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ANALISIS LABORATORIO DE ENZIMAS

Resumen
En el presente texto se analizarn las caractersticas que condicionan las funciones de la amilasa a
diferentes condiciones .La amilasa salival es la enzima bucal ms destacada e importante dentro de los
componentes de la saliva, su funcin principal es la de metabolizar el almidn de los residuos de los
alimentos que permanecen en la boca despus de las comidas .Al considerar la actividad cataltica de una
enzima, se realizaron pruebas que permitieron analizar las caractersticas de la amilasa y desarrollar las
observaciones, stas fueron, labilidad trmica, influencia del pH, especificidad de la enzimas e influencia
de activadores e inhibidores.
ANALISIS

Las enzimas son catalizadoras en todas las reacciones del metabolismo,


estos son especficos para determinar la reaccin. Estas provocan una
transformacin.
Las enzimas pueden aumentar o disminuir la actividad enzimtica segn las
condiciones como por ejemplo el pH puede alterar la forma de la enzima
dificultando la unin del sustrato con el que acta, existe un pH ptimo para
la actividad enzimtica.
En el caso de la temperatura, la velocidad de la reaccin es directamente
proporcional a temperatura y cuando esta es muy baja no hay reaccin es
apreciable. Pero un aumento excesivo en esta provoca la alteracin de la
estructura de la enzima, es decir deja de funcionar o empieza su
desnaturalizacin.
En el proceso de digestin, las molculas ingeridas deben ser degradadas
en componentes ms sencillos con el fin de ser asimilada, la digestin
comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan en la boca, es decir la
amilasa salivar comienza a degradar los almidones rompiendo sus enlaces
liberando maltosa, glucosa y dextinas de almidn.
La amilasa es una enzima que se encuentra en la saliva humana y cataliza
la degradacin del almidn que es u polisacrido de reserva vegetal. El
almidn est formado por amilasa y amilo pectina, ambos son polisacridos
de la glucosa. La amilasa est formada por cadenas lineales de glucosa
unidas por alfa 1-4 mientras que la amilo pectina tienen posee alfa1-4 y alfa
1-6 formando cadenas ramificadas, es decir que dejan destinas lineales y
ramificadas (oligosacridos) como productos.
Para determinar cmo acta la amilasa se parti de una muestra de saliva,
recogida en un vaso de precipitado, esta se disolvi en 10 ml de solucin,
que posteriormente fue sometida a diferentes pruebas como lo son la de
labilidad termina de las enzimas, influencia de pH en la actividad de las
enzimas, especificidad de la enzima e influencia de los activadores e
inhibidores

Con respecto a la labilidad trmica, se pretende determinar cul es la


influencia que tiene ante la actividad de las enzimas. Cada enzima posee
una temperatura ptima para la accin de las enzimas (37 41 c ), debido a
que el incremento o disminucin de la temperatura permite la aceleracin
de la reaccin. La solucin de saliva fue sometida a diferentes temperaturas
0c, 37c y temperatura ambiente con el fin de observan cmo se comporta
la solucin a estas temperaturas y al aplicar el reactivo de lugol .
La coloracin producida por el reactivo de lugol se debe a que el yodo se
introduce entre las espiras del almidn. Es decir que se forma un compuesto
de inclusin que modifica las propiedades fsicas de la molcula obteniendo
una solucin coloreada (azul violeta).
Los resultados que se obtuvieron al realizar esta prueba fueron :
Cuando la solucin de almidn con amilasa se someti a una temperatura
de 0c, a la cual se le adiciono reactivo de lugol se obtuvo una coloracin
amarilla con precipitado purpura , al realizar la solucin de amilasa salivar
se tuvo un error debido a que no haba la cantidad de amilasa suficiente en
esta solucin para que las soluciones tomen una coloracin completa .
Cuando la amilasa reacciona con almidn se deba obtiene un rompimiento
de enlaces en la estructura llevando hasta glucosa. Sin embargo al poseer
una mnima cantidad de amilasa en la solucin el desdoblamiento del
almidn a estructuras ms sencillas es mnimo por ende se obtuvo
solamente en precipitado de color purpura evidenciando la actividad de la
enzima, adems, al encontrarse a una temperatura mnima el sistema
enzimtica puede disminuir su actividad.
Cuando la misma solucin se someti a una temperatura de 37c con
reactivo de lugol se obtiene una solucin de color amarillo con precipitado
purpura, debido a que la enzima amilasa reacciona con el almidn
obteniendo rompimiento de enlaces en proporciones casi despreciables, sin
embargo al obtener un precipitado de color purpura se evidencia el paso de
una macro estructura a estructuras ms simples como lo son la glucosa.
La misma solucin de los experimentos anteriores fue sometida a una
temperatura ambiente y posteriormente sometida al termostato 37c se
obtiene que al incrementar la energa cintica de las estructuras tanto del
almidn como de la enzima se puede obtener que haya ms fcil un
rompimiento de enlaces, sin embargo debido a la cantidad de amilasa en la
solucin la solucin no se torn totalmente purpura pero al existir un
precipitado morado se puede decir que hay una cantidad despreciable de
hemiacetales que reaccionan con el reactivo de lugol.
Con respecto a la coloracin de las soluciones a las diferentes temperaturas
la coloracin amarilla se debe a la presencia de amilo pectina esta se
colorea entre amarillo y naranja, y la amilasa pude tomar un oscura (negro).
Con respecto, a la influencia del pH sobre la actividad de las enzimas
podemos decir que la alfa-amilasa es una enzima que no funciona a pH

extremos (cidos o bsicos) o que disminuye notablemente su actividad. Se


obtuvo como resultado que al someter la solucin de amilasa a
temperaturas de 37 c durante 10 minutos, con diferentes pH (5.0, 6.8, 8.0).
Cuando se someti la solucin de amilasa con almidn a un PH 5.0 se
obtuvo una coloracin amarillo con precipitado purpura oscuro indicando la
ruptura mnima de enlaces del almidn debido a la actividad enzimtica de
la amilasa, obteniendo el desdoblamiento del almidn llevndolo hasta
glucosa, sin embargo, al preparar la solucin de amilasa salivar, esta no
tena un alto porcentaje de esta enzima por ende los enlaces de la amilo
pectina (1-6) y amilasa (1-4) no se rompen totalmente. Pero al obtener un
precipitado de coloracin purpura podemos decir que es positiva
produciendo una velocidad moderada debido a su pH.
Cuando la misma solucin de almidn con amilasa a un pH de 6.8 en
presencia de reactivo de lugol se obtuvo que hay rompimiento de enlaces
alfa 1-4 y alfa 1-6, no en su totalidad esto se debe a que la cantidad de
amilasa en la solucin adicionada al tubo de ensayo no es suficiente para
que la enzima degrade todos los enlaces existentes en el almidn y por
ende hay una porcin de glucosa mnima. Esto se evidencia en la coloracin
tomada la cual fue amarillo con precipitado purpura claro.
En un pH de 8.0, la solucin de amilasa con almidn en presencia del
reactivo de lugol se obtiene una coloracin traslucida con precipitado
morado en una cantidad casi despreciable, esto evidencia que hay
rompimiento de enlaces existentes en el almidn. A este pH podemos decir
que la enzima empieza a desnaturalizarse o pierde su actividad enzimtica
si se somete a un pH elevado, debido a que no estara en su PH ptimo.
El pH es muy importante debido a que estimula o reduce la actividad
enzimtica, el sustrato en nuestro caso el almidn reacciona con la amilasa,
con el fin de romper los enlaces amilo pectina y amilasa cuando se rompen
dichos enlaces se obtiene una solucin coloreada.
Posteriormente, se analiz la especificidad de las enzimas debido a que se
puede formarse un complejo enzima sustrato ligando el sustrato con el
centro cataltico de la enzima. Es decir, que la enzima cataliza una de las
posibles reacciones del substrato.
Se someti una solucin de almidn con amilasa, incubada 10 minutos con
37 pc, obteniendo que la enzima se degrade al almidn en azucares
pequeos (glucosa) la coloracin obtenida fue naranja intenso, es decir que
el complejo formado de coloracin anaranjado determino que la prueba
aplicada es positiva.
Una solucin de invertida y almidn fue sometida a incubacin, se aplic la
coloracin con yodo y posteriormente se realiz la prueba de felina con el
fin de obtener un complejo sustrato enzima de coloracin amarillo oscuro,
esta reaccin es positiva debido a que se hidrolizan, la enzima rompe

enlaces y al degradarse el almidn en molculas simples de glucosa se


obtiene la coloracin amarilla, es decir, existen azucares reductores.
Cuando la sacarosa ( alfa-D-Glucopiranosil - (12) - beta-D-Fructofuransido)
junto con la amilasa son sometidas a una incubacin y se aplican las
pruebas de yodo y fehling , se obtiene una coloracin blanca opaca, debido
a su coloracin podemos decir que no la amilasa no es especfica para el
sustrato de sacarosa debido a que este disacrido no tiene poder reductor
en la reaccin de fehling por lo tanto no forma un complejo sustrato enzima
por ende la reaccin ser negativa para el reactivo de fehling.
La reaccin de sacarosa e invertrasa (sacarasa) sometida a incubacin
presentan una coloracin amarillo claro, la invertasa es una enzima que
convierte la sacarosa en glucosa y galactosa obteniendo que al aplicar la
reaccin de fehling esta reaccin sea positiva debido a la hidrolisis de la
sacarosa. Sin embargo, al aplicar a la sacarosa la reaccin de fehling es
negativa, debido a que no presenta grupos libres hemiacetales.
Despus se realiz la prueba de la influencia de activadores e inhibidores.
Existen series de sustancias que inhiben la accin enzimtica sin
transformarse. La inhibicin enzimtica puede ser reversible e irreversible,
un inhibidor es una molcula la cual posee un parecido estructural con el
sustrato de manera que pude competir para con el entro activo pero no
posee un enlace susceptible que pueda ser atacado por la enzima.
Existen un tipo de moduladores alostaticos los cuales pueden estimular o
disminuir la actividad de la enzima, los inhibidores alostaticos no
corresponden a ningn tipo de inhibicin. Al someter la solucin (almidn y
amilasa) con cloruro de sodio y el reactivo de lugol obtenemos una
coloracin amarilla esto significa que la reaccin es negativa con una
coloracin amarilla esto se debe a que la enzima necesita un cofactor ya
que son imprescindibles para la actividad enzimtica, debido a que NaCl no
posee un ion metlico en su estructura no existir la actividad enzimtico.
Mientras que para la solucin (amilasa y almidn) con sulfato cprico
podemos decir que al incubarse y realizarse la prueba de lugol, se obtuvo
que la coloracin es azul verdosa esto significa que el sulfato de cprico en
su estructura posee un ion metlico el cual es imprescindible para la
actividad enzimtica.

Para determinar cul es la actividad enzimtica de la renina, ante todo, se


debe tener en cuenta que las enzimas son catalizadores de naturaleza
orgnica, producidas por el resultado actividad celular, la renina o
angiotensinogenosa es una enzima segregada por clulas renales especiales
y esta incrementa la secrecin de aldosterona, hormona que ayuda a
controlar el equilibrio hdrico y sales del cuerpo. Mientras que la leche es

una de las protenas completas, esta posee grasas y protenas al igual que
la casena.
En el proceso de coagulacin se cumplen dos etapas. La primera , es
estrictamente enzimtica donde acta la renina sobre la kappa casena la
cual protege la estabilidad de la miscela de casena, se libera un
glicopptido hidroflico, que reduce la carga superficial de las miscelas y
adems aumenta las fuerzas de repulsin electrostticas que las mantiene
separadas, logrando desestabilizar el complejo de protena y la presencia de
catin calcio de micelas y posteriormente se origina un gel, se agrega un
catin de leche como cloruro;
el tiempo de coagulacin depende
estrictamente de la accin enzimtica de la renina.
La renina presenta mxima actividad a un pH acido de 5,5 y no acta a un
pH mayor a 7. En cuanto la temperatura se encuentra en 35 y 40 c se logra
una actividad mxima.
Respecto a la actividad enzimtica de la renina, podemos decir que la
formacin del coagulo depende de las condiciones de temperatura y pH.
Cuando se somete las distintas leches a diferentes temperaturas con una
solucin de cuajo se determin el tiempo de formacin del coagulo, las
leches que se sometieron a la pruebas son la leche pasteurizada, UTH, y
cruda sin embargo, al empezar a realizar las diversas pruebas la leche cruda
se da (presentaba pequeos fragmentaciones) por lo tanto se realizaron
pruebas con la leche pasteurizada y la leche UTH, sin embargo, tomaremos
como referencia la leche cruda.
La leche pasteurizada a diferentes temperaturas, las cuales son 5,29, 35,
45, 60, 80 con el fin de conocer el comportamiento de la enzima frente al
sustrato al suministrar temperatura. Cuando la leche pasteurizada se lleva
a una temperatura de 5 c se observa que no presenta formacin de
coagulo, el tiempo que se mantuvo a esta temperatura fue de ms 30
minutos y no se observ cambio alguno esto se debe a que el sistema
enzimtico est inactivo por lo tanto la enzima no puede actuar de forma
eficaz, en esta temperatura la actividad enzimtica es mnima.
Cuando la leche pasteurizada se encuentra a temperatura ambiente (20c)
se observ que cuando pasa ms poco tiempo la leche en presencia de la
solucin de cuajo no forma el coagulo sin embargo cuando se dej en
tiempo de 34 minutos la solucin presento formacin de cogulo, esto se
debe a que la temperatura no es ptima para alcanzar la velocidad mxima
de la reaccin por lo tanto es ms lenta.
De este mismo tipo de leche fue sometido a una temperatura diferente la
cual fue de 35 , la actividad enzimtica optima de la renina se encuentra
entre las temperaturas de 37 y 40 grados Celsius por lo tanto podemos
decir que a esta temperatura el tiempo empleado para la formacin del
coagulo fue de 3,45 minutos. Por lo tanto, la velocidad de reaccin es apta
para la actividad enzima debido que se increment la energa cintica de

las molculas reactantes. Por lo tanto, podemos decir que a esta


temperatura predomina la desnaturalizacin obteniendo un coagulo en la
parte inferior de tubo.
Con respecto, a la leche pasteurizada que se someti a una temperatura de
45c podemos decir que el tiempo empleado para la formacin del coagulo
es de 1,56 minutos por consiguiente podemos decir que a esta temperatura
se obtiene la mayor velocidad de la reaccin, por lo tanto esta es la
temperatura ptima para la actividad enzimtica.
Para la temperatura de 60 c podemos decir que el tiempo de coagulacin
es de 3,59 es decir que el tiempo de coagulacin es mayor al tiempo
empleado en la temperatura optima, por ende se concluye que no es la
temperatura adecuada para el buen funcionamiento de la enzima pero si
permite que exista una actividad enzimtica en esta temperatura podemos
decir que va disminuyendo la capacidad enzimtica la cual no se encuentra
actuando al 100 %.
En cuanto a la temperatura de 80 c podemos decir que la actividad
enzimtica a esta temperatura disminuye debido a que la desnaturalizacin
trmica es evidente, como el tiempo de coagulacin fue de 5,50 podemos
decir que la enzima acta en un 45% a su capacidad mxima.
Por lo tanto podemos decir que las reacciones catalizadas por enzimas
producen un brusco descenso en la actividad enzimtica cuando alcanzan la
actividad mxima, es decir que en el sistema se est realizando una
desnaturalizacin trmica.
Con respecto a la prueba realizada a la leche UHT (ULTRA ALTA
PASTEURIZADA) es una leche con un proceso trmico con flujo continuo, la
cual se aplica a unas temperaturas de 135 a 150 c, de tal manera se
destruyen las esporas bacterianas, la casena apenas se modifica, las
protenas apenas se modifican los complejos que se forman normalmente
son poco intensos ,
en este proceso las enzimas sufren modificaciones, las proteasas no se
inactivas totalmente, por consiguiente la actividad enzimtica en este tipo
de leche es mnimo, es decir, no hay coagulacin esto se comprueba en la
practica debido a que al pasar mas de 30 minutos en diferentes tempraturas
estas muestras no sufren ningn cambio.
Acerca de la prueba de pH podemos decir que las enzimas determinan su
actividad respecto a ciertos factores el pH es uno de ello. A continuacin
analizaremos, las diferentes leches con acido lctico e hidrxido de sodio.
La leche pasteurizada podemos decir que el pH inicial fue de 6,41 cercano
pH neutro, cuando a la solucin se le adiciona renina obtenemos que
nuevo pH de la solucin es de 6,79 es decir que el pH incrementa
presenta una diferencia de 0,38 a pesar del incrementar el PH estn no es
pH optimo para la formacin de coagulo.

al
el
y
el

el Ph inical es de 6,48 de la solucin de leche con acido lctico 0,5 ml .


cuando se le adiciona la enzima renina podemos decir que el pH
disminuye cuando se le adiciona la renina tomando un valor de 6,18
obteniendo una diferencia de 0,3, cuando el pH disminuye a 5,98 se
evidencia la formacin del coagulo, el tiempo empleado para este cambio es
de 3,34 minutos.
Cuando a una solucin de leche pasteurizada y acido lctico (ml) el pH
inical es de 6,48 mientras que cuando se le adiciona renina el pH toma un
valor de 6,25 la disminucin de pH contribuye a deterctar el pH optimo para
la actividad enzimtica por ende cuando se forma el coagulo es de 5,55 en
pH se obtiene la formacin del cuagulo en un tiempo de 1,50 minutos
A la solucin de leche pasteurizada se le adiciona 1,5 ml de hidrxido de
sodio esta solucin el pH es de 6,48 mientras que si se agrega la enzima
renina el pH que toma esta solucin es de 8,97 alejandose del pH optimo
de la reaccion, no hubo formacin de cuagulo; igualmente, le pasa a la
solucin donde se adiciona 2,5 ml de naoh debido a que al adicionar estas
soluciones se incrementa el Ph BASICO de la solucin.
Posteriormente, se analizo el efecto del tratamiento trmico previo de loa
leche sobre la accin enzimtica obteniendo que la leche pasteurizada a
una temperatura de 35c la renina tarda 5 minutos en formar el cagulo, por
lo anto podemos decir que la velocidad de la reaccion es aceptable,
afirmando que a esta temperatura la ctividad enzimtica no es mxima.
Cuando la leche entera se somete a el primer hervor podemos decir que la
leche sepasteurizo, posteriormente se incrementa su temperatura a 35 c
obteniendo que el tiempo de la formacin del coagulo es de 4,11, es
evidente que su velocidad de reaccion incremen to por lo tanto la formacin
del coagulo es mas rpida.
Este mismo procedimiento sufrio la leche uth, obteniendo que no hay
formacin de coagulo, esto se debe a el tratamiento a que fue sometido
debido a que las estructuras existentes en la leche han sido modificadas.