Actividad enzimática de la amilasa

Nicolás Gallego Becerra

Jhon Gutierrez Fagua
Nicolle Maldonado Garzón
Gabriela Moreno Zuluaga

Universidad Antonio Nariño

Facultad de Medicina
Bioquímica II

Bogotá, Colombia
Septiembre, 2019
Objetivos
 Generales:
Determinar la actividad catalítica de la amilasa salival e identificar algunos factores que
afectan la actividad de la enzima.
 Especif́ icos:
Comprobar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de la amilasa salival.
Verificar la especificidad de la actividad enzimática de la amilasa sobre un sustrato.
Determinar el efecto inhibitorio del AgCl en la actividad enzimática de la amilasa.
Comprender el papel de la amilasa salival en los procesos fisiológicos.

Fundamento químico de los métodos de detección utilizados

 Reactivo de Lugol: El almidón y las dextrinas producen color con una dislucion
de yodo y yoduro de potasio. Este color puede ser azul, púrpura o rojizo, según
sea el grado de hidrolisis de la macromolecula.
𝛼 − 𝐷 − 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 en la amilasa forman un hélice con 6 unidades del mono
sacarino en cada vuelta. El iodo se ubica en el interior de la amilasa,
especificamente en las regiones hidrofóbicas, lo que genera el color azúl
característico desarrollado por el almidón en presencia de yodo-yoduro. Cuando
la amilasa ejerce su actividad enzimática degrada la amilosa, lo que produce una
desintegración de la hélice y en consecuencia en presencia de I2/IK no presentara
un color azúl.
 Reactivo de Benedit: Está constituido por una disolución de sulfato de cobre II,
citrato de sodio y carbonato de sodio. Al tratar el azúcar con estos reactivos,
exoerimentan una reacción de oxidación. El cobre II en disolución acuosa, de
color azul, se reduce a cobre I, el cual precipita como óxido de cobre I, de color
rojo.
Observaciones y resultados
Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática

Tubo No. Reactivo Lugol Reactivo de Benedict

1 Reacción color marrón Reacción color azul claro
Reacción color marrón con
2 Reacción color azul claro
precipitado negro
Reacción marrón con precipitado
3 Reacción color zul claro
negro fuerte
Tabla 1. Reacciones obtenidas en la evaluación de la actividad enzimática en función
de la temperatura. Montaje con reactivo de Lugol y Benedict, respectivamente.

Influencia del pH sobre la actividad enzimática

Tubo No. Reactivo Lugol Reactivo de Benedict

1
2
3
Tabla 2. Evaluación de la actividad enzimática en función del pH. Montaje con reactivo
de Lugol y Benedict.

Especificidad de las enzimas

Tubo No. Reactivo Lugol Reactivo de Benedict

Reaccion color café ladrillo con
1 Reacción negativa color azul claro
precipitado balnco
Reaccion color café ladrillo con
2 Reacción negativa color azul claro
precipitado balnco
Reaccion color café ladrillo con
3 Reacción negativa color azul claro
precipitado balnco
Reaccion color café ladrillo con Reacción positiva color ladrillo
4
precipitado balnco (moderada)
Tabla 3. Resultados obtenidos de la evulucion de la actividad enzimática con reactivo
de Lugol y Benedict.
Analisis de resultados
Actividad enzimática en funcion de la temperatura
De acuerdo a los resultados obtenidos en la tabla número 1 podemos analizar que la
temperatura en función de la actividad enzimática puede acelerar o disminuir la
velocidad de reacción. El montaje del tubo 1 correspondió a la desnaturalización
enzimática previa a 55ºC, de esta manera, un cambio inusual en la temperatura provoca
mutación en la proteína (cambio conformacional), por consiguiente, una perdida de
estabilidad y funcionalidad, lo cual fue evidenciado con el resultado obtenido respecto a
la prueba de Lugol. Allí la amilasa al ser inactiva no logró hacer la reacción de
hidrólisis sobre el almidón que en condiciones óptimas de montaje la reacción debería
arrojar un color azulado oscuro, lo cual evidencia los complejos formados por las sales
de yoduro y el componente estructural del almidón, sin embargo, en esta práctica la
inhinibición por temperatura de la amilasa no fue adecuada y problablemente logró
hidolizar el almidón en solución, por consiguiente la reacción para Lugol fue negativo.
Para el montaje del tubo 2 se conservo la temperatura y pH adecuados para la actividad
enzimática, razón por la cual la amilasa obtenida de la saliva logró hidorlizar el
polisacarido en dextrina y maltosa dando un resultado negativo para Lugol, finalmente
para el tubo 3, la temperatura de incubación fue modificada a entre 0-2ºC, lo que
desfavorece la velocidad de reacción. Teoricamente, la disminución de la temperatura
en las reacciones enzimáticas incrementa el tiempo en el que se produce la actividad
catalítica, por tal razón, nuestro montaje con Lugol fue negativo o simplemente no fue
evidente la reacción.
Para el montaje de Benedict fue necesario la incubación del mismo a 55ºC
aproximadamente, para los tres tubos esta reacción fue negativa, ya que en solución solo
obtuvimos discáridos o polisacáridos (almidón), los cuales no tienen características
reductoras como los monosacáridos.
Ilustración 1. Reacción de Lugol y Benedict para evaluación de actividad enzimática en
función de la temperatura (Color ladrillo, corresponde a montaje con Lugol; Color
azul, corresponde a montaje Benedict). Observese la reacción negativa en todos los
montajes.

Especificidad enzimatica
La sacarasa es una enzima tipo hidrolaza, presente en las levaduras que cataliza la
formación de glucosa y fuctosa. La invertasa (nombre más común) tiene su
funcionalidad más importante en comportimientos de almacenamiento, donde rompe la
sacarosa, siendo el disacárido más abundante e importate para el metabolismo, el
transporte y la regulación de las levaduras.
Para evaluar su actividad fue necesario realizar el montaje con almidón y sacarosa al
2%, para el primer tubo se adicionó almidón y saliva (amilasa), posteriormente se
realizó el montaje con Lugol y Beneditc. El almidón en presencia de la amilasa fue
hidrolizado a carobohidratos más simples (disacaridos), de esta manera no fue posible
que los complejos de sales de yodo se asociaran a las cadenas de almidón, las cuales
fueron hidrolizadas arrojando una reacción negativa. La presencia de poliscáridos
(estructurales) en la solución sugirió una ausencia de azúcares reductores en el medio,
presentando una prueba de Benedict negativa.

Para el tubo número 2 la amilasa (saliva) fue remplazada por la suspención de sacarasa
procedente de la levadura, dicha enzima no tiene la capacidad para hidrolizar el
almidón, lo cual nos relaciona la especificadad enzimática con su actividad catalítica,
dicha especificadad se debe a una interacción precisa del sustrato con la enzima, esta
precisión es el restultado de la compleja estructura tridimensional de la proteína
enzimática, razón por la cual el almidón quedó intacto en solución y la prueba de Lugol
debió ser positiva. Sin embargo, por condiciones de montaje y probablemente la
integridad del reactivo no pudimos comprobar lo anteriomente dicho, dando como
resultado una prueba de Lugol negativa. Respecto al montaje de Benedcit, como ya ha
sido mencionado, no se relaciona con polisacáridos estructurales complejos y por lo
tanto no fue viable obtener azúcares reductores en esta prueba.

Para el montaje del tubo 3 el almidón fue remplazado por solución de sacarosa al 2%
junto con amilasa (salival), como ya se mencionó en los montajes anteriores, la
especificidad enzimática solo está relacionada con un sustrato específico, para este caso
la amilasa no hidroliza la sacarosa, la cual permanece intacta en solución,
adicionalmente es un disacarido que favorece la obtención de energía a partir de su
hidrólisis. Por lo tanto no corresponde a un polisacárido estructural, dando así una
reacción con Lugol negativa, de igual manera, la sacarosa es un disacárido conformado
por glucosa y fructosa, donde la unión de las dos azúcares no deja libre el carbono
anomérico de la molécula, característica estructural que la converite en un azúcar no
reductor, dicho así, nuestra reacción obtenida con el reactivo de Benedict fue negativa.

Por último, el montaje número 4 correspondió a solución de sacarosa 2% y sacarasa

(invertasa) en suspensión procedente de la levadura, la ausencia de cadenas complejas
de amilosa y/o amilopectina no permitió a las sales de ioduro reaccionar de forma
correcta, pues la sacarosa correponde a unión de azúcares simples de característica
energética y metabólica, no de estructura y resistencia (almidón y quitina) arrojando una
reacción negativa con el Lugol. Sin embargo la sacarasa tiene como pincipal función
catalizar la hidrólisis de sacarosa a glucosa y fructosa, la cual estaba presente en el
medio, de esta manera cada monosacárido (producto) obtenido dejó su carbono
anomerico libre, lo cual le confiere la caracteristica de ser azúcar reductor, teniendo en
cuenta que la glucosa obtenida en la reacción corresponde al redcutor más abundante y
más importante de todos los monosacáridos, evidenciada así en la prueba de Benedict
positiva (color ladrillo fuerte).

Ilustración 2. Evaluación de la especificidad enzimática. De izquierda a derecha:

reacción de Benedict positiva, por presencia de azúcares reductores, gracias a la
hidrólisis de la sacarosa. Reacción negativa por presencia de disacáridos en solución.

Ilustración 3. Evaluación de la especificidad enzimática con prueba de Lugol.

Observece reacción negativa en ambos montajes, por la ausencia de polisacáridos
estructurales (almidón).
Conclusiones
Se puede concluir que una enzima, trabaja de manera optima en el cuerpo, acelerando
las reacciones, bajo unas condiciones estables, las cuales son, pH, temperatura,
concentracion de sustrato. Si estas condiciones se alteran, afectaran la actividad
enzimatica de la proteina, desnaturalizandola o aumentando el tiempo en el que se
genere una reaccion que normalmente se acelera con una enzima.

Se ha concluido de acuerdo a la práctica que las enzimas son macromoleculas,

compuesas por proteinas, cuya funcion principal es acelerar la reaccion, ahorrando
energia en la célula.

Se puede concluir que la amilasa ejerce su actividad catilitica, bajo un pH casi neutro,
entre 7 y 8.

Referencias
Garrido, A. (2014). Actividad enzimática de la amilasa [Ebook] (pp. 1-5). Retrieved
from https://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-
amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf
Mark Berg, J., Stryer, L., & L, J. (2007). Bioquímica (6th ed., p. 207). Barcelona:
Freeman and company.
Melo Ruiz, V., & Cuamatzi Tapia, O. (2007). Bioquímica de los procesos
metabólicos (2nd ed., pp. 98-99). México: Editorial Reverté, S. A.
Enzimas. Regulación de la actividad anzimática. (2019). Retrieved 13 September 2019,
from http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#t
Sánchez González, D., & Trejo Bahena, N. (2006). Biología celular y molecular.
México: Alfil.