formación de colonias: se realizará un ensayo clonogénico.
 Muerte celular: será evaluada mediante la técnica del TUNEL y por
determinación del indice Bax-bcl2.

Experimentos in Vivo

Los tumores se inducirán mediante una dosis única transplacentaria de ENU

(75mg/kg peso cuerpo) en ratas Wistar preñadas, en el día 18 del periodo gestacional.
A las ratas control se les administrará solución salina. N–Nitroso-N-ethylurea (ENU)
tiene una acción transplacentaria destacada en el periodo perinatal, una dosis
intraperitoneal produce casi el 100% de incidencia de formación de neoplasias
neurales, este efecto se observa principalmente en neonatos y pre-neonatos. Los
síntomas o características que permiten reconocer que el tumor glial se ha inducido
con éxito son: erosión corneal, paresis en miembros inferiores, decoloración en la piel,
depresión o agresividad y pérdida de peso entre otras. Este modelo, inducido en las
crías, es muy útil para estudiar alteraciones especificas de cada estadio de la
progresión tumoral del glioma; de esta manera se sacrificaran ratas después de los 90
días del nacimiento, será el grupo P90 (estadio de iniciación del tumor), después de
los 135 días, será el grupo P135 (estadio de promoción del tumor), y después de 180
días y será el grupo P180 (estadio de progresión del tumor). Los tumores serán
extraídos bajo lupa binocular y clasificados como gliomas según su histología e
inmunofenotipo. Luego se procesaran para su posterior fijación e inclusión en parafina.
.
 Expresión de MGMT, Hsp 27, Hsp70, Bcat, BMP4: La detección de las
proteínas se realizará mediante inmunohistoquímica y Western blot.
 Tratamiento con Temozolamida: La Temozolamida (TMZ) será administrada en
dosis de 66 mg/kg diarios durante 5 días, al grupo control se le administrará
solución salina. Las dosis se aplicaran como se muestra en el gráfico, con
motivo de observar la efectividad del tratamiento y la incidencia en la expresión
de los marcadores, en cada una de las etapas de la progresión tumoral.

Factibilidad:

El lugar de trabajo es el Laboratorio de Oncología, dependiente del Instituto de

Medicina y Biología Experimental de Cuyo, Unidad ejecutora del CONICET ubicada en
el Centro Regional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CRICYT) de
Mendoza. Este laboratorio e instituto cuentan con las facilidades para llevar a cabo
esta investigación propuesta, además de sala de cultivo y bioterio en condiciones de
uso.
El origen de los recursos financieros proviene de un PIP (2428) otorgado al Dr.
Daniel R. Ciocca y a la Dra. Mariel A. Fanelli, de un PICT 1047 Préstamo BID y de
fondos aportados por la Fundación Argentina para la Investigación del Cáncer.

Los equipos más importantes a ser utilizados son: estufas para cultivo de
células, lector de placas, microscopio, lupas binoculares, estufas con control
automático de temperatura, baños termostáticos, termociclador, equipos para
electroforesis y western blot, pHmetros, freezer, heladeras, cuarto oscuro, campana
extractora, etc.

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