VITAMINA A El palmitato de retinol es un sólido lipoideo
amarillo claro, o si se funde, un líquido oleoso
H3C CH3 CH3 CH3 amarillo, con un punto de fusión de aproximadamente 26 ºC. R O Todos los ésteres de retinol son solubles o parcialmente solubles en etanol, miscibles con CH3 solventes orgánicos y prácticamente insolubles en agua. La Vitamina A y sus ésteres son muy R=H C20H30O PM: 286,5 sensibles a la acción del aire, luz, calor y los R=CO-CH3 C22H32O2 PM: 328,5 agentes oxidantes y ácidos. R=CO-C2H5 C23H34O2 PM: 342,5 Sustancia de referencia - Ésteres de R=CO-C15H31 C36H60O2 PM: 524,9 retinol SR-FA. Sinonimia - Palmitato de Retinol. CONSERVACIÓN Definición - La Vitamina A refiere a un número En envases inactínicos de cierre perfecto. de sustancias de estructura muy similar (incluyendo los isómeros (Z), que se encuentran en tejidos ENSAYOS animales y que poseen actividad semejante). La [NOTA: efectuar la valoración y todos los sustancia principal y biológicamente más activa es ensayos tan rápidamente como sea posible, evitando aquella que posee todos sus enlaces en posición (E): la exposición a la luz actínica y al aire, a los agentes todo-(E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilciclohex-1-eni oxidantes, a los catalizadores de oxidación, como l)nona-2,4,6,8-tetra-en-1-ol (C20H30O). La vitamina por ej., cobre, hierro), a los ácidos y al calor. A se emplea en forma de ésteres tales como acetato, propionato y palmitato. La expresión éster de Identificación retinol sintético se refiere a un éster de retinol Emplear la siguiente técnica cromatográfica: sintético (acetato, propionato o palmitato) o una Fase estacionaria - Emplear una placa para mezcla de ésteres de retinol sintético. cromatografía en capa delgada (ver 100. La actividad de la Vitamina A se debe expresar Cromatografía) recubierta con gel de sílice para en equivalentes de retinol (ER). 1 mg de ER cromatografía con indicador de fluorescencia, de corresponde a la actividad de 1 mg de todo-(E)- 0,25 mm de espesor. retinol. La actividad de los otros ésteres de retinol Fase móvil - Ciclohexano y éter (80:20). se calcula estequiométricamente, de modo que 1 mg Solución estándar - Preparar una solución de de ER de Vitamina A equivale a la actividad de: aproximadamente 0,01 mg de Ésteres de 1,147 mg de acetato de todo-(E)-retinol, retinol SR-FA por l (3,3 UI de cada éster por l) 1,195 mg de propionato de todo-(E)-retinol, en ciclohexano. Estabilizar con una solución de 1,832 mg de palmitato de todo-(E)-retinol. butilhidroxitolueno al 0,1 %. Se emplean también las Unidades Solución muestra - Preparar una solución de Internacionales (UI) para expresar la actividad de la aproximadamente 3,3 UI de Vitamina A por l en Vitamina A. 1 UI de Vitamina A equivale a la ciclohexano. Estabilizar con una solución de actividad de 0,300 g de todo-(E)-retinol . La butilhidroxitolueno al 0,1 %. actividad de los otros ésteres de retinol se calcula Procedimiento - Aplicar por separado sobre la estequiométricamente, de modo que 1 UI de placa 3 l de Solución muestra y 3 l de Solución Vitamina A equivale a la actividad de: estándar. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar 0,344 g de acetato de todo-(E)-retinol, los cromatogramas hasta que el frente del solvente 0,359 g de propionato de todo-(E)-retinol, haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la 0,550 g de palmitato de todo-(E)-retinol, cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar 1 mg de equivalente de retinol corresponde a al aire. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 3333 UI. 254 nm: el cromatograma obtenido a partir de la Caracteres generales - El acetato de retinol se Solución estándar debe presentar las manchas presenta como cristales de color amarillo pálido, individuales de los ésteres correspondientes. El con un punto de fusión de aproximadamente 60 °C. orden de migración debe ser: acetato, propionato y Cuando funde, el acetato de retinol, tiende a formar palmitato de retinol. La composición de la una masa sobreenfriada. Solución muestra se debe confirmar por la El propionato de retinol se presenta como un correspondencia de la o las manchas principales líquido oleoso pardo rojizo. obtenidas a partir de la Solución estándar. Límite de retinol A326V 1.900 Fase estacionaria y Fase móvil - Proceder según se indica en Identificación. 100 P Solución muestra - Preparar una solución de en la cual A326 es la absorbancia a 326 nm, P es el aproximadamente 330 UI de Vitamina A por l en peso de Vitamina A en g, V es el volumen total al ciclohexano. Estabilizar con una solución de que ha sido diluida la Vitamina A para dar una butilhidroxitolueno al 0,1 %. concentración de 10 a 15 UI por ml y 1.900 es el Solución estándar - Agitar 1 ml de la Solución factor de conversión de la absorbancia específica de muestra con 20 ml de solución de hidróxido de los ésteres de retinol en Unidades Internacionales tetrabutilamonio 0,1 M en alcohol isopropílico, por g. durante 2 minutos y diluir a 100 ml con ROTULADO ciclohexano. Estabilizar con una solución de En el rótulo se debe indicar el número de butilhidroxitolueno al 0,1 %. Unidades Internacionales por g y el nombre del Procedimiento - Aplicar por separado sobre la éster o ésteres. placa 3 µl de Solución muestra y 3 µl de Solución estándar. Dejar secal las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar al aire. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm: a excepción de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra, ninguna mancha debe ser más intensa que la mancha principal obtenida con la Solución estándar (1 %). [NOTA: en el cromatograma obtenido a partir de la Solución estándar se debe observar sólo trazas o no se debe observar ninguna mancha correspondiente al éster de retinol.] Sustancias relacionadas Determinar el máximo de absorción de la solución empleada en el ensayo Actividad (ver 470. Espectrofotometría ultravioleta y visible). La solución debe presentar un máximo de absorción entre 325 y 327 nm. Medir las absorbancias A a 300, 350 y 370 nm y calcular la relación A /A326 para cada longitud de onda: ninguna de las relaciones A/A326 debe ser mayor de: 0,593 a 300 nm. 0,537 a 350 nm, 0,142 a 370 nm. ACTIVIDAD Examinar por espectrofotometría de absorción ultravioleta (ver 470. Espectrofotometría ultravioleta y visible). Pesar exactamente entre 25 y 100 mg de Vitamina A, disolver en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isopropílico hasta una concentración de 10 a 15 UI por ml. Determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente 326 nm. Calcular la actividad de la Vitamina A en Unidades Internacionales por g por la fórmula siguiente: