Cuantificación de cccDNA de VHB en

donantes de hígado anti-HBc positivos

mediante PCR digital en gotitas: una
nueva herramienta para detectar
infecciones ocultas

Reflejos
•
El ADN circular cerrado covalentemente del VHB (ADNcc) es
responsable de la persistencia viral décadas después de la
resolución de la enfermedad hepática.
•
Una infección latente oculta por el VHB se identifica por la
presencia del anticuerpo contra el antígeno del núcleo de HB (anti-
HBc).
•
Desarrollamos un análisis de PCR digital de gotas altamente
sensible para la cuantificación de cccDNA de HBV intrahepático.
•
El ADNccNA del VHB es detectable y cuantificable en 27 de los
100 donantes de hígado anti-HBc positivos.
•
Los niveles séricos de IgG anti-HBc se asocian con el hallazgo de
ADNccNA de HBV intrahepático.
Antecedentes y objetivos
El diagnóstico preciso de la infección por el virus de la hepatitis B oculta
(VHB) (OBI, por sus siglas en inglés) requiere la demostración del ADN
del VHB en las biopsias hepáticas de individuos con antígeno de
superficie de hepatitis B negativos. Sin embargo, en la práctica clínica
se deduce un OBI latente por el hallazgo del anticuerpo contra el
antígeno central de la hepatitis B (anti-HBc). Investigamos la verdadera
prevalencia de OBI y las características moleculares del VHB
intrahepático en individuos anti-HBc positivos.
Los metodos
Los hígados de 100 donantes de trasplante (edad media 68,2 años; 64
machos, 36 hembras) positivos para anti-HBc en las pruebas
serológicas estándar, se examinaron para determinar el ADN total del
VHB mediante PCR anidada y para el ADN circular cerrado
covalentemente del VHB (ADNcc del VHB) con un análisis de PCR
digital de gotas (ddPCR) (Linealidad: R 2  = 0.9998; límite inferior de
cuantificación y detección de 2.4 y 0.8 copias / 10 5  células,
respectivamente).
Resultados
Se encontró que un 52% (52/100) de los individuos estudiados tenían
OBI. Se encontró cccDNA en el 52% (27/52) del OBI positivo, con una
mediana de 13 copias / 10 5  células (95% IC 5–25). Usando un ensayo
específico para anti-HBc de la clase IgG, el nivel de anticuerpos
medianos fue significativamente más alto en los donantes positivos a
cccDNA de HBV (17.0 [7.0–39.2] en comparación con 5.7 [3.6–9.7]
índice de corte [COI], respectivamente, p  = 0,007). Por análisis
multivariado, un valor de IgG anti-HBc por encima de 4.4 COI se asoció
con el hallazgo de ADNcc de ADN del VHB intrahepático (odds ratio
8.516, p  = 0.009); un valor más bajo descartó su presencia con un valor
predictivo negativo de 94.6%.
Conclusiones
Con un nuevo método interno basado en ddPCR, el cccADN de HBV
intrahepático fue detectable en niveles cuantificables en
aproximadamente la mitad de los casos de OBI examinados. El título de
anti-HBc IgG puede ser un sustituto útil para predecir el riesgo de
reactivación OBI en pacientes inmunodeprimidos.
Resumen laico
La forma de ADN circular (cccADN) cerrada covalentemente del virus
de la hepatitis B (VHB) mantiene la persistencia del virus incluso
décadas después de la resolución de la infección sintomática (infección
oculta por VHB). En el presente estudio, desarrollamos un método
altamente sensible basado en tecnología de PCR digital de gota para la
detección y cuantificación de ADNccNA del VHB en el hígado de
individuos con infección oculta por VHB. Observamos que la cantidad
de cccDNA del VHB puede inferirse del título en suero del anticuerpo de
clase IgG al antígeno central de la hepatitis B. La cuantificación de este
anticuerpo puede representar un sustituto para determinar qué
pacientes tienen el mayor riesgo de reactivación del VHB después de
las terapias inmunosupresoras.

Palabras clave
Virus de la hepatitis b

HBcrAg

Infección oculta por VHB

PCR digital de gotas

Anti-HBc
Introducción
La infección oculta por el virus de la hepatitis B (VHB) (OBI) se refiere a
la presencia de ADN intrahepático del VHB en ausencia de antígeno de
superficie detectable de la hepatitis B (HBsAg). 1 OBI es secundario a
infecciones evidentes de VHB; garantiza la persistencia del virus en una
forma críptica protegida de la respuesta inmune del huésped. La clave
virológica es el ADN circular cerrado covalentemente (ADNcc), una
forma de ADN del VHB generada como un episoma similar al plásmido
del genoma del ADN circular relajado unido a proteínas; reside en el
núcleo de las células infectadas y da lugar a secuencias virales, que
actúan como una plantilla de transcripción para todos los ARN virales. 2
OBI tiene importancia clínica; puede reactivar la hepatitis B cuando la
respuesta inmune del huésped está comprometida, como en pacientes
con trasplante de hígado o en quimioterapia. También puede acelerar
la progresión de la fibrosis hepática en pacientes con hepatitis C
crónica y se ha considerado un factor de riesgo para el carcinoma
hepatocelular. 3
Un diagnóstico preciso de OBI requeriría una biopsia de hígado para
medir el ADN intrahepático del VHB. Sin embargo, la obtención de
muestras de hígado es difícil. En la práctica, el reconocimiento de OBI
se basa en la unión del anticuerpo al antígeno central de la hepatitis
B (anti-HBc), con la premisa de que esta reactividad representa una
cicatriz serológica a una exposición clínicamente resuelta al VHB y, por
lo tanto, puede ser un marcador indirecto. de una infección latente por
VHB. 4 El ADNccNA intrahepático del VHB es resistente a los antivirales
y no se puede erradicar 5 , pero es posible prevenir la reactivación del
OBI mediante la profilaxis con antivirales del VHB. 6 Esta estrategia se
recomienda para pacientes anti-HBc positivos sometidos a tratamiento
farmacológico.inmunosupresión ; En defecto de los datos virológicos, la
indicación individual para la profilaxis no está determinada por los
parámetros de infectividad del VHB, sino por
el potencial inmunosupresor de la terapia.
Aquí, desarrollamos y presentamos un nuevo ensayo para la medición
del ADNccN del VHB basado en la PCR digital de gotitas(ddPCR), una
técnica emergente que muestra una sensibilidad y precisión mejoradas
para detectar concentraciones bajas de ADN en comparación con
la PCR cuantitativa en tiempo real convencional(qPCR). 7 Utilizamos
este ensayo para determinar la prevalencia y la cantidad de cccDNA del
VHB en individuos con OBI reclutados entre donantes de hígado anti-
HBc positivos y para evaluar la relación entre los hallazgos virales en el
hígado y los marcadores de infección por VHB en suero.
Pacientes y métodos
Pacientes
Desde noviembre de 2010 hasta diciembre de 2016, se reclutaron en el
Centro de Trasplante de Hígado de la Universidad de Turín 112
donantes de hígado con latidos del corazón fallecidos consecutivos de
HBsAg negativo / anti-HBc positivo. Dieciocho biopsias de hígado de
donantes de hígado sin ningún marcador de VHB se recogieron como
controles negativos. Ningún órgano provenía de prisioneros ejecutados
u otros individuos institucionalizados. Se obtuvo una muestra de suero
y una biopsia de aguja hepática de cada donante; este último se
recolectó en una solución de ARN posterior y se almacenó a -80 ° C
hasta su procesamiento.
Debido al diseño del estudio, no se solicitó una aprobación específica
del Comité de Ética Institucional Local. Según la ley italiana, los Centros
Regionales de Trasplantes son los custodios de los datos biomédicos
de los donantes también con fines de investigación. Todos los
procedimientos de estudio cumplieron con los estándares éticos de la
Declaración de Helsinki 2000 y la Declaración de Estambul 2008.
Detección de ADN circulante e intrahepático total del VHB.
El ADN del VHB circulante se detectó y cuantificó mediante un sistema
qPCR totalmente automatizado (COBAS Amplicor-COBAS TaqMan,
Roche, Suiza). Los resultados se expresaron en UI / ml; el límite inferior
de detección (LLoD) y la cuantificación (LLoQ) fueron 9 UI / ml y 20 UI /
ml, respectivamente.
Las biopsias de hígado congeladas se rompieron en 500 µl de tampón
de lisis utilizando un homogeneizador de tejido liso y se incubaron
durante la noche con proteinasa K (20 mg / ml) a 37 ° C. El ADN total
intrahepático se aisló mediante el método de fenol / cloroformo; la
concentración y la calidad fueron evaluadas por NanoDrop ND 1000
(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, EE. UU.). OBI fue
investigado como se describió anteriormente. 8 Brevemente, se
analizaron muestras de ADN hepático extraídas para detectar la
presencia de genomas de VHB mediante cuatro PCR
anidadas paralelas para detectar secuencias de superficie,
núcleo, polimerasa y X de VHB . Los cebadores de PCR fueron
complementarios a nucleótidos altamente conservadosSecuencias del
genoma del VHB. Se realizaron dos rondas de amplificación, 35 ciclos
cada una, utilizando la Polimerasa HotStartTaq (Qiagen, Hilden,
Alemania). Se incluyeron controles negativos y positivos apropiados en
cada experimento de PCR. Para verificar falsos negativos, se
realizó una PCR paralela para el gen de la β-globina (HBB). Las
muestras positivas para al menos dos objetivos de VHB se calificaron
como OBI positivas según las declaraciones de la reunión de expertos
de Taormina. 1
Cuantificación de cccDNA de HBV intrahepático por ddPCR
El plásmido AM-12 que contiene el genoma 9 de HBV completo y los
extractos de ADN de receptores de hígado con HBsAg positivos y
donantes de hígado seronegativos para HBV se utilizaron para la
caracterización del ensayo ddPCR . Para evaluar la especificidad de
nuestro análisis de cccADN de VHB basado en ddPCR, se realizó
un análisis de endonucleasa de restricción utilizando Eco RI (Promega,
Madison, Wisconsin, EE. UU.), Que tiene solo un sitio de restricción en
el plásmido AM-12, o Hin dIII (Promega, Madison). , Wisconsin, EE.
UU.), Que no tiene sitios de restricción ni en el ADNcc del VHB ni en el
plásmido AM-12, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la cuantificación de cccDNA del VHB en extractos de ADN de
donantes de hígado, se trataron 2 µg de ADN total intrahepático durante
la noche a 37 ° C con 10 U de ADNasa dependiente de ATP (PSAD)
(Epicenter, Madison, Wisconsin, EE. UU.) Para digerir una hebra
sencilla. ADN y ADN de doble cadena lineal . La digestión con PSAD se
llevó a cabo utilizando un volumen de reacción de 50 µl que contenía 5
µl de 10x de tampón PSAD, 2 µl de ATP 25 mM, 1 µl de PSAD, 37 µl de
agua desionizada y 5 µl (400 ng / µl) de total intrahepático ADN. Las
muestras digeridas se purificaron adicionalmente mediante
precipitación con fenol / cloroformo / etanol y se resuspendieron en 20
µl de agua estéril . La comparación entre PSAD y S1 nucleasa. La
digestión se reporta en los métodos complementarios .
Se utilizaron cebadores pan-genotípicos específicos dirigidos a la región
de la brecha del ADN del VHB y una sonda de hibridación de
fluorescencia para detectar el ADNcc viral. Los cebadores directos e
inversos fueron 5′-CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3 ′ (nucleótido [nt]
1,550–1,570) y 5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGAA-3 ′ (nt 1,882–1,863)
respectivamente, 10 y la sonda 5′-FAM-
CTGTAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
GGGGGGGGGTGGGTGTGGTGTGGTGGTGGTGGGTGGGTGGTGT
GGTGTGTGGGTGTGAGA- 3 ′ (nt 1,882–1,863) respectivamente, 10 y
la punta de prueba 5′-FAM-CTGTAGACAJOS DE APLICACIÓN 3 ′. Una
mezcla de reacción de ddPCR de 20 µl comprendía 10 µl de Supermix
de ddPCR de 2 × para sondas (sin dUTP) (Bio-Rad, Pleasanton,
California, EE. UU.), 1 µl de 20x cebadores / mezcla de sonda (900 nM
y 250 nM) y 9 µl de muestra de ADN digerido / purificado. Las gotitas de
reacción se generaron de acuerdo con el protocolo del fabricante por
QX200 ™ Droplet Generator (Bio-Rad, Hercules, California, EE.
UU.). Se amplificó el cccDNA de HBV intrahepático utilizando
T100 TMTermociclador (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.) Con el
siguiente perfil de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial de
10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 30
sa 94 ° C, recocido durante 60 s a 62 ° C (velocidad de rampa de 2,5 °
C / s) y una incubación final de 10 min a 98 ° C. Se incluyeron controles
negativos y positivos apropiados en cada experimento de
ddPCR. Después de la amplificación, las gotitas positivas y negativas
se cuantificaron mediante un lector de gotas QX100 ™ (Bio-Rad,
Hercules, California, EE. UU.) Utilizando el software de análisis
QuantaSoft ™ versión 1.7.4 (Bio-Rad, Hercules, California, EE.
UU.). Todos los valores de cccDNA de HBV intrahepático se
normalizaron al número de células evaluado mediante el ensayo
de variación del número de copias RPP30 (Bio-Rad, Pleasanton,
California, EE. UU.) Y se informaron como copias de cccDNA de HBV /
10 5 células.
Cuantificación de cccDNA de HBV intrahepático por qPCR
Las reacciones de qPCR se realizaron utilizando el sistema de
detección de PCR en tiempo real CFX96 ™ (Bio-Rad, Hercules,
California, EE. UU.). Una mezcla de reacción qPCR de 20 µl
comprendía 10 µl de Supermix Sondas SsoAdvanced ™ Universal
Probes (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.), 1 µl de 20x cebadores
/ mezcla de sonda (900 nM y 250 nM) utilizada para ddPCR y 9 µl de
muestra de ADN digerido / purificado. Las condiciones de amplificación
fueron un ciclo de desnaturalización inicial de 3 minutos a 95 ° C,
seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95 °
C y una recocido / extensión combinada durante 60 segundos a 60 °
C. Los valores de Cq obtenidos se analizaron con el software CFX ™
Manager versión 3.1 (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.). Las
diluciones en serie del plásmido AM-12 sirvieron como estándar de
cuantificación y los datos se normalizaron para el ADN
celular. contenido utilizando el ensayo de variación del número de
copias RPP30.
Ensayos serológicos
Los ensayos anti-HBc totales estándar se utilizaron originalmente para
el tratamiento de los donantes. El HBsAg sérico , el antígeno
relacionado con el núcleo de la hepatitis B (HBcrAg) y la IgG anti-HBc
se determinaron con inmunoensayos enzimáticosquimioluminiscentes
sensibles (CLEIA) en el analizador totalmente automatizado
Lumipulse® G600 II (Fujirebio, Tokio, Japón). El HBsAg se midió con el
ensayo HQ (Lumipulse® G HBsAg-Quant) que detecta HBsAg
linealizado utilizando dosanticuerpos monoclonales contra los epítopos
externos e internos determinantes "a" con una sensibilidad analítica de
5 mIU / ml. Seexpresaron 11 valores de HBcrAg (Lumipulse® G HBcrAg)
como Log U / ml y el rango de medición analítica fue de 2.0–7.0 Log U
/ ml. 12Los niveles de IgG anti-HBc (Lumipulse® G HBcAb-N) se
informaron como índice de corte (COI), que se calcula automáticamente
como un múltiplo del valor de corte obtenido a partir de los datos de
calibración (COI = S / C × 0.09). Se incluyeron controles negativos y
positivos apropiados en todas las pruebas.
análisis estadístico
Las variables continuas se expresaron como media ± desviación
estándar (DE) o mediana (IC del 95%) según la normalidad de los
datos. La distribución normal se verificó mediante la prueba de
normalidad D'Agostino-Pearson.
Para la caracterización del método ddPCR, el coeficiente de
determinación (R 2 ) se evaluó mediante un análisis de regresiónlineal ,
mientras que un menor LLoQ y un LLoD se determinaron mediante un
análisis de regresión probit. LLoQ y LLoD se definieron como la
concentración más baja a la que se detectaron el 95% y el 50% de las
muestras positivas, respectivamente. Se construyó un gráfico de Bland-
Altman para analizar el acuerdo entre los resultados cuantitativos
obtenidos con ddPCR y qPCR, yse calculó el coeficiente kappa de
Cohen (κ) para evaluar el acuerdo entre evaluadores entre las tasas de
positividad del ADNc de VHB mediante los dos métodos.
Se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para analizar las
variables continuas. La prueba exacta de Fisher o la prueba de ji
cuadrado (χ 2 ) para la tendencia se realizaron para comparar las
variables categóricas cuando fue apropiado. La correlación entre las
variables continuas se probó mediante el coeficiente de correlación de
Pearson (r). El análisis de la curva de características operativas del
receptor (ROC) se realizó para evaluar el área bajo la curva (AUC) y el
valor de corte que maximiza la sensibilidad y la especificidad. Las
proporciones impares (OR) de las variables asociadas con la presencia
de ADNcc del VHB se calcularon mediante un análisis de regresión
logística múltiple y gradual .
Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente
significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el
software MedCalc®, versión 16.0. (MedCalc, Ostende, Bélgica).
Para obtener más detalles sobre los materiales utilizados, consulte
la tabla CTAT y la información complementaria .
Resultados
Características del donante de hígado
Se incluyeron cien de los 112 donantes positivos anti-HBc (edad media
68.2 [65.5–71.5] años, 64 hombres y 36 mujeres). Las razones para la
exclusión fueron una prueba positiva para anticuerpos contra el virus
de la hepatitis C (n = 4), el hallazgo de un tumor desconocido del
estroma gastrointestinal (n = 1), la edad del donante <18 años (n = 1) y
las muestras de suero / plasma no disponibles (n = 5). Se despidió a un
donante por el hallazgo posterior de positividad de HBsAg-HQ (57 mIU
/ ml). Seis donantes tenían ADN del VHB detectable en la sangre (todos
<20 UI / ml), 75 donantes eran anti-HBs positivos y 32 eran anticuerpos
contra el antígeno de hepatitis B e (anti-HBe) positivo (25 fueron
positivos para ambos anticuerpos).
Se informan las características de los donantes con ADN del VHB en
sangre ( Tablas S1 y S2 ).
Prevalencia de infección oculta por VHB
La prevalencia de OBI fue del 52% ( es decir, 52 de los 100 que los
donantes tuvieron una PCR anidada positiva para al menos dos
regiones genómicas del VHB diferentes). En detalle, 35 biopsias de
hígado fueron 4/4 objetivos positivos, nueve fueron 3/4, ocho fueron 2/4,
13 fueron 1/4 mientras que 35 fueron completamente negativos. Entre
los 18 donantes de hígado anti-HBc negativos, nunca se observó
positividad para las cuatro regiones genómicas del VHB.
Sensibilidad y precisión del análisis de ADNcc de VHB basado en ddPCR
El rendimiento del método ddPCR para la cuantificación del ADNccde
HBV se evaluó utilizando el plásmido AM-12 que contiene el genoma de
HBV de longitud completa.  Se usarondiluciones seriales de 10 veces,
con un rango de 106a 100copias / reacción para probar la linealidad (Fig.
1A). El método mostró una excelente correlación lineal entre el número
de copias de ADNc de VHB esperado y observado (105–100 copias /
reacción, R2 = 0.9998,p <0.0001) (Fig. 1B). Para determinar LLoQ y
LLoD, 10 réplicas de un extracto de hígado positivo para ADNccNA de
HBV diluido en seriese probaron después de la digestión con PSAD
(obtenida de un receptor de trasplante de hígado positivo para
HBsAg); LLoQ fue de 3,8 copias / 10 5  células, mientras que LLoD fue
de 0,8 copias / 10 5  células ( Fig. 1 C). La reproducibilidad se evaluó
mediante pruebas intra e inter-run utilizando diferentes extractos de
ADN positivos para ADNccNA de VHB. Para las
pruebas  ininterrumpidas, se analizaron ocho réplicas de dos muestras
positivas para cccADN de VHB (673 ± 55 y 4.283 ± 353 copias /
10 5 células) en el mismo experimento de ddPCR, mientras que para las
pruebas entre ejecuciones, siete experimentos individuales de ddPCR
con dos Réplicas de una muestra de ADNccNA positiva para VHB
(4,164 ± 387 copias / 10 5 células) se realizaron. El coeficiente de
variación (CV) se calculó como la SD de las copias / reacciones de
cccDNA del VHB dividida por la media de las repeticiones. El CV
promedio fue de 8.21% y 9.29% para las pruebas intra-corridas e inter-
run, respectivamente. Para evaluar la eficacia del método de extracción
y purificación, se cuantificaron 10 réplicas de un extracto de ADN de
hígados seronegativos de VHB con un número conocido de copias del
plásmido AM-12, seguidas de digestión con PSAD y precipitación con
fenol / cloroformo / etanol, mediante ddPCR . La tasa media de
recuperación, calculada como la relación entre el número de copias de
ADNcc de VHB observado y esperado, fue del 79% (esperada: 300
copias / reacción, observada: 236 ± 46 copias / reacción).
Fig. 1 . Sensibilidad y precisión del ensayo de ADN circular cerrado covalentemente
de VHB basado en ddPCR . (A) Amplificación de una dilución de 10 veces
del plásmido AM-12 por ddPCR . (B) Correlación entre ddPCR esperada y
observada. Número de copias de ADN circular covalentemente cerrado de VHB. (C)
Probit análisis de la curva sigmoidea que informa el LLoQ y el LLoD. ADNcc, ADN
circular covalentemente cerrado; ddPCR, PCR de gota digital; VHB, virus de la
hepatitis B ; LLoD, límite inferior de detección; LLoQ, límite inferior de
cuantificación. (Esta figura aparece en color en la web.)

Especificidad del ensayo de ADNcc de HBV basado en ddPCR

Para evaluar la especificidad del ensayo de ADNcc de HBV, el
plásmido AM-12 se digirió con PSAD solo o con PSAD después de la
linealización del plásmido por Eco RI. Como se muestra ( Fig. 2 A), la
amplificación del plásmido AM-12 con pre-tratamiento con Eco RI no
mostró eventos positivos en comparación con el plásmido AM-12
digerido solo con PSAD, lo que confirma la especificidad de la
digestión con PSAD para moléculas de ADN lineales.
Fig. 2 . Evaluación de la especificidad del ensayo basado en ddPCR para
la cuantificación de ADN circular covalentemente cerrado de VHB . (A)
Amplificación por ddPCR del plásmido AM-12 digerido con PSAD solo o con PSAD
después de la linealización del plásmido por Eco RI. (B) Efecto de
la endonucleasa de restricción y la digestión con PSAD sobre el extracto de ADN
hepático de una muestra positiva para el antígeno de superficie de la hepatitis B. (C)
Amplificación de cccDNA de HBV por ddPCR en muestras de biopsia de hígado de
18 donantes de hígado seronegativos para HBV. ADNcc, ADN circular
covalentemente cerrado; ddPCR, PCR de gota digital; VHB, virus de la hepatitis
B ; PSAD, seguro para plásmidosDNasa dependiente de ATP . (Esta figura aparece
en color en la web.)

Además, para evaluar la especificidad y la eficacia de nuestro método para la

cuantificación selectiva de cccDNA del VHB en un fondo complejo que consta
de ADN genómico , ADN del VHB integrado y diferentes intermedios replicativos del
ADN del VHB, comparamos el número de copias detectadas en una muestra de
HBsAg positiva con o sin digestión con PSAD; Observamos una reducción en el
número de copias después de la digestión con PSAD. A la inversa, no se observó
una reducción adicional en el número de copias después del tratamiento previo
con Hin dIII ( Fig. 2 B), lo que sugiere que el uso combinado de la digestión con
PSAD y los cebadores selectivos de ADNcc de VHB pueden eliminar de manera
efectiva las secuencias de ADN del VHB potencialmente integradas sin la
necesidad de genómica. La fragmentación del ADN.
No se detectó señal en ninguna de las 18 biopsias de hígado de donantes sin
marcadores de VHB en suero ( Fig. 2 C).
Cuantificación de cccADN de VHB intrahepática por ddPCR
Se detectó ADNcc del VHB en 27 de las 100 biopsias de hígado con una mediana
de 13 (5–25) copias / 10 5  células o 1.1 (0.7–1.4) Copias de registro / 10 5  células
( Fig. 3 A). Entre los donantes de hígado OBI positivos, la prevalencia de positividad
para el ADNccVHVB fue del 52% (27 de 52), mientras que ninguno de los donantes
de hígado OBI negativos fue positivo para ADNccVBV ( p  <0,001) ( Fig. 3 B). Los
niveles de cccDNA de VHB intrahepático se correlacionaron significativamente con
la positividad de las cuatro PCR anidadas para la detección de OBI (r = 0.545; IC
del 95%: 0.391–0.670; p  <0.001) ( Fig. 3 C). Se informan los resultados del ensayo
de PCR anidada para el ADN total del VHB frente al ensayo de ddPCR para el
ADNcc del VHB (Tabla S3 ).
Fig. 3 . Niveles de cccADN de VHB intrahepáticos y positividad de
OBI. Niveles de ADNccNA del VHB intrahepático en donantes de hígado con
ADNccNA positivo (A), distribución de la positividad del ADNccNA del VHB según
el número de PCR anidadas positivas para la detección del ADN del VHB total (B) y
correlación entre las copias de ADNccn del VHB intrahepático y el número de PCR
anidadas positivas (C) ). ADNcc, ADN circular covalentemente cerrado ; VHB, virus
de la hepatitis B ; OBI, infección por hepatitis B oculta . (Esta figura aparece en color
en la web.)
Comparación de la cuantificación de cccDNA de HBV con los ensayos ddPCR y
qPCR
Para comparar la reproducibilidad de los ensayos ddPCR y qPCR, todos los 100
extractos de ADN hepático se analizaron con más detalle mediante
qPCR. Ninguna muestra cccDNA-negativa para VHB en ddPCR fue positiva en
qPCR, mientras que solo 11 de las 27 muestras cccDNA-VHB positivas en ddPCR
fueron positivas con cccDNA de VHB cuantificable por qPCR (k =
0.501, IC 95%: 0.307–0.695). Las muestras positivas tanto en ddPCR como en
qPCR tuvieron concentraciones de cccDNA de VHB significativamente más altas
que las negativas en qPCR (40.0 [5.7–331.6] en comparación con7.5 [2.3–15.5]
copias / 10 5  células, p  = 0.012, respectivamente). En cuanto a la caracterización
de ddPCR, para determinar LLoQ y LLoD del ensayo de qPCR, se analizaron 10
réplicas de un extracto de hígado positivo para cccDNA-HBV diluido en serie
después de la digestión con PSAD; LLoQ fue de 71.1 copias / 10 5 células mientras
que LLoD fue de 19.1 copias / 10 5 células. Según el gráfico de Bland-Altman ( Fig.
S1A ) y el análisis de regresión lineal ( Fig. S1B ), solo hubo una concordancia
moderada entre los ensayos de ddPCR y qPCR (R 2  = 0.6037, p  = 0.005).
Relación entre los marcadores séricos del VHB y el ADNccNA intrahepático del
VHB
Se presentan las características demográficas y virológicas de los donantes
estratificados según la positividad del ADNccNA del VHB ( Tabla 1 ). No se
observaron diferencias en los niveles de HBcrAg entre los donantes de hígado
positivos y negativos para cccDNA de HBV ( p  = 0.483); en casi todos los casos,
los resultados de las pruebas fueron inferiores a LLoQ (<2 Log U / ml). Cinco
donantes mostraron valores de HBcrAg ≥2 Log U / ml: dos HBV ADNccNA
positivos (2 y 2.5 Log U / ml) y tres HBV ADNccNA negativos (2.3, 2.5 y 2.6 Log U
/ ml). No se encontraron diferencias tanto en anti-HBstasas de positividad y en los
niveles de anti-HBs entre los donantes HBV cccDNA-positivos y negativos
hepáticas ( p  = 0,599 y p  = 0.481, respectivamente), mientras que las tasas
de anti-HBe positividad yLos niveles de IgG anti-HBc fueron significativamente
diferentes ( p  = 0.003 yp = 0.007, respectivamente).

Tabla 1 . Las características demográficas y virológicas de los donantes se dividieron

de acuerdo con una prueba de ADN circular covalentemente cerrada con VHB
negativa o positiva .
*
Los datos se expresan como (IC del 95%).
**
El valor de p se ha calculado mediante la prueba de χ 2 para la tendencia. A menos que
se especifique lo contrario, las variables continuas se compararon mediante la prueba
de Mann-Whitney, mientras que las variables categóricas se analizaron mediante la
prueba exacta de Fisher. Anti-HBc, anticuerpo contra el antígeno central de la hepatitis
B; Anti-HBe, anticuerpo contra el antígeno de hepatitis B e; Anti-HBs, anticuerpo
contra el antígeno de superficie de la hepatitis B; ADNccNA, ADN circular
covalentemente cerrado; COI, índice de corte; HBcrAg, antígeno relacionado con el
núcleo de la hepatitis B; VHB, virus de la hepatitis B; OBI, infección oculta por VHB.
La mediana de los niveles de IgG anti-HBc aumentó significativamente (5.1
[3.0–8.7] vs. 13.7 [7.0–22.0] COI, p  = 0.004) entre el grupo OBI negativo
y el OBI positivo y aumentó moderadamente sin significación estadística
entre el grupo. OBI-positivo con y sin cccDNA de HBV ( Fig. 4 ). El análisis
de la curva ROC mostró que 4.4 COI fue el corte óptimo que maximizó la
sensibilidad (92.6%) y la especificidad (48.0%) para la discriminación
entre muestras de hígado con ADNccNA-positivo y negativo de HBV
(AUC 0.680; IC 95% 0.577–0.771; p  = 0,002); 25 donantes (52%) en el
grupo OBI negativo, 10 (40%) en el grupo OBI positivo / HBV cccDNA
negativo y dos (7%) en el grupo HBV ADNccNA positivo tuvieron niveles
de IgG anti-HBc por debajo de 4.4 COI (χ 2prueba de
tendencia, p  <0,001). En un modelo de regresión logística multivariable
que incluye edad, sexo, positividad anti-HBe y IgG anti-HBc> 4.4 COI, solo
este último se asoció de manera significativa e independiente con el
ADNccNA del VHB intrahepático medible (OR 8.516; IC 95% 1.709-
42.425; p  = 0,009); títulos de anticuerpos más bajos predijeron la falta de
cccADN de VHB intrahepático medible con un valor predictivo negativo de
94.6%.
Fig. 4 . Niveles séricos de IgG anti-HBc en donantes de hígado OBc negativo, OBI
positivo / HBV cccDNA negativo y OBI positivo / HBV cccDNA positivo. Las cajas
identifican la mediana y los percentiles 25 y 75, mientras que los bigotes se extienden
a los percentiles 5 y 95. Los títulos medianos de IgG anti-HBc fueron 5.1 (3.0–8.7)
COI en OBI− / cccDNA−, 10.4 (3.6–31.3) COI en OBI + / cccDNA− y 17.0 (7.0–39.2)
COI en OBI + / cccDNA +. La comparación entre los grupos se realizó mediante
la prueba de Mann-Whitney . Anti-HBc, anticuerpo contra el antígeno central de
la hepatitis B ; ADNcc, ADN circularcovalentemente cerrado ; COI, índice de
corte; VHB, virus de la hepatitis B ; OBI, infección por hepatitis B oculta. (Esta
figura aparece en color en la web.)

Discusión
El sello distintivo del OBI es la presencia de ADN intrahepático del VHB,
por lo que un diagnóstico preciso de esta afección requiere una biopsia de
hígado . OBI es una condición asintomática de latencia viral y no sería
ético someter a individuos sanos a un procedimiento invasivo ; en la
práctica clínica, el hallazgo de anti-HBc en suero
con inmunoensayos estándar se considera evidencia suficiente para
diagnosticar el OBI, con el corolario de que todas las personas con HBsAg
negativo que muestran este marcador son candidatas para
la profilaxis contra el VHB en caso de que se las trate con fármacos
inmunosupresores potentes .
Sin embargo, la asociación entre la expresión y el nivel de anti-HBc y la
presencia de ADN intrahepático HBV sigue siendo desconocida. Para
abordar este problema, examinamos muestras de hígado obtenidas en
injertos de donantes de hígado anti-HBc positivos, primero para determinar
la prevalencia del ADN intrahepático total del VHB ( es decir, el OBI), y
luego para determinar la prevalencia del ADNcc del VHB en los individuos
OBI positivos. . Utilizamos un ensayo recientemente desarrollado basado
en la tecnología ddPCR , diseñado para cuantificar el ADNccNA del VHB
intrahepático con buena reproducibilidad a un LLoD de 0,8 copias /
10 5 Celdas, sin depender de una curva de calibración; La extracción y los
procedimientos de purificación con fenol / cloroformo / etanol solo
redujeron ligeramente la recuperación del ADN. En comparación con otros
métodos basados en qPCR con un LLoD que varía de 0,005 a 0,0003
copias / célula para la cuantificación de ADNccNA del VHB
intrahepático, [13] , [14], [15] , [16] nuestro método fue de 10 a 100 veces
más sensible y, por lo tanto, particularmente adecuado para la detección
de concentraciones muy bajas de ADN diana; solo 11 de los 27 donantes
positivos en ddPCR, también fueron positivos en qPCR. Anteriormente,
Tang et al. compararon ddPCR con qPCR para la cuantificación del ADN
de HBV total en plasma y Mu et al.describieron un método de ddPCR para
la cuantificación del cccDNA del VHB que estudia HepG2.2.15 muestras
de ADN, que aplicaron para detectar el cccADN del VHB intrahepático en
biopsias de hígado de pacientes
con hepatitis B crónica [17] , [18] , [19] Sin embargo, no se han
presentado datos informó sobre el desempeño de ddPCR en la
cuantificación del ADNccNA del VHB en individuos con marcadores de
exposición previa al VHB pero sin antecedentes de enfermedad hepática.
La prevalencia de OBI en toda la cohorte anti-HBc-positiva fue del 52%,
una cifra consistente con la prevalencia del 62.5% en individuos anti-HBc-
positivos reportados por Raimondo et al. 20 en el único estudio en el que se
evaluó directamente el ADN intrahepático del VHB en biopsias de hígado
de individuos sin enfermedad hepática. En el presente estudio, la especie
de ADNccNA fue detectable en aproximadamente la mitad de los hígados
con ADN del VHB con una mediana de 13 copias / 10 5  células; aunque no
se puede descartar que los hígados negativos para cccADN de VHB
contenían secuencias virales en cantidades inferiores a la sensibilidad
analítica de nuestro ensayo ddPCR, este ensayo parece ser, en la
actualidad, la prueba más precisa para determinar directamente las
secuencias de VHB en muestras de hígado.
Se correlacionó el hallazgo de cccDNA de VHB en el hígado con la
presencia de biomarcadores de VHB en el suero. No se observaron
características virológicas o serológicas distintivas en los seis donantes
con ADN del VHB detectable en suero; es probable que
la viremia límite sea un evento fortuito ocasional, como se informó
anteriormente por Chemin et al. 21 Casi todos los sueros fueron negativos
para el HBcrAg; esto está en desacuerdo con los datos de Suzuki et al. ,
quienes encontraron que 6 de los 13 pacientes con HBsAg-negativo / HBV
cccADN-positivos tenían HBcrAg detectable en suero (3.23 ± 0.27 Log U /
ml), concluyendo la utilidad clínica de este marcador para identificar el
OBI. 22 Sin embargo, nuestros donantes son diferentes de los pacientes de
Suzuki et al.; en nuestros casos, el anti-HBc fue una respuesta
anamnésica a una exposición viral distante sin incidentes, mientras que
los pacientes de Suzuki et al. tenía una hepatitis crónica HBsAg positiva
que posteriormente se convirtió en HBsAg negativa.
Los ensayos convencionales para anticuerpos anti-HBc miden
predominantemente el componente IgG pero también anticuerpos de
otras clases de inmunoglobulina . Para optimizar la medida de este
marcador, utilizamos el ensayo totalmente automatizado CLEIA
Lumipulse® G HBcAb-N, desarrollado específicamente para la detección
de anticuerpos HBc de tipo IgG . En comparación con otros
inmunoensayos quimioluminiscentes para anti-HBc, este ensayo mostró el
mayor rango dinámico lineal, así como la mayor sensibilidad y
especificidad. 23
La mediana del título de IgG anti-HBc fue significativamente mayor en el
grupo OBI-positivo que en el grupo OBI-negativo. Por lo tanto, el título del
anticuerpo puede ser en sí mismo ampliamente predictivo del riesgo de
reactivación OBI en pacientes sometidos a terapia
inmunosupresora . Curiosamente, solo una cuarta parte de los hígados
anti-HBc positivos exhibieron el cccDNA intermedio competente para la
replicación, un hallazgo de acuerdo con la experiencia clínica de que el
VHB recurre en una minoría de los pacientes anti-HBc positivos que se
someten a inmunosupresión. Aunque no se observó una diferencia
significativa en la mediana del título de anticuerpos entre los individuos
OBI positivos con y sin el ADNcc del VHB, en el primero los valores
mínimos de IgG anti-HBc fueron claramente más altos que los valores
mínimos en el último. Al extrapolar en unEl análisis multivariado corregido
para la edad y el sexo, un valor de corte de> 4.4 COI se asoció de forma
independiente con la detección de ADNccVNH intrahepático. Este umbral
descartó la presencia de ADNccNA de VHB medible con un valor predictivo
negativo de 94.6%.
Por lo tanto, un nivel serológico bajo de anticuerpo anti-HBc IgG puede
identificar a los pacientes con un riesgo nulo o mínimo de reactivación con
OBI, mientras que un nivel por encima de un límite de 4.4 COI puede
proporcionar un sustituto numérico imparcial para discriminar a los
pacientes con el mayor riesgo de Reactivación de OBI, ayudando a los
clínicos a definir esquemas individualizados de profilaxis de OBI.
Soporte financiero
Con el apoyo de University of Torino, ID del fondo de investigación #
CIAA_RIC_LOC_15_01.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses que pertenezca
a este trabajo.
Consulte los formularios de divulgación de ICMJE adjuntos para obtener
más detalles.
Contribuciones de los autores
Concepto de estudio y diseño: Gian Paolo Caviglia, Antonina Smedile.
Realizando experimentos: Gian Paolo Caviglia, Maria Lorena Abate .
Análisis e interpretación de datos: Gian Paolo Caviglia, Maria Lorena
Abate, Francesco Tandoi, Alessia Ciancio, Mario Rizzetto, Renato
Romagnoli.
Redacción del manuscrito: Gian Paolo Caviglia, Maria Lorena Abate, Mario
Rizzetto.
Revisión crítica del manuscrito de importante contenido intelectual:
Antonio Amoroso, Mauro Salizzoni, Giorgio Maria Saracco, Renato
Romagnoli, Antonina Smedile.
Análisis estadístico: Gian Paolo Caviglia.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a la Dra. Corinna Orsini (Fujirebio Italia) por el suministro
de reactivos de prueba de IgG HBsAg-HQ, HBcrAg y anti-HBc ya la Dra. Marta
Varotto (Bioclarma srl) por su apoyo técnico en el ensayo ddPCR . Fujirebio Italia
no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación de datos, el análisis
y la interpretación, en la redacción del manuscrito y la decisión de enviar para su
publicación.