UNIVERSIDAD JUAREZ AUTONOMA DE TABASCO

División académica multidisciplinaria de los Ríos

Maestría en Desarrollo Agropecuario Sustentable

ASIGNATURA: Biotecnología

TRABAJO: Reporte de práctica

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Extracción de ADN y electroforesis en gel de agarosa

ALUMNA:

Sofía Amisadaí Benítez Uco

CATEDRATICA: Dra. María concepción de la Cruz Leyva

TENOSIQUE, TABASCO A 23 DE MARZO DEL 2019

 INTRODUCCIÓN

La extracción del ADN es necesaria en multitud de aplicaciones de la biología

molecular. En la actualidad, existe un gran número de kits comerciales que facilitan
este procedimiento (Yoshikawa et al., 2011). Seleccionar el kit correcto puede
ahorrar un valioso tiempo en la optimización del kit y la ejecución del experimento.

Dependiendo de la naturaleza de la muestra, se debe seleccionar el kit más

apropiado. En la presente práctica, la extracción de ADN (proveniente de cepas
bacterianas y suero) fue realizada con el kit Purelink Genomic DNA extraction
(Invitrogen). Este kit aísla ADN a partir de un amplio rango de tamaños de muestras
de sangre (100 ul a 1 ml), tejidos, células, bacterias, hisopados bucales, manchas
de sangre, tejidos FFPE, y muestras preservadas en Oragene®. Se basa en la
tecnología de membrana de sílica. Este kit proporciona una flexibilidad mayor al
incluir una versión de 96 pocillos que no requiere de ningún equipo especial y puede
ser procesada manualmente o en plataformas automatizadas (Dhaliwal, A. 2013)

Las células bacterianas recolectadas son lisadas, generalmente mediante el uso

de reactivos químicos como la lisozima, EDTA, lisozima y EDTA, detergentes, etc.,
seguido de la eliminación de componentes celulares utilizando el método de
extracción por disolvente, o tecnología basada en sílica, etc. El último paso conlleva
la precipitación del ADN para obtener ADN puro y en alta concentración. Para
levaduras y otros microbios se sigue un procedimiento similar (Zhang, Q. et al.,
2011).

Los pasos básicos involucrados en la extracción de ADN de células y tejidos

animales son los mismos que los descritos en la introducción y para los
microorganismos. Sin embargo, los kits necesitan incorporar modificaciones para
tener en cuenta las características especiales de las células animales.
OBJETIVOS:
 Conocer la metodología para aislar y extraer DNA a partir de una muestra.
 Utilizar los reactivos y materiales en las condiciones requeridas.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

Reactivos Equipos Materiales

Buffer de corrida TAE 1X Baño María Gradilla
Etanol 70% Centrifuga Puntillas de 1000 μL, 200
μL y 10 μL para
micropipeta
SDS Transiluminador UV Micropipetas de 5-10, μL
20-200 μL y 200-1000
μL
Agarosa Cámara de electroforesis Tubos eppendorf
estériles
Agua destilada (estéril) Vortex Muestra

Buffer de carga Green

GoTaq®
Bromuro de etidio
 DESARROLLO

Extracción de ADN (Kit purelink invitrogen)

1. Centrifugar 1600 μL de muestra (liquido) a 10°C

2. Adicionar 200 μL de SDS al 1 % y agitar con el vortex.
3. Centrifugar a 10 000 rpm durante un minuto. Desechar sobrenadante (figura
1).
4. Agregar 180μL de buffer de digestión genómico (1)
5. Vortexear y adicionar 20 μL de proteinasa K (2), agitar manualmente.
6. Incubar la muestra a 55 °C por 30 minutos en baño María. Cada 10 minutos,
agitar manualmente.
7. Adicionar 20 μL de enzima RNasa (3), agitar manualmente y dejar reposar 2
minutos.
8. Agregar 200 μL de buffer de ligado (4) y votexear 5 segundos.
9. Adicionar 200 μL de etanol al 100% y agitar 5 segundos en vortex.
10. Extraer 600 μL aproximadamente del lisado, y depositarlo en una columna
de filtración ensamblada con un tubo eppendorf.
11. Centrifugar a 10 000 rpm por un minuto, decantar la base de la columna
(tubo) y ensamblarla.
12. Adicionar 500 μL del buffer #6 (de lavado 1), centrifugar a 10 000 rpm por un
minuto a temperatura ambiente.
13. Decantar la base de la columna, ensamblar y adicionar 500 μL de buffer de
lavado #2 (7)
14. Centrifugar a 10 000 rpm durante 3 minutos. Decantar la base y y colocar
tubo nuevo, agregar 50 μL de buffer de elución. Dejar reposar 1 minuto.
15. Centrifugar 2 minutos a 10 000 rpm. Adicionar 50 μL del buffer de elución,
esperar un minuto y centrifugar nuevamente. Tapar vial.

Nota: para observar los resultados del proceso se hace una electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% para detectar su integridad, el DNA aparece en bandas algunas
veces bien definidas acompañadas de otras de menor peso que suelen ser de RNA,
en algunos casos cuando falla el proceso también se puede detectar impurezas o
barridos por degradación del DNA debido a un descuido de la manipulación de la
muestra o el proceso.

Una vez que el DNA se ha resuspendido, se procede a determinar su calidad por

electroforesis en minigel de agarosa al 0.8-1% con las siguientes instrucciones.

Electroforesis en gel de agarosa.

El siguiente protocolo se divide en tres etapas:

1. Preparación de gel agarosa en la concentración adecuada para la separación

del DNA a estudiar y tinción del gel con bromuro de etidio.
2. Aplicación de las muestras de DNA y fraccionamiento electroforético.
3. Observación del gel en el transiluminador de luz UV.

Preparación del gel.

La solución TAE 1X se emplea para la preparación del gel y para llenar la cámara
de electroforesis.

1.- Se agregó 1 gr de agarosa, que se diluyeron en 100 ml de buffer TAE 1X.

Calentar hasta su disolución total.

2.- Dejar enfriar y añadir 4 μL de bromuro de etidio, y vaciar en la bandeja para que
gelifique. Una vez gelificado, colocar en la cámara de electroforesis, dejando que
quede sumergido en el buffer TAE.

Aplicación de las muestras y fraccionamiento electroforético.

Las muestras de ADN a correr se aplican mediante una micropipeta en cada uno de
los orificios del gel, en un orden determinado, evitando la contaminación cruzada.

1. Extraer una gota pequeña de 4 μL de buffer de carga 5x Green

2. Depositar la gota en un espacio limpio. Extraer 4 μL de muestra de ADN del
tubo eppendorf y depositar en el mismo sitio que la gota del buffer.
 3. Ajustar la micropipeta aumentando la capacidad de volumen a 8 μL y mezclar
muestra y buffer, algunas veces.
4. Introducir la muestra en un pocillo del gel de agarosa, cuidadosamente y
depositar el contenido (figura 2).
5. Se llenaron dos carriles con muestras por triplicado.

Electroforesis

Someter al gel al procedimiento de electroforesis a 100V por 10 minutos.

Transcurrido este tiempo, se observa la migración del ADN.

Observación en la cámara UV

1. Sacar el gel de la cámara de electroforesis.

2. Colocar el gel dentro del transiluminador y encender la lámpara UV utilizando
la protección adecuada (figura 3).
 CONCLUSIONES

El aislamiento, purificación y demás manejos de moléculas de DNA y/o RNA es

fundamental para el estudio y experimentación en biología molecular. Para lo cual
se dispone de diferentes metodologías conformadas por distintos elementos, según
el origen del DNA y finalidad del estudio (Yavar, 2003).

Al momento de visualizar el gel en el transiluminador, se pudo apreciar levemente

bandas de DNA presentes en el gel, pero en poca cantidad. Dependiendo del tipo
de muestra, cambiaron las concentraciones. En el caso de la muestra de cepa
bacteriana, ésta fue la que mostró leve presencia de DNA en el gel. En el caso de
las muestras de suero, no se obtuvo una cantidad de DNA debido a que el suero
contiene otros compuestos orgánicos que pueden interferir con la electroforesis.

El objetivo de esta práctica fue aislar, analizar y visualizar DNA de diferente origen.
Sin embargo, el desarrollo de la metodología, no se hizo con la adecuada destreza,
por lo que casi no se visualizaron las bandas para la confirmación de la presencia
de ADN.
 ANEXOS

Fig. 1 Vista del sobrenadante antes de ser desechado.

Fig. 2 Muestras de ADN previas a ser sometidas a electroforesis.

Fig. 3 Tras la electroforesis, se obervó poca presencia de ADN, ya que las bandas
del ADN se apreciaban levemente (pocillos 3 y 4). Los dos primeros pocillos
corresponden a controles positivos.
 REFERENCIAS

Yábar Varas, C. A. (2003). Manual de procedimientos de electroforesis para

proteínas y ADN. Serie de Normas Técnicas, (38). Consultado el 20 de marzo de
2019. Obtenido de http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/1051_INS-NT38.pdf

Yoshikawa, H., Dogruman-Ai, F., Turk, S., Kustimur, S., Balaban, N., & Sultan, N.
(2011). Evaluation of DNA extraction kits for molecular diagnosis of human
Blastocystis subtypes from fecal samples. Parasitology research, 109(4), 1045-
1050. Consultado el 20 de marzo de 2019. Obtenido de:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21499752

Zhang, Q., Lambert, G., Liao, D., Kim, H., Robin, K., Tung, C. K., ... & Austin, R. H.
(2011). Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected
microenvironments. Science, 333(6050), 1764-1767. Consultado el 20 de marzo de
2019. Obtenido de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21940899

Manual de usuario PureLink® Genomic DNA Kits. Consultado el 20 de marzo de

2019. Obtenido de: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-
connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-
Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fpurelink_genomic_man.pdf&title=UHVyZUxpbms
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