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2
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme la vida, por cuidarme y estar conmigo en todo momento
dándome las fuerza para llegar a cumplir mis metas y llegar a concluir esta
etapa de mi vida.
i
ÍNDICE
ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………….…..VI
ÍNDICE DE CUADROS……………………………………………………….VII
ÍNDICE DE GRÁFICOS………………………………………………………VIII
ÍNDICE DE ANEXOS…………………………………………………….…….XI
RESUMEN………………………………………………………………….……X
ABSTRACT……………………………………………………………………..XI
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………….……….…1
1.2. Hipótesis……………………...…………..………......................12
1.3. Objetivos………………………………………….......................13
ii
1.4. Marco teórico…………………………………..….....................14
1.4.1. El cianuro………………………………………………….....14
iii
1.5. Tipo de investigación…………………………………….…….43
1.7. MÉTODO………………………………………………..………44
cianuro……………...……………………………..………..44
de cianuro………………….............................................48
cianuro………………..………………………...................50
III. RESULTADOS………………………………………...................... 53
cianuro……………………………………………………..... 53
iv
3.2. Evaluación de la tolerancia a pH alcalinos…………......... 57
de cianuro………………………………….......................... 58
IV. DISCUSIÓN……………………………………………................... 68
V. CONCLUSIONES……………………………………..................... 75
VI. RECOMENDACIONES……………………………….................... 76
VIII. ANEXOS……………………………………………….................. 96
v
ÍNDICE DE TABLAS
del cianuro……………………….……………………….………… 30
Candarave…………………………………………………………. 53
Micrococcus sp……………………………………..……………… 56
Corynebacterium sp………….…………………………………… 56
vi
ÍNDICE DE CUADROS
Candarave.………..………………………………………... 57
vii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
viii
ÍNDICE DE ANEXOS
ix
RESUMEN
CN‾.
minuto (VVM).
x
ABSTRACT
of cellular metabolism.
Quella S.A. Minera del Norte S.A. Twelve strains were isolated
to 100 mg / L of CN~.
(VVM).
xi
I. INTRODUCCIÓN
ácido cianhídrico, compuesto muy volátil y letal, para todo tipo de seres
1
En este trabajo se hace mención del aislamiento de 12 cepas
2
En la provincia de Candarave existe un población de 3 174
(http://www.minem.gob.pe/_detalle.php?idSector=1&idTitular=5769
&idMenu=sub5768&idCateg=961).
del oro y otros usos industriales. Los residuos que se producen por
3
cianuro pueden llegar a ser peligrosos para el ser humano y
Akcil, A, 2009).
4
encontrar soluciones a problemas ambientales complejos, tales
biorremediación de cianuro.
1.1.1. Antecedentes
5
Según Fernández, Dolghih & Kunz, (2004) usaron la cepa
2004).
6
de recubrimientos metálicos ubicada en el Valle de Aburrá, según
7
porcentaje de remoción de cianuro cercano al 97 %; lo cual significa
http://www.minem.gob.pe/_detalle.php?idSector=1&idTitular=5769&
idMenu=sub5768&idCateg=961).
8
industriales de Magollo, Tacna. La cepa seleccionada se identificó
otros metales.
9
químico como fuente de nutrientes, específicamente de nitrógeno,
J.V.,2012).
10
función de la comunidad microbiana asociada al lugar (Dhal, P. K.,
(Torres- Cázares et al., 2012). Por esta razón, aislar e identificar las
11
cepas nativas presentes, requiere de un amplio estudio de métodos
1.2. HIPÓTESIS
contaminados.
12
1.3. OBJETIVOS
pruebas bioquímicas.
13
1.4. MARCO TEÓRICO
1.4.1. El cianuro
(Álvarez, 2005).
Clasificación Compuesto
14
2. Cianuros
Simples
2.1. fácilmente
NaCN, KCN, Ca(CN)2, Hg(CN)2
solubles
2.2. sales
neutras Zn(CN)2 ,Cd(CN) 2 , Cu(CN), Ni(CN) 2 , Ag(CN)
insolubles
3. Cianuros
complejos Zn(CN)4-2, Cd(CN) 3-1 , Cd(CN) 4-2
débiles
4. Cianuros
complejos
Cu(CN) 2-1 , Cu(CN) 3-2 , Ni(CN) 4-2 , Ag(CN) 2-1
moderadamente
fuertes
5. Cianuros
complejos Fe(CN) 6-4, Co(CN)6-4, Au(CN)2-1, Fe(CN) 6-3
fuertes
Fuente: Smith y Mudder, 1991
Casi todo el cianuro libre está presente como HCN cuando hay
15
Cuando el pH es superior a 10,5, hay pocos iones de hidrógeno
por lo que casi todo el cianuro libre está presente como CN-; en
aproximadamente 9,4.
16
Figura 1. Distribución del HCN y el CN‾ en una solución acuosa
17
aurífero casi siempre contiene otros metales, entre ellos hierro, cobre,
NaCN Na +CN
Ca(CN)2
18
Los cianuros simples son eléctricamente neutros y son idóneos
19
A. Fuentes naturales
2006).
20
En bacterias, la cianogénesis se encuentra limitada a
y la fase estacionaria, lo que indica que este proceso forma parte del
2006).
B. Fuentes antropogénicas
21
por el hombre son el cianuro de hidrógeno gaseoso, el cianuro sólido
1999).
22
Se sabe que la toxicidad del cianuro en altas concentraciones
23
moderadamente fuertes complejos metálicos de cianuro como el [K,
(Watanabe, A., Yano, K., Ikebukuro, K., & Karube, I. 1998), tales
24
papel muy importante en la desintoxicación del cianuro de efluentes
25
contrario ocurre en los sitios de lixiviación de minerales y
26
pequeñas cantidades en un compuesto menos tóxico llamado
1976).
C. J.; Hallock, R. J., & Hill, E.F., 1994). Por lo tanto, el cianuro y sus
1976).
27
1.4.11. Tratamientos biológicos de compuestos cianurados
tratamiento biológico.
28
Es amigable
con el
ambiente.
Fuente: Dash et al., 2008
29
investigaciones sobre degradación microbiana del cianuro y derivados
(Tabla 3).
del cianuro.
30
Cianuro de Burkholderia capita 8,0- Adjei y Ohta,
10 mM 30
Potasio cepa C-3 10,0 2000
Cianuro de Bacillus Castric y
- - -
Potasio megaterium Strobel, 1969
Cianuro de Bacillus pumillus Meyers et al.,
100 mg/L 10,5 30
Potasio C1 1991
Cianuro de Escherichia coli 50, 100, 200
9,2 30
Potasio BCN6 mg/L Figueira et al.,
Cianuro de 1996 Fry y
Stemphylium loti 2 mM 6,5-7,5 25
Potasio Miller, 1972
Fenol, CN, P. fluorescens Kang y Park
25, 26 mM/dm3 - 30
Ni(CN)42- NCIB11764 1997 Nazly et
Cianuro de 7,0; al., 1983
S. loti, G. sorgi 70 mM 28, 35
Potasio 5,0-5,7
Tetra-ciano- Silvos-Avilos
P. putida BCN3 - - 30
nickelato cianuro et al., 1990
Cianuro de Skowronski y
B. pumilis 2,5 M 8,0-9,0 40
Potasio Strobel, 1969
Cianuro de 7,1; 7,9 Shivaraman y
P. acidovorans 31 mg/L 30
Potasio y 9,1 Parhad, 1985
Cianuro de Chen et al.,
K. oxytoca 3 mM 7 30
Potasio 2008
Cianuro de Watanabe et
P. stutzeri AK61 1 mM 7,6 30
Potasio al., 1998
P. Luque-
Cianuro de
pseudoalcaligenes 2 mM 9,5 30 Almagro et al.,
Potasio
CECT5344 2005
Tetra-ciano- Cryptococcus Kwon et al.,
51 mM 7,5 25
nickelato (II) humicolus MCN2 2002
Fuente: Dash et al., 2008
31
requiere necesariamente de una exposición previa para inducir esta
cianuro
4).
(por ej. formamida, ácido fórmico y amoníaco) que luego pueden ser
32
metabólica para biodegradar el cianuro. Estos microorganismos y sus
del cianuro
33
Tabla 4: Categorías generales de las reacciones enzimáticas de
34
Rhodococcus
rhodochrous,
Klebsiella ozaenae,
Arthrobacter sp.,
Nitrilasa
Alcaligenes faecalis,
R-CN + 2H2O → R-COOH + NH3
Acinetobacter sp.,
Fusarium solani, F.
oxysporum, Nocardia
sp.
Thiobacillus
thioparus,
Tiocianato hidrolasa
Pseudomonas
SCN- + 2H2O → COS + NH3 + OH-
stutzeri, Acremonium
strictum.
Reacciones Oxidativas
Cianuro monoxigenasa
Pseudomonas sp.
HCN + O2 + H+ + NAD(P)H → HCONH2 + NAD(P)+ + H2O
Pseudomonas
fluorescens
Cianuro dioxigenasa
NCIMB11764, E. coli
HCN + O2 + H+ + NAD(P)H → CO2 + NH3 + NAD(P)+
BCN6, Bacillus
pumillus.
Cianasa E. coli,
SCN- + 3H2O + 2O2 → CNO- + HS- → HS- + 2O2 → SO4-2 + H+ Pseudomonas
↓ pseudoalcaligenes
CNO- + 3H+ + HNO3- → NH4+ + 2CO2 CECT 5344.
Reacciones Reductivas
Klebsiella oxytoca,
Nitrogenasa Rhodopseudomonas
HCN + H+ + 2e- → CH2=NH + H2O → CH2=O gelatinosa,
↓ Streptomyces
CH2=NH + 2H+ + 2e- → CH3NH + 2H+ + 2e- → CH4 + NH3 thermoautotrophicus,
Herbaspirillum
35
seropedicae,
Azotobacter sp.,
Azospirillum sp.,
Rhodospirillum
rubrum
Reacciones Sustitución/Transferencia
Azotobacter
vinelandii, E. coli,
Pseudomonas
aeruginosa,
Ferrobacillus
Rodanasa (Cianuro sulfurotransferasa)
ferroxidans,
CN- + S2O3-2 → SCN- + SO3-2
Thermobacillus
denitrificans,
Desulfotomaculum
nitrifican, Fusarium
sp.
Mercaptopiruvato sulfurotransferasa Pasos
E. coli, Azotobacter
HSCH2COCOO- + Enzima ↔ CH2COCOO- + HS-Enzima (1)
vinelandii,
HS-Enzima + CN- ↔ Enzima + SCN- (2)
Leishmania major.
Vías de Síntesis
Chromobacterium
violoaceum, Bacillus
β-Cianoalanina sintetasa megaterium,
L-Cisteína (o OAS) + CN- ↔ β-cianoalanina + H2S (o CH3OO-) Enterobacter sp., E.
coli, Pseudomonas
sp.
36
La disponibilidad del oxígeno es un factor importante en la
C. M.; Liu, J. K.; Lou, H. R.; Lin C. S. & Chen S. C.., 2003 ; Cowan, D.;
Cramp, R. A.; Periera R.; Graham, D. Y Almatawah, Q., 1998, Akcil, A., &
bajo condiciones ácidas (pH 4,0) (Barclay, M.; Hart, A.; Knowles, C.J.;
37
Los microorganismos que degradan cianuro pueden emplear una
etc.), como única fuente de nitrógeno (Knowles, 1976; Ebbs, 2004; Adjei &
Oscar J., Montoya C., Muñoz N., 2006). Además algunos microorganismos
sustancias tóxicas.
38
Es necesario conocer la diversidad microbiana como un componente
A pesar de que los terrenos mineros son ambientes creados por el ser
humano, son gobernados por reglas ecológicas, tales como las relaciones
2012). Por esta razón, aislar e identificar las cepas nativas presentes,
aislados, por otro lado, representa una herramienta invaluable para estudiar
39
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Minera.
40
2.3. Operacionalización de variables
TIPO DE
VARIABLE INDICADOR
VARIABLE
Concentración de
Independiente 100 ppm de NaCN
Cianuro de Sodio
Recuento
Crecimiento microscópico en
Microbiano cámara Petroff-
Dependiente Hausser
Cuantificación del
Degradación de
cianuro mediante el
Cianuro
análisis Volumétrico
Supremo N° 002-2013-MINAM.
41
microbiana (presencia de mineral de coloración amarillenta), en
2: Foto 1, 2, 3,4 y 5)
COORDENADAS-
PUNTO DE
WGS84 ZONA DE MUESTREO
MUESTREO
ESTE NORTE
Plantas de
1 358979 8113785
procesamiento
Plantas de
2 358970 8113810
procesamiento
Plantas de
3 358925 8113799
procesamiento
4 359792 8113649 Relave
5 359783 9113638 Relave
6 359764 8113646 Relave
42
Las muestras fueron tomadas a 10 cm de profundidad de
Aplicada
Experimental
43
2.7. MÉTODO
– 26 °C).
degradadoras de cianuro
44
Oren (2006). Se tomó 10 mL de cada matraz en la que
45
9,5. Luego se incubaron a temperatura ambiente (24 °C
46
Bacteriología Sistemática de Bergey - Segunda Edición
(2004).
47
ambiente (24 °C-26 °C) por 4 días. Se empleó la Escala
concentraciones de cianuro
50; 100; 200; 300; 400 y 500 mg/L de CN‾. Los cultivos
48
fueron incubados a temperatura ambiente (24 °C - 26 °C)
49
bacterias/mL. El conteo de bacterias se hizo con ayuda de
Foto 16 y 17)
50
2.7.10. Evaluación del crecimiento microbiano
48; 72; 96; 120; 144; 168; 192; 216; 240 horas (cada 24
a) Camara Petroff-Hausser
51
La técnica se basa en la reacción del nitrato de
reacción:
AgI.
52
III. RESULTADOS
cianuro
Provincia de Candarave
53
pequeñas,
blanquecinas.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,
2 positivo borde entero, elevada,
superficie lisa,
consistencia mucosa,
pequeña, blanquecina.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,
3 positivo borde entero, plana,
superficie lisa,
consistencia cremosa.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,
4 positivo borde entero, elevada,
superficie lisa,
consistencia chiclosa,
blanquecina.
Cepa Bacilos Gram Colonias puntiformes,
5 positivo borde entero, elevada,
superficie lisa,
consistencia chiclosa,
blanquecina.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,borde
6 positivo regular, borde entero,
superficie lisa,
blanquecina.
Cepa Cocos Gram Colonias circular,borde
7 positivo regular,borde entero,
superficie lisa, amarilla
verdosa.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,
8 positivo borde lobulado,
elevada, superficie lisa,
consistencia mucosa,
translucida.
Cepa Bacilos Gram Colonias circular,
9 positivo borde entero, plana,
superficie
lisa,consistencia
mucosa, pequeñas,
blanquecina.
Cepa Bacilos Gram Colonias irregular,
10 negativo borde filamentoso,
plana, superficie lisa,
54
consistencia mucosa,
pequeñas,
blanquecina.
Cepa Cocoba Gram Colonias circular,
11 cilos negativo borde
entero,elevada,superfi
cie lisa,consistencia
mucosa, blanquecina.
Cepa Bacilos Gram Colonias puntiforme,
12 positivo borde entero, elevada,
superficie lisa,
consistencia mucosa,
pequeñas,
blanquecina.
FUENTE : Elaboración propia
muestra en la tabla 7 y 8.
55
Tabla 7. Identificación bioquímica de la cepa bacteriana 7
Candarave - Micrococcus sp
IDENTIFICACIÓN DE Micrococcus sp
COLONIA Amarilla verdosas
GRAM Positivo
FORMA Cocos
MOVILIDAD No
CATALASA Positivo
FERM. MANITOL Negativo
OXIDASA Positivo
UREA Negativo
NITRATO Positivo
VP Positivo
FUENTE : Elaboración propia
Candarave - Corynebacterium sp
IDENTIFICACIÓN DE Corynebacterium sp
COLONIA Blanquecina
GRAM Positivo
FORMA Cocobacilos
MOVILIDAD No
CATALASA Positivo
HIDROLISIS DEL
Positivo
ALMIDON
OXIDASA Negativo
UREA Negativo
NITRATO Positivo
ESPORAS Negativo
FUENTE : Elaboración propia
56
3.2. Evaluación de la tolerancia a pH alcalinos
Candarave.
DIA 3
Cepas bacterianas
Ph 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
9,5 ++ + - + + + + + + ++ + +
10 + + + ++ + + + ++ + ++ + +
10,5 ++ + + - + + + + + ++ + +
11 ++ + - + + + + + + + + +
11,5 ++ + + + + + + + ++ + + +
12 - + + + + + + + ++ + + +
FUENTE: Elaboración propia
57
3.3. Evaluación de la tolerancia a diferentes concentraciones de
cianuro
DIA 1
Cepas bacterianas
CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
25 mg/L - - - - - - - - - - - -
50 mg/L - - - - - - - - - - - -
100 mg/L - - - - - - - - - - - -
200 mg/L - - - - - - - - - - - -
300 mg/L - - - - - - - - - - - -
400 mg/L - - - - - - - - - - - -
500 mg/L - - - - - - - - - - - -
FUENTE: Elaboración propia
de las bacterias.
58
Cuadro 3: Evaluación del segundo día de las cepas aisladas
DIA 2
Cepas bacterianas
CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
25 mg/L + + - + - - - - - - - +
50 mg/L - - - - - - - - - - - -
100 mg/L - - - - - - - - - - - -
200 mg/L - - - - - - - - - - - -
300 mg/L - - - - - - - - - - - -
400 mg/L - - - - - - - - - - - -
500 mg/L - - - - - - - - - - - -
59
Cuadro 4 : Evaluación del tercer día de las cepas aisladas de
DIA 3
Cepas bacterianas
CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
25 mg/L + + + + + - + + - + - +
50 mg/L - - - - - - - - - - - -
100 mg/L - - - - - - - - - - - -
200 mg/L - - - - - - - - - - - -
300 mg/L - - - - - - - - - - - -
400 mg/L - - - - - - - - - - - -
500 mg/L - - - - - - - - - - - -
CN.
60
Cuadro 5: Evaluación del cuarto día de las cepas aisladas de
DIA 4
Cepas bacterianas
CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
25 mg/L + ++ + ++ ++ + ++ ++ + ++ - ++
50 mg/L - - + + + + ++ + - - - ++
100 mg/L - - + + + - ++ - - - - ++
200 mg/L - - - - - - - - - - - -
300 mg/L - - - - - - - - - - - -
400 mg/L - - - - - - - - - - - -
500 mg/L - - - - - - - - - - - -
61
3.4. Cuantificación de la capacidad degradadora de cianuro por Micrococcus sp y Corynebacterium sp
CUADRO 6: Concentración de cianuro degradado y crecimiento microbiano por Micrococcus sp y
62
LEYENDA:
Micrococcus sp Y Corynebacterium sp
en el medio.
63
120
100
CN- LIBRE (ppm)
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TIEMPO (Horas)
64
Micrococcus sp
100 180000000
90 160000000
80 140000000
Bacterias (UFC/ML)
70 120000000
Cc NaCN
60
100000000
50
80000000
40
30 60000000
20 40000000
10 20000000
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dias
Bacterias (UFC/ml) Cc NaCN
evaluación.
65
Corynebacterium sp
Cc NaCN Bacterias (UFC/ml)
120 45000000
40000000
100
35000000
80 30000000
CC NaCN
25000000
60
20000000
40 15000000
10000000
20
5000000
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dias
evaluación
y degradación de cianuro.
66
3.5. Análisis estadístico
67
IV. DISCUSIÓN
cianuro.
estudios por Akcil A., Karahan A.G., Ciftci H., Sagdic O., (2003), en el
68
Cornejo la Torre Melitza (2016) aisló e identificó molecularmente 89
crecimiento de microorganismos.
69
Se lograron aislar 12 cepas bacterianas de muestras de suelo de
contaminantes.
70
asimilación o de incorporar, además del cianuro, otras fuentes de
cianuro.
71
existen muchos estudios en los cuales el tamaño del inóculo utilizado
2003) (Huertas et al. 2010) (Tuya 2014). El mismo que fue empleado en
Según Rosenberg, E., Delong, E. F., Lory, S., Stackebrandt, E., &
72
C. & Agarwal, V. K., 2010), donde ambas son responsables del
(Narancic, T., Djokic, L., Kenny, S. T., O’Connor, K. E., Radulovic, V.,
73
realmente se encontró una cepa bacteriana con capacidad
biodegradadora de cianuro.
2014).
74
V. CONCLUSIÓNES
ppm.
75
VI. RECOMENDACIONES
en el proceso de biodegradación.
76
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA
p. 501–510.
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ANEXOS
MnCl2.4H2O 1,0
FeSO4.7H2O 0,6
CaCl2.H2O 2,6
96
Ajustar previamente con HCl 1N a pH 2,5
mineros
97
Foto 3 : Toma de Muestra Foto 4 : Georeferenciación de Muestra
98
Foto 6 : Aislamiento bacteriano de cepas Foto 7 : Caracterización
99
Foto 10 :Tinción Gram de las Foto 11 : Tinción Gram de las
concentraciones de cianuro
100
Foto 14 : Identificación de pruebas Foto 15 : Prueba de la Oxidasa
Bioquímicas
Cianuro
101
Anexo 3 : Determinación de Cianuro Libre (CN‾) por volumetría
A. Reactivos:
proteger de la luz.
B. Procedimiento:
NaOH 1 M.
102
4. Registrar el volumen de solución utilizado.
C. Interpretación:
D. Cálculos:
problema.
103
104